CC BY
136
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ « Санитария «
УДК 619: 614.48: 637.5
Влияние дезинфицирующих средств на генетический материал патогенов, специфичных для мясоперерабатывающей промышленности
В.Н. Афонюшкин12, кандидат биологических наук ([email protected]), К.А. Табанюхов1,4, старший лаборант сектора молекулярной биологии, В.С. Черепушкина1, лаборант-исследователь сектора молекулярной биологии, Ю.С. Хоменко1, младший научный сотрудник, О.П. Татарчук3, руководитель отдела ветеринарных препаратов ([email protected])
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» (630501, НСО, п. Краснообск).
2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» (630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, д. 8).
3 ООО «КРКА ФАРМА» (125212, г. Москва, Головинское шоссе, д. 5, кор. 1).
4 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный аграрный университет» (630039, г. Новосибирск, ул. Никитина, д. 155).
Изучены изменения в генетическом материале патогенов, возникающие под действием дезинфицирующих средств различных химических классов. Методами молекулярной биологии и генной инженерии установлено, что дезинфицирующее средство Экоцид разрушает как изолированный генетический материал бактерий, так и находящиеся в составе бактериальных клеток хромосомную и плазмидную ДНК. Разрушение генетического материала при дезинфекции оборудования мясоперерабатывающих предприятий необходимо для предотвращения горизонтального переноса нежелательной генетической информации, например генов антибиотикоустойчивости или токсинообразования.
Ключевые слова: персульфат калия, глутаральдегид, ЧАС, перекись водорода, дезинфекция, мясопереработка, ан-тибиотикорезистентность, ДНК
Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ПЦР — полимеразная цепная реакция, УФ — ультрафиолетовый, ЧАС — четвертичные аммониевые соединения
Введение
Общепринято, что биологическая безопасность пищевой продукции зависит в том числе от степени удаления загрязнений и бактериальных контаминантов с поверхностей технологического оборудования. Тем не менее, с развитием знаний о механизмах обмена генетической информацией у бактерий стало очевидно, что биологическая безопасность продукции пищевой промышленности может быть нарушена в результате горизонтальной передачи нежелательной генетической информации — генов антибиотикоустойчивости, эндо- и экзотоксинообразо-вания и т. д. [7]. Схема путей горизонтального переноса генетической информации в продуктах питания представлена на рисунке 1, и в общем случае горизонтальный перенос генетической информации осуществляется двумя способами:
✓ трансдукцией, при которой участки ДНК встраиваются в геном бактериофагов и оттуда — в геном бактерий;
✓ трансформацией, при которой генетический материал из окружающей среды поглощается бактериальной клеткой, находящейся в особом состоянии, называемом компетентностью.
Именно трансформация бактерий особенно актуальна для мясной промышленности, так как сложный состав биологической матрицы благодаря содержанию жиров способен защитить ДНК от разрушения. Кроме этого, специфические для мясопереработки условия окружающей среды—низкая температура, гипертоническая среда, высокие концентрации
Food producl
Рис. 1. Пути горизонтального переноса генетической информации в пищевых продуктах [7]: food product — пищевой продукт, bacterium — бактерия, pathogenic, commensal, starter culture, probiotic, bioconserving — патогенные, ком-менсальные, стартовые культуры, пробиотические, биоконсервантные, bacteriophage — бактериофаг, contamination — контаминация, deliberately added — внесенные специально, postcontamination — постконтаминация, viable — жизнеспособные, stressed — стрессированные, inactivated — инактивированные, conjugation — конъюгация, release — высвобождение, transduction — трансдукция, transformation — трансформация, naked DNA — внеклеточная ДНК Img. 1. Overview of horizontal gene transfer in food products
солей, стрессовые воздействия и т. д., — могут привести к возникновению компетентных клеток бактерий, способных к поглощению и использованию экзогенной ДНК [2, 6].
Кроме антибиотикоустойчивости и токсинообразования, трансформация может приводить к приобретению других ранее отсутствовавших у бактерий признаков—например, способности сальмонелл ферментировать лактозу Известно, что подавляющее большинство сальмонелл лишены способности ферментировать лактозу, так как у них отсутствует лактозный оперон — группа генов, управляющих процессом поглощения и усвоения лактозы [3]. На этом феномене основана дифференциация сальмонел от дру-
В.Н. Афонюшкин, К.А. Табанюхов, В.С. Черепушкина, Ю.С. Хоменко, О.П. Татарчук
гих энтеробактерий по культуральным признакам: так, на среде МакКонки сальмонеллы образуют бесцветные колонии, а микроорганизмы, которые являются лактозопо-зитивными — например, кишечные палочки, — окрашенные. Современные исследования подтверждают, что сальмонеллы способны получить генетическую информацию с лактозным опероном из окружающей среды, и тем самым приобрести способность ферментировать лактозу [5]. Такие лактозопозитивные сальмонеллы на среде МакКонки образуют окрашенные колонии, что может стать причиной ложноотрицательных результатов обнаружения сальмонелл. Следует отметить, что случаи сальмонеллеза у человека, вызванные лактозоположительными сальмонеллами, несут гораздо больший эпидемиологический риск, так как способны долго оставаться нераспознанными [4].
Учитывая этот факт, на предприятиях мясной промышленности целесообразно использовать дезинфицирующие средства, не только уменьшающие микробную обсемененность обрабатываемых поверхностей, но и снижающие вероятность горизонтального переноса нежелательной генетической информации.
Цель исследования
На основании данных о физико-химических и биологических свойствах дезинфицирующих средств, наиболее часто используемых на агропромышленных предприятиях и в мясной промышленности, возникло предположение, что подавляющее большинство дезсредств не оказывает существенного воздействия на генетическую информацию и не препятствует горизонтальному переносу генов. Целью исследования стали экспериментальная проверка этой гипотезы, а также поиск перспективных дезинфицирующих средств, позволяющих предотвратить горизонтальный перенос нежелательной генетической информации при дезинфекции производственного оборудования на предприятиях мясной промышленности путем разрушения или инактивации ДНК, остающейся на поверхностях после санитарной обработки традиционными моющими и дезинфицирующими средствами.
Материалы и методы
В исследовании широко применяли количественную ПЦР в реальном времени, которая является достаточно удобной системой для оценки эффективности дезсредств в отношении генетического материала и позволяет изучить механизм такого действия. Степень разрушения изолированной геномной ДНК Cl. perfringens под действием исследуемых дезсредств оценивали по сдвигу порогового цикла C(t), значение которого увеличивается при снижении количества ДНК, пригодной для ПЦР-амплификации.
Для оценки воздействия дезсредств на плазмидную ДНК использовали методы генетической инженерии, а именно трансформацию плазмидой pBluescript компетентных клеток E. coli. Интенсивность разрушения плазмид-ной ДНК исследуемыми дезсредствами определяли по количеству окрашенных колоний E.coli XL Blue после трансформации бактерий.
Результаты и обсуждение
В результате эксперимента установлено, что наибольшей активностью в отношении изолированной ДНК бактерий обладал Экоцид, вызывавший сдвиг порогового цикла C(t) на 2,75 — наилучший результат среди исследованных дезсредств (табл. 1).
1. Степень разрушения ДНК Cl. perfringens по сдвигу порогового цикла C(t) 1. Destruction of Cl. perfringens DNA upon C(t) shift in qPCR
Наименование образца C(t)
ДНК после обработки дезинфектантом Экоцид 33,24
ДНК после обработки дезинфектантом на основе ЧАС и глутаральдегида 32,86
ДНК после обработки дезинфектантом на основе надуксуной кислоты 33,19
Интактная ДНК 01. рег^пдепз 30,49
Для уточнения способности дезсредства Экоцид повреждать молекулы ДНК, находящиеся в составе бактериальных клеток, дезинфицирующим средством были обработаны как образцы изолированной ДНК Salmonella enterica, так и суспензия жизнеспособных бактериальных клеток, взятых в той же концентрации, которую использовали для выделения ДНК (рис. 2).
ЛтрШаКол
Рис. 2. Кривые амплификации интактного (1) и обработанного Экоцидом генетического материала Salmonella enterica, находившегося в составе бактериальных клеток (2), и изолированного генетического материала Salmonella enterica (3): amplification — амплификация, cycles — количество циклов, RFU — относительные единицы флуоресценции Img. 2. gPCR amplification curves of intact (1) and treated with Ecocid genetic material of Salmonella enterica, either contained within bacterial cells (2) and naked (3)
2. Степень разрушения генетического материала Salmonella enterica 2. Destruction of Salmonella enterica DNA
Наименование образца C(t)
Изолированная ДНК сальмонелл, обработанная Экоцидом > 40
ДНК из клеток сальмонелл, обработанных Экоцидом 32,61 ± 0,81
Интактная ДНК сальмонелл 26,97 ± 0,42
ДНК из интактной культуры сальмонелл 26,14 ± 0,36
Отрицательный контроль > 40
Как свидетельствуют результаты ПЦР, после обработки дезсредством Экоцид образцы изолированной ДНК Salmonella enterica оказались полностью разрушены (группа кривых 3 на графике). Практически полной была степень инактивации генетического материала, находившегося в составе клеток обработанных Экоцидом сальмонелл (табл. 2).
Полученные данные о концентрациях ДНК Salmonella enterica после обработки живых бактерий дезсредством Экоцид свидетельствуют о статистически достоверном (р=0,0096) уменьшении количества пригодной к амплификации ДНК более чем 280 раз. Таким образом, действие дезсредства Экоцид на культуру сальмонелл сопровождалось не только гибелью бактерий, но и разрушением ДНК.
Так как система репарации ДНК в живых сальмонеллах оставалась активной, степень разрушения генетического материала, находившегося в составе бактериальных клеток, была меньше, чем при воздействии дезс-редства Экоцид на изолированную ДНК. Очевидно, что после обработки дезсредством Экоцид живых клеток бактерий вероятность сохранения неповрежденной хромосомной ДНК стремится к нулю.
Влияние дезинфицирующих средств на генетический материал патогенов, специфичных для мясоперерабатывающей промышленности
Помимо хромосомной ДНК, у бактерий имеются вне-хромосомные носители генетической информации — плазмиды. Они представляют собой короткие двухце-почечные, чаще кольцевые, молекулы ДНК, и обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам — например, к антибиотикам, уФ-излучению, некоторым дезинфицирующим средствам, а также гены токсинообразова-ния и других детерминант вирулентности. Плазмиды являются мобильными генетическими элементами, они реплицируются автономно и независимо от хромосомной ДНК, и бактериальная клетка может содержать до нескольких сотен копий плазмиды. Бактерии могут обмениваться плазмидами при конъюгации, либо, приобретая компетентность, способны поглощать плаз-миды непосредственно из окружающей среды. Будучи кольцевой молекулой ДНК, плазмиды отличаются высокой устойчивостью во внешней среде, поэтому именно с плазмидами связан наибольший риск передачи нежелательной генетической информации.
Плазмида рВЫеэспр! содержит ген устойчивости к ампициллину и ген Р-галактозидазы, входящей в состав лак-тозного оперона, поэтому колонии трансформированных бактерий на среде с ампициллином в присутствии хро-могенного субстрата приобретают синюю окраску (рис. 3). Интенсивность разрушения плазмидной ДНК исследуемыми дезсредствами приведена в таблице 3.
Как видно из таблицы, исследованные дезсредства в различной степени разрушают плазмиду рВ1шспр1 с геном устойчивости к ампициллину, тем самым в различной степени препятствуя росту трансформированных бактерий на среде с этим антибиотиком. Дезсредство на основе глутарового альдегида и ЧАС проявило крайне малую эффективность в отношении плазмидной ДНК: в образце было отмечено большое количество колоний трансформированных бактерий. После обработки дезсредством на основе надуксусной кислоты наблюдались единичные колонии трансформированных бактерий. Вероятней всего, недостаточная эффективность дезсредства на основе надуксусной кислоты связана со спецификой действия каталаз — ферментов, защищающих бактериальные клетки от перекисных соединений. Каталазы менее приспо-
Рис. 3. Колонии E.coli XL Blue после трансформации плазмидой pBluescript Img. 3. Colonies of E.coli XL Blue after transformation with pBluescript plasmid
соблены к инактивации неорганических перекисей, таких как персульфат калия, входящий в состав дезсредства Экоцид. В образцах, обработанных дезсредством Экоцид, не было выявлено ни одной колонии трансформированных бактерий, и таким образом, дезсредство Экоцид продемонстрировало 100%-ю эффективность в уничтожении плазмидной ДНК бактерий.
Заключение
К сожалению, критерии воздействия дезсредств на генетический материал бактериальных или вирусных патогенов, специфичных для мясной промышленности, до настоящего времени законодательно не регламентируются. Тем не менее, для обеспечения высокого уровня биологической безопасности продукции мясопере-работки при дезинфекции производственного оборудования на предприятиях мясной промышленности целесообразно использование дезинфицирующих средств, позволяющих предотвратить горизонтальный перенос нежелательной генетической информации.
Библиография
1. Афонюшкин, В.Н. Современные методы контроля сальмонеллеза / В.Н. Афонюшкин, Е.В. Дударева, Л.И. Малахеева, О.В. Фролова, О.В. Шкред, М.Л. Филиппенко // Птицеводство. — 2008. — №9. — С. 43-44.
2. Bauer, T. Effect of food components and processing parameters on DNA degradation in food / T. Bauer, W.P. Hammes, N.U. Haase, C. Hertel // Environ. Biosaf. Res. —2004. — No. 3. — P. 215-223.
3. Fookes, M. Salmonella bongori provides insights into the evolution of the Salmonellae. / M. Fookes, G.N. Schroeder, G.C. Langridge, C.J. Blondel, C. Mammina, T.R. Connor, et al. // PLoS Pathog.— 2011. — No. 7(8). — e1002191.
4. Latif, M. Lactose fermenting Salmonella Paratyphi A: A case report / M. Latif, M. Gilani, J. Usman, T. Munir, M. Mushtaq, N. Babar // J Microbiol Infect Dis. — 2014. — No. 4(1). — P. 30-32.
5. Leonard, S.R. Acquisition of the lac operon by Salmonella enterica. / S.R. Leonard, D.W. Lacher, K.A. Lampel // BMC Microbiology. — 2015. — No. 15. — P. 173.
6. Straub, J.A. A 23S rDNA-targeted polymerase chain reaction-based system for detection of Staphylococcus aureus in meat starter cultures and dairy products. / J.A. Straub, C. Hertel, W.P. Hammes // J. Food Protect. — 1999. — No. 62. — P. 1150-1156.
7. Verraes, C. Antimicrobial Resistance in the Food Chain: A Review. / C. Verraes S. Van Boxstael, E. Van Meervenne, E. Van Coillie, P. Butaye, B. Catry, M.-A de Schaetzen, X. Van Huffel, H. Imberechts, K. Dierick, G. Daube, C. Saegerman, J. De Block, J. Dewulf, L. Herman Int. J. Environ. Res. Public Health. — 2013. — No. 10. — P. 2643-2669.
References
1. Afonjushkin V.N., Dudareva E.V., Malaheeva L.I., Frolova O.V., Shkred O.V., Filippenko M.L. Pticevodstvo, 2008, №9, P. 43-44.
2. Bauer T., Hammes W.P., Haase N.U., Hertel C. Effect of food components and processing parameters on DNA degradation in food. Environ. Biosaf. Res. 2004, 3, P. 215-223.
3. Fookes M., Schroeder G.N., Langridge G.C., Blondel C.J., Mammina C., Connor T.R., et al. Salmonella bongori provides insights into the evolution of the Salmonellae. PLoS Pathog., 2011, No 7(8), e1002191.
4. Latif M., Gilani M., Usman J., Munir T., Mushtaq M., Babar N.. Lactose fermenting Salmonella Paratyphi A: A case report. J Microbiol Infect Dis., 2014, No. 4(1), P. 30-32.
5. Leonard S.R., Lacher D.W., Lampel KA. Acquisition of the lac operon by Salmonella enterica. BMC Microbiology, 2015, No. 15, P. 173.
6. Straub JA., Hertel C., Hammes W.P. A 23S rDNA-targeted polymerase chain reaction-based system for detection of Staphylococcus aureus in meat starter cultures and dairy products. J. Food Protect., 1999, No. 62, P. 1150-1156.
7. Verraes C., Van Boxstael S., Van Meervenne E., Van Coillie E., Butaye P., Catry B., de Schaetzen M.-A., Van Huffel X., Imberechts H., Dierick K., Daube G., Saegerman C., De Block J., Dewulf J., Herman L. Antimicrobial Resistance in the Food Chain: A Review. Int. J. Environ. Res. Public Health, 2013, 10, P. 2643-2669.
3. Влияние дезсредств на пригодность ДНК плазмиды pBluescript к трансформации компетентных клеток бактерий E.coli XL Blue 3. Impact of biocides on suitability of pBluescript plasmid DNA to competent bacterial cells transformation
Исследуемые дезсредства Количество колоний трансформированных бактерий после обработки дезсредствами изолированной плазмидной ДНК Степень уменьшения количества трансформированных бактерий, %
Экоцид 0 100
Надуксусная кислота 2 99,994
ЧАС + глутаральдегид 165 57,39
Без дезсредств (контроль) 387 0
ABSTRACT
V.N. Afonyushkin1'2, K.A. Tabaniukhov1,4, V.S. Cherepushkina1, Yu.S. Khomenko1, O.P. Tatarchuk3
11nstitute of Experimentally Veterinary Medicine of Siberia and Far East (630501, Novosibirsk region, settl. Krasnoobsc).
2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (ICBFM SB RAS) (630090, Novosibirsk, Ac. Lavrentiev av., 8).
3 KRKA FARMA LLC (125212, Moscow, Golovinsky highway, 5-1).
4 The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov (117997, Moscow, Ostrovityanova street, 1)
5 Novosibirsk State Agrarian University (630039, Novosibirsk, Nikitin str, 155).
Impact of Biocides on Genetic Material of Pathogens, Specific for Meat Processing Industry. The changes in genetic material of different pathogens under the action of several biocidal products have been investigated. It was confirmed by PCR and genetic engineering that biocidal product Ecocid was able to remove chromosomal and plasmid bacterial DNA, either isolated or contained within the bacterial cells. Using a disinfectant that destroys DNA on the surfaces of meat production equipment is a promsing measure to prevent horizontal transfer of unwanted genetic material, such as bacterial genes associated with the resistance to antibiotics, or genes of toxin production. Keywords: Potassium persulfate, glutaraldehyde, QAC, hydrogen peroxide, disinfection, meat processing, antimicrobial resistance, DNA.
