CC BY
26
УДК 579.25
Сидоров Р.Ю.1, 2, Ткаченко А.Г. 1 2
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г Пермь, Россия 2 Пермский государственный национальный исследовательский университет, г. Пермь, Россия
E-mail: sidorowr@gmail.com
ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА rel ИЗ Mycobacterium smegmatis НА АКТИВНОСТЬ rpoS-lacZ-СЛИЯНИЯ
В Escherichia coli
Гуанозинтетрафосфат (ppGpp) является важной регуляторной молекулой бактерий, вовлеченной в процессы стринджент-ответа, регуляции персистенции, адаптации к стрессу, патогенности. Белок Rel из Mycobacterium smegmatis ответственен за синтез и деградацию ppGpp. Исследование посвящено детекции внутриклеточного уровня гуанозинтетрафосфата при помощи генного слияния ppGpp-зависимого гена rpoS с репортерным lacZ применительно к штамму с экспрессионной плазмидой pMind::rel. Использованный метод оценки позволяет количественно определять низкие концентрации гуанозинтетрафосфата, что трудновыполнимо при использовании методов аналитической химии. На данный момент метод не разработан для микобактерий, поэтому возникает потребность в использовании подходов анализа микобактериальных ppGpp-синтетаз на кишечной палочке. В рамках исследования была сконструирована микобактериальная экспрессионная плазмида pMind с вставкой rel из Mycobacterium smegmatis. Полученная плазмида и исходный вектор были трансформированы в штамм со слиянием rpoS-lacZ. Культуры сравнивались путем измерения активности ß-галактозидазы.
В штамме Escher^ia coli, несущем плазмиду pMind с вставкой rel, было отмечено увеличение экспрессии rpoS по сравнению с контролем c плазмидой без вставки. Добавка индуктора экспрессии pMind тетрациклина не оказывала влияния на экспрессию rpoS.
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о наличии экспрессии с промотора tetA в экспрессионной плазмиде pMind и сохранении ферментативной активности белка Rel из Mycobacterium smegmatis в Escherichia coli. Отсутствие тетрациклиновой индукции может являться следствием неспособности репрессора TetR из pMind связываться с регуляторными участками в Escherichia coli.
Ключевые слова: гуанозинтетрафосфат, персистенция, экспрессионная плазмида pMind.
Продукт гена rel у микобактерий является основным белком, синтезирующим или расщепляющим гуанозинтетрафосфат (ppGpp). ppGpp - регуляторная молекула бактерий, вовлеченная в процессы стринджент-ответа, персистенции, адаптации к различным видам стресса. Способность микобактерий персисти-ровать в человеческом организме - это значительная преграда в борьбе с туберкулезом, ограничивающая применение как лекарственных препаратов, так и вакцин [4].
Микобактериальный белок Rel в значительной степени гомологичен ppGpp-синтетазам Escherichia coli, последовательность аминокислот которых кодируется двумя генами - relA и spoT. Их продукты выполняют схожие функции в кишечной палочке: ответственны за стринджент-ответ, регуляцию персистенции, устойчивость к антибиотикам, вирулентность, выживание в организме хозяина [6].
Возрастание внутриклеточной концентрации ppGpp в условиях стресса повышает избирательность связывания альтернативных субъединиц с
кор-ферментом РНК-полимеразы, в частности о3 или Яро3, ответственной за экспрессию генов адаптации к стационарной фазе, голоданию и многим другим стрессорным воздействиям [2]. Кроме того, гуанозинтетрафосфат индуцирует также транскрипцию о3, которая, таким образом, проявляет зависимость от ррОрр [5].
Это свойство в некоторых случаях используется для оценки внутриклеточного содержания гуанозинтетрафосфата, так как базовый уровень его концентрации с трудом определяется методами аналитической химии. В то время, транскрипция ррОрр-зависимых генов точно характеризует внутриклеточное содержание этой регуляторной молекулы [7].
Для оценки экспрессии можно использовать слияния промотора гена гроБ и последовательности репортерного гена, экспрессия которого, в свою очередь, определяется путем измерения ферментативной активности его белковых продуктов [7].
Поэтому для проверки функциональности экспрессионной шаттл-плазмиды рМ1^ [3],
которая содержит вставку кодирующей последовательности гена rel из Mycobacterium smeg-matis, она была трансформирована в штамм кишечной палочки, несущий трансляционное слияние промотора гена rpoS и последовательности гена lacZ, кодирующего ß-галактозидазу Escherichia coli [9].
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использованы штаммы Escherichia coli и Mycobacterium smegmatis (см. табл. 1).
В целях исследования функций белка Rel M. smegmatis был сконструирован экспрессион-ный шаттл-вектор pMind со вставкой кодирующей последовательности гена rel . Последовательность белка была взята из базы данных BioCyc [11]. На ее основе были сконструированы праймеры rel Msm Nde и rel Msm Pac (см. табл. 2), фланкирующие кодирующий регион гена и несущие сайты для рестриктаз NdeI и PacI (Thermo Scientific).
Далее при помощи этих праймеров и высокоточной ДНК-полимеразы Phusion (Thermo Scientific) была проведена ПЦР на матрице M. smegmatis mc2155 и амплифицирован фрагмент
ДНК (98°С 30''; 98°С 10'' 72°С 90'' 35x; 72°С 5'), который затем был очищен от компонетов ПЦР.
После инкубирования при 72°С в течение 30 минут в присутствии Taq-полимеразы (Thermo Scientific) и 0,2 mM dATP были добавлены адениловые липкие хвосты. Амплифицирован-ный фрагмент ДНК был клонирован в промежуточный вектор pTZ57R при помощи InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo Scientific). Полученная плазмида pTZ57R::relMsm была секвенирована при помощи праймеров, указанных в таблице 2. Замен обнаружено не было.
Плазмиды pMind и pTZ57R::relMsm были выделены из E. coli BMH pMind и BMH pTZ57R::relMsm методом щелочного лизиса [8], специфически расщеплены рестриктазами NdeI и PacI в присутствии буфера O и буфера PacI (Thermo Scientific) соответственно в течение 14 часов при 37°С. Фрагменты линейной ДНК длиной около 6 т. п. о. и 2,4 т. п. о. были выделены при помощи гель-электрофореза (BioRad, 90V, 1 час).
Вектор pMind и вставка relMsm с липкими концами были смешаны в соотношении 1:2 и подвергнуты обработке Т4 ДНК-лигазой (Thermo Scientific) при 4°С в течение ночи.
Таблица 1 - Штаммы и плазмиды, использованные в работе
Штамм Генотип или описание
Eschemhia coli
BMH thi, supE, Д( lac-pro AB), [F', proAB, lacIqZAM15]
BMH pTZ57R::relMsm BMH, но pTZ57R::relMsm
BMH pMind BMH, но pMind
BMH pMind::relMsm BMH, но pMind::relMsm
RO91 F- araD139 Д(argF-lac)U169 deoC1 rpsL150 relA1 flbB5301 ptsF25 rbsR XRZ5 [rpoS742::lacZhybr] AmR
RO91 pMind RO91, но pMind
RO91 pMind::relMsm RO91, но pMind::relMsm
Mycobacterium smegmatis
mc2155 ATCC 607, но ept
Плазмиды
PTZ57R::relMsm Промежуточный вектор с вставкой relMsm; AmR
pMind Экспрессионный микобактериальный шаттл-вектор; KmR, HygR
pMind::relMsm pMind, но PtetAv.rel, г 7 Msm
Влияние экспрессии гена rel из Mycobacterium smegmatis...
Сидоров Р.Ю., Ткаченко А.Г.
2 мкл лигазной смеси были смешаны с клетками E. coli BMH и трансформированы при помощи Eppendorf Eporator согласно протоколу Mainiatis [8]. Спустя 1-2 часа культура высевалась на чашку с антибиотиком, был проведен отбор на устойчивость к канамицину (50 мкг/мл). Полученные штаммы проверены на устойчивость к гигромицину (50 мкг/мл) и к гигромицину с канамицином.
Очищенную плазмиду со вставкой анализировали при помощи гель-электрофореза (120V, 20 минут), рестрикционного анализа по сайтам BamHI а также при помощи ПЦР с праймерами Up pMind и Low pMind (табл. 2), амплифици-рующими участок с сайтом клонирования.
Отсутствие замен нуклеотидов подтверждено при помощи секвенирования ДНК с прай-меров, указанных в таблице 2.
Полученная плазмида, а также плазмида без вставки были использованы для трансформации штамма E. coli RO91, несущего фаг X с трансляционным слиянием rpoS::lacZ. Отбор производили по указанному выше способу, наличие слияния подтверждено ПЦР со специфичными праймерами rpoS Nde и Lowlink (см. табл. 2).
Полученный штамм RO91 pMind::relMsm сравнивали с контрольным RO91 pMind при помощи ß-галактозидазной реакции с ОНФГ по Миллеру [1].
Перед экспериментом штаммы, сохраняемые на скошенном LB-агаре под слоем вазелина при +4оС, высевали на 5 мл питательной среды LB с добавлением соответствующих антибиотиков. После 6 часов культивирования в термо-статируемом шейкере при 37°С клетки перено-
сили на 50 мл богатой среды LB в коническую колбу (250 мл) с добавлением антибиотиков. Культивировали 16 ч в термостатируемом шейкере при 37оС, 120 оборотов/мин. Далее для проведения эксперимента культуру переносили на 50 мл свежей среды, доводя плотность культуры на среде LB до 0D600=0,1. Биомассу клеток оценивали после предварительного разведения культуры физиологическим раствором по оптической плотности при длине волны 600 нм на спектрофотометре.
Культуры для измерения ß-галактозидазной активности отбирали после разведения через 2, 4, 6, 24, 48 и 72 часа и инкубировали при 28 оС в присутствии хромогенного субстрата для ß-галактозидазы. Интенсивность желтой окраски продуктов ß-галактозидазной реакции оценивали на спектрофотометре при длинах волн 420 и 550 нм.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета стандартных программ Statistica 5.0. Эксперимент имеет 4 повторности.
Результаты исследования
и их обсуждение
Нами изучено влияние экспрессии гена rel из Mycobacterium smegmatis в шаттл-векторе pMind на активность трансляционного слияния промотора гена rpoS, кодирующего oS-субъединицу РНК-полимеразы Escherichia coli, и гена lacZ, кодирующего ß-галактозидазу.
Уровень активности слияния в штамме R091 с плазмидой со вставкой гена relMsm сравнивали с активностью слияния в штамме с плаз-
Таблица 2 - Олигонуклеотиды, использованные для ПЦР и секвенирования
Праймер Последовательность нуклеотидов
ПЦР
rel Msm Nde 5'-TCCATATGCTGGGCAGGAGGTGACA-3'
rel Msm Pac 5'-CGCGTTAATTAACCGCTCGATCAGGC-3'
Up pMind 5'-CCGGGCCCCGAGCAACACG-3'
Low pMind 5'-CCGCAGGCTCGCGTAGGAATCATC-3'
rpoS Nde 5'-GCCACCATATGAGTCAGAATACGCTGAAAGTT-3'
Lowlink 5'-ACGCCGAGTTAACGCCATCAAAAA-3'
Секвенирование
Up pMind 5'-CCGGGCCCCGAGCAACACG-3'
Low pMind 5'-CCGCAGGCTCGCGTAGGAATCATC-3'
rel Msm seq 1 5'-GCGATCCTGCACCCCAAGAAGTA-3'
rel Msm seq 2 5'-TCATCAAGCGCTGCAACGGAAGT-3'
мидой без вставки. Результаты исследования показали, что штамм с вставкой имеет более высокий уровень экспрессии rpoS, чем штамм без вставки. Наибольшие различия наблюдались в стационарной фазе культуры (24, 48, 72 час) по сравнению с фазой экспоненциального роста (2, 4, 6 час) (рис. 1).
Исходя из этого, можно сделать вывод о наличии экспрессии с промотора гена tetA плазмиды pMind в Escherichia coli, а также о сохранении ppGpp-синтетазной активности ми-кобактериального белка Rel.
Биомассу культуры оценивали по оптической плотности. Значимых различий между штаммами с плазмидой с вставкой и без вставки не обнаружено (рис. 2).
Дополнительно были проведены эксперименты по измерению активности rpoS в штамме с рМт±:ге1М,т при добавке 10 и 20 ^/т1 тетрациклина, индуктора экспрессии с промотора гена тетрациклиновой устойчивости tetA в сравнении с контролем без добавки. Значимых различий между культурами обнаружено не было, что предположительно является следствием неспособности
Рисунок 1 - Активность трансляционного rpoS-lacZ слияния в зависимости от времени культивирования в штаммах с плазмидой pMind с вставкой rel из Mycobacterium smegmatis и без вставки в Escherichia coli
Рисунок 2 - Изменение оптической плотности культуры Я091 рМт<! в зависимости
от времени культивирования
Сидоров Р.Ю., Ткаченко А.Г.
Влияние экспрессии гена rel из Mycobacterium smegmatis..
репрессора TetR из pMind связываться с регуля-торными участками в Escherichia coli.
Способность белка Rel из Mycobacterium smegmatis проявлять ферментативную актив-
ность в Escherichia coli может быть связана с высокой степенью гомологии бактериальных ppGpp-синтетаз [10].
05.10.2017
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края в рамках научного проекта «р_а 16-44-590279», программы УрО РАН проект №15-4-4-1 и гранта РФФИ №16-35-00095 мол_а
Список литературы:
1. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: пер. с англ. Зографа Ю.Н., Ильиной Т.С., Никифорова В.Г. под. ред. Алиханяна С.И. - М.: Мир, 1976. - 436 с.
2. Ткаченко, А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов. - Екатеринбург: УрО РАН, 2012. - 107 с.
3. Tetracycline-inducible gene regulation in mycobacteria / M.C. Blokpoel [et al] // Nucleic Acids Res. - 2005. doi: 10.1093/nar/ gni023
4. The relA Homolog of Mycobacterium smegmatis Affects Cell Appearance, Viability, and Gene Expression / J. Dahl [и др.] // J. of Bacteriol. - 2005. - Vol.187. - No7. - P. 2439-2447.
5. Transcripion profiling of the stringent response in Escherichia coli / T. Durfee [и др.] // J. Bacteriol. - 2007. - P.1084-1096.
6. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology / V.Hauryliuk [et al] // Nature Reviews Microbiology. -2015. - P. 1-12. doi:10.1038/nrmicro3448
7. Maisonneuve, E. (p)ppGpp Controls Bacterial Persistence by Stochastic Induction of Toxin-Antitoxin Activity / E. Maisonneuve, M. Castro-Camargo, K.M. Gerdes // Cell. - 2013. - Vol. 154. - P.1140-1150.
8. Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / T. Maniatis, M.R. Green, J.Sambrook // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - Изд. 4-е. - P.32-34, 84-87, 119-122.
9. Simons, R.W. Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions / R.W. Simons, F. Houman, N. Kleckner // Gene. - 1987. - Vol. 53. - No 1. - P.85-96.
10. Weiss, L.A. Essential Roles for Mycobacterium tuberculosis Rel beyond the Production of (p)ppGpp / L.A. Weiss, C.L. Stallings // J. of Bacteriol. - 2013. - Vol.195. - No. 24. - P.5629-5638.
11. BioCyc: Pathway/Genome Database Collection [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://biocyc.org, свободный.
Сведения об авторах:
Сидоров Роман Юрьевич, лаборант-исследователь лаборатории адаптации микроорганизмов института Экологии и Генетики Микроорганизмов УрО РАН, студент 2 курса магистратуры кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета 614081 г Пермь, ул. Голева, 13, тел.: (342) 212-21-59, 614990 г Пермь, ул. Букирева, 15, тел.: (342) 2-396-501; e-mail: sidorowr@gmail.com
Ткаченко Александр Георгиевич, заведующий лабораторией адаптации микроорганизмов института Экологии и Генетики Микроорганизмов УрО РАН, профессор кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета, доктор медицинских наук, профессор 614081 г Пермь, ул. Голева, 13, тел.: (342) 212-21-59, 614990 г. Пермь, ул. Букирева, 15, тел.: (342) 2-396-501; e-mail: agtkachenko@iegm.ru
