CC BY
12
© Коллектив авторов, 2024
Новикова Е.М., Чухина Е.С., Разваляева Н.А., Козырева О.В., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н.
Влияние детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль-ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. В последние десятилетия ведутся активные исследования целесообразности включения в комплексную терапию злокачественной меланомы методов имму-нокоррекции на основе препаратов, стимулирующих реакции врожденного иммунного ответа, в частности лигандов (агонистов) толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors, TLRs). Агонисты TLRs рассматриваются в качестве перспективных лекарственных средств благодаря их способности стимулировать противоопухолевый иммунный ответ. TLRs представлены и на клетках иммунной системы, и на малигнизированных мела-ноцитах, поэтому влияние препаратов на основе агонистов TLRs на прогрессирование злокачественной меланомы может зависеть от их действия на клетки как опухоли, так и иммунной системы.
Цель исследования - изучение воздействия детоксифицированного липополисахарида (Ас3-8-ЛПС) Shigella sonnei, фаза I на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль-ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I в системе in vitro и на инфильтрацию первичных опухолевых узлов СБ8+-Т-лимфоцитами после его введения in vivo.
Материал и методы. Для изучения влияния Ас3-8-ЛПС на клетки линии меланомы В16 использовали две экспериментальные модели: перевиваемую культуру клеток меланомы В16 (предоставлена лабораторией клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России) и первичные опухолевые узлы (ПОУ), полученные после инокуляции клеток меланомы экспериментальным животным. При оценке влияния Ас3-8-ЛПС на клетки меланомы в культуре меланоциты культивировали с препаратом в течение 48 ч. Для изучения действия Ас3-8-ЛПС на субпопуляции клеток в ПОУ препарат вводили в область образовавшихся узлов.
Экспрессию антигенов TLR4 и gp100 на клетках меланомы, выращенных на покровных стеклах, определяли с помощью меченных флуорохромами поликлональных антител (Ат) с последующим анализом препаратов под флуоресцентным микроскопом.
Экспрессию CD8a, CD45, MHC I, CD F4/80 определяли с помощью моноклональных Ат, меченных флуорохромами, в клеточных суспензиях, полученных после культивирования клеток in vitro, и в клеточных суспензиях ПОУ с последующим анализом полученных суспензий с помощью проточного цитометра.
Для оценки влияния Ас3-8-ЛПС на пролиферацию опухолевых клеток в культуре использовали тест с красителем VPD450.
Результаты. Показано, что клетки меланомы линии В16 экспрессируют TLR4. Наличие данного рецептора на поверхности малигнизированных меланоцитов позволяет предположить, что эффекты, которые были отмечены при культивировании клеток с липополисахаридом Ас3-8-ЛПС, обусловлены его взаимодействием с TLR4, так как установлено, что липополисахариды грам-отрицательных микроорганизмов, к которым относится Shigella sonnei, являются лигандами этого рецептора. Культивирование клеток меланомы с Ас3-8-ЛПС приводит к изменению характера экспрессии gp100 и MHC I. Уровень экспрессии gp100 снижается, в то время как количество клеток, несущих MHC I, увеличивается. Снижается пролиферативная активность опухолевых клеток. При вве-
Для корреспонденции
Степаненко Родион Николаевич -доктор медицинских наук, заведующий лабораторией экспериментальной технологии иммунопрепаратов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7577-8613
дении Лс3-8-ЛПС непосредственно в область ПОУ в опухолевом узле увеличивается относительное количество опухолевых клеток, экспрессирующих MHC I, и Т-лимфо-цитов, несущих CD8a.
Заключение. На экспериментальных моделях in vitro и in vivo изучено влияние детоксифицированного липополисахарида (Ас3-8-ЛПС) Shigella sonnei, фаза I на клетки злокачественной меланомы В16. Установлено, что Лс3-8-ЛПС снижает экспрессию на опухолевых клетках меланома-ассоциированного антигена gp100 и увеличивает экспрессию MHC I, что сопровождается увеличением в ПОУ количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD8а.
Ключевые слова: меланома В16; малигнизированные клетки; детоксифицированный липополисахарид; TLR4; gp100; MHC I; VPD450-тест
Статья получена 18.10.2023. Принята в печать 05.12.2023.
Для цитирования: Новикова Е.М., Чухина Е.С., Разваляева Н.А., Козырева О.В., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н. Влияние детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль-ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I. Иммунология. 2024; 45 (1): 68-81. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-68-81
Финансирование. Исследование выполнено в рамках Госзадания по соглашению ФМБА России с ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России № 388-03-2023-041 от 19.01.2023. Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Степаненко Р.Н.; сбор и обработка материала - Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н.А., Чухина Е.С., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н.; статистическая обработка - Козырева О.В., Чухина Е.С., Степаненко Р.Н.; написание текста - Новикова Е.М., Козырева О.В., Степаненко Р.Н.; редактирование - Чухина Е.С., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степа-ненко Р.Н.
Novikova E.M., Chukhina E.S., Razvalyayeva N.A., Kozyreva O.V., Golovina M.E., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N.
Effect of detoxified Shigella sonnei lipopolysaccharide on the expression of tumor-associated antigen gp100 and MHC I antigens by B16 melanoma cells
National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. In recent decades, active researches have been conducted on the suitability immunotherapeutic agents based on drugs that stimulate the innate immune response, in particular TLRs ligands (agonists) (Toll-like receptors, TLRs), in complex therapy for malignant melanoma. TLR agonists are considered as promising drugs due to their ability to stimulate the antitumor immune response. It has been established that TLRs are present both on cells of the immune system and on malignant melanocytes, therefore the effect of drugs based on TLRs agonists on the progression of malignant melanoma will depend on both the effect on tumor cells and on cells of the immune system.
Aims of the study - to investigate the effect of detoxified lipopolysaccharide (Ac3-S-LPS) of Shigella sonnei, phase I, on the expression of tumor-associated gp100 antigen and MHC I antigens by B16 melanoma cells in vitro and on the infiltration of primary tumor nodes by CD8+-T lymphocytes after administration of Ac3-S-LPS in vivo.
Material and methods. To study the effect of Ac3-S-LPS on B16 melanoma cells, we used two experimental models: B16 melanoma cell culture (provided by the Cellular Immunity Laboratory, Research Institute of Experimental Diagnostics and Tumor Therapy, N.N. Blokhin NMRCO, MOH of Russia) and primary tumor nodes (PTN), obtained after inoculation of melanoma cells into experimental animals. When assessing the effect of Ac3-S-LPS on melanoma cells in culture, melanocytes were cultured with the drug for 48 hours. To study the effect of Ac3-S-LPS on subpopulations of cells in the PTN, the drug was injected into the area of the formed nodes.
For correspondence
Rodion N. Stepanenko -MD, PhD,
Head of Experimental Technologies of Immunopreparations Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7577-8613
The expression of TLR4 and gp100 antigens (AGs) was determined using fluorochrome-labeled polyclonal antibody (Abs) to melanoma cells grown on coverslips, followed by analysis of the preparations with a fluorescence microscope.
The expression of the AGs CD8a, CD45, MHC I, CD F4/80 was determined using monoclonal Abs labeled with fluorochromes in cell suspensions obtained after culturing cells in vitro and in cell suspensions of PTN, and subsequent analysis of the resulting suspensions with a flow cytometer.
To assess the effect of Ac3-S-LPS on the proliferation of tumor cells in culture, a test with the VPD450 dye was used.
Results. B16 melanoma cells have been shown to express TLR4. The presence of this receptor on the surface of malignant melanocytes suggests that the effects that were noted when culturing cells with Ac3-S-LPS are due to its interaction with this receptor, since it has been established that lipopolysaccharides of gram-negative microorganisms (including Shigella sonnei cells) are ligands of this receptor. Cultivation of melanoma cells with Ac3-S-LPS leads to a change in the pattern of expression of surface AGs - gp100 and MHC I. The level of gp100 expression decreases, while the number of cells bearing MHC I increases. The proliferative activity of tumor cells decreases. When Ac3-S-LPS is administered directly into the area of PTN, in the tumor node the relative amount of tumor cells expressing MHC I and T lymphocytes carrying the CD8a antigen increases.
Conclusion. The effect of detoxified lipopolysaccharide (Ac3-S-LPS) of Shigella sonnei, phase I on B16 malignant melanoma cells was studied using experimental models in vitro and in vivo. It was found that the use of Ac3-S-LPS reduces the expression of melanoma-associated antigen gp100 on tumor cells and increases the expression of MHC I antigens, which is accompanied by increase the amount of T lymphocytes expressing the antigen CD8a in PTN.
Keywords: B16 melanoma; malignant cells; detoxified lipopolysaccharide; TLR4; gp100; MHC I; VPD450 test
Received 18.10.2023. Accepted 05.12.2023.
For citation: Novikova E.M., Chukhina E.S., Razvalyayeva N.A., Kozyreva O.V., Golovina M.E., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N. Effect of detoxified Shigella sonnei lipopolysaccharide on the expression of tumor-associated antigen gp100 and MHC I antigens by B16 melanoma cells. Immunologiya. 2024; 45 (1): 68-81. DOI: https://doi. org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-68-81 (in Russian)
Funding. Study was performed within a state task under the agreement between FMBA of Russia and NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, No 388-03-2023-041 of 19.01.2023. Open publication of the research results is allowed.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Study conception and design - Stepanenko R.N.; material collection and processing -Novikova E.M., Kozyreva O.V., Razvalyaeva N.A., Chukhina E.S., Golovina M.E., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N.; statistical processing - Kozyreva O.V., Chukhina E.S., Stepanenko R.N.; article writing - Noviko-va E.M., Kozyreva O.V., Stepanenko R.N.; article editing - Chukhina E.S., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N.
Введение
В последние десятилетия ведутся активные исследования целесообразности включения в комплексную терапию злокачественной меланомы методов имму-нокоррекции на основе препаратов, стимулирующих реакции врожденного иммунного ответа, в частности лигандов (агонистов) толл-подобных рецепторов (Tolllike receptors, TLRs). [1]. Агонисты TLRs рассматриваются как перспективные лекарственные средства благодаря своей способности стимулировать противоопухолевый иммунный ответ и проапоптотическому действию на опухолевые клетки [2]. Взаимодействие клеток иммунной системы с лигандами TLRs бактериального происхождения индуцирует продукцию цитокинов клеточного иммунитета и Т-регуляторной супрессии (ИЛ-6 и ИЛ-12), что приводит к переключению иммунного ответа в направлении Thl-дифференцировки, к акти-
вации ответа ИФН I типа, который существенен для дифференцировки дендритных клеток, перекрестной презентации антигенов (Аг) и пролиферации НК-и Т-клеток памяти [3].
Экспрессия TLRs не ограничивается клетками иммунной системы. Они обнаружены на многих других типах клеток, в том числе на нормальных и малигнизи-рованных меланоцитах. В частности, на них были идентифицированы TLR2-5, TLR7, TLR9 и TLR10 [4, 5].
Наличие TLRs на меланоцитах позволяет рассматривать их как клетки иммунной системы кожи [6]. При этом при малигнизации меланоциты сохраняют на своей поверхности TLRs и после активации соответствующими лигандами начинают активно продуцировать цитокины и хемокины. После взаимодействия со специфическими лигандами TLR2, TLR3 и TLR4 в клетках меланомы были выявлены высокие уровни
ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (провос-палительные цитокины); CCL2 и CXCL10 (провоспа-лительные хемокины); ИЛ-10 (ингибирующий фактор опухолевого иммунитета) и циклооксигеназа-2 (воспалительный фактор) [7].
Развитие первичного опухолевого узла (ПОУ), образующегося в результате размножения малигнизиро-ванных меланоцитов, сопровождается активной миграцией в него клеток иммунной системы. Инфильтрация опухоли различными субпопуляциями клеток иммунной системы - это один из элементов, влияющих на рост опухоли. Количество, локализация и фенотипы лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), не только формируют ответ на иммунотерапию, но и являются ключевыми модуляторами прогрессирования заболевания [8].
Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что увеличение TIL в опухоли коррелирует с благоприятным прогнозом течения заболевания. Практически на всех клетках иммунной системы, инфильтрирующих опухоль, включая антиген-презентирующие клетки, моноциты, макрофаги и различные субпопуляции Т-лимфоцитов, присутствуют TLRs. Активация TLRs на этих клетках приводит к синтезу провоспалительных цитокинов и хемокинов, который контролируется адаптивным иммунитетом [9]. В условиях микроокружения опухоли активация TLRs может оказывать как противоопухолевый эффект [активация дендритных клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и НК-клеток] [10, 11], так и стимулировать или подавлять рост опухоли в результате развития воспалительной реакции [12]. Таким образом, конечный эффект от воздействия агонистов TLRs на прогрессию злокачественной мела-номы будет зависеть от действия как на малигнизи-рованные меланоциты, так и на клетки адаптивной иммунной системы.
Известно, что ЛПС грам-отрицательных микроорганизмов являются лигандами TLR4 [1]. Ранее нами было установлено, что введение химически детоксифи-цированного ЛПС (Ас3^-ЛПС) Shigella sonnei, фаза I, мышам линии С57В1/6 с привитой меланомой В16, приводит к замедлению роста ПОУ [13]. Ас3^-ЛПС представляет собой ЛПС с длинной цепью О-специ-фического полисахарида и липидом А, содержащим 3, а не 6 остатков высших жирных кислот, как в липидах А, выделенных из нативных ЛПС различных микроорганизмов. Удаление трех жирных кислот позволило значительно снизить эндотоксическую активность Ac3-S-ЛПС, характерную для нативных ЛПС.
Полученные нами ранее результаты свидетельствуют о том, что клетки меланомы линии В16, которую мы использовали для экспериментов, при культивировании с Ac3-S-mC продуцируют ИЛ-1 в, ИЛ-6 и ИЛ-10. В то же время клетки ПОУ, образовавшиеся после инокуляции опухолевых клеток, при культивировании с Ас3^-ЛПС наряду с цитокинами ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ИЛ-10, продуцировали ФНО, ГМ-КСФ и ИЛ-4, что, по-
видимому, связано с инфильтрацией опухолевых узлов лимфоцитами и макрофагами. Известно, что эти клетки активно мигрируют в опухолевые узлы, особенно на начальных этапах развития опухоли [14].
Как уже отмечалось, способность клеток меланомы продуцировать цитокины обусловлена взаимодействием малигнизированных клеток с TLRs. В то же время аго-нист будет активировать TIL в ПОУ, и результат его действия будет зависеть от влияния как непосредственно на клетки меланомы, так на клетки иммунной системы, инфильтрирующие опухоль. Поэтому при изучении влияния Ас3-8-ЛПС на прогрессию ПОУ мы использовали две экспериментальные модели: перевиваемую культуру клеток меланомы В16, в которой отсутствовали TIL, что подтверждалось отсутствием в субпопуляции CD45+, и клетки ПОУ, полученные после инокуляции клеток меланомы экспериментальным животным.
Было установлено, что клетки линии меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, экспрессируют TLR4. Культивирование клеток мела-номы с Ас3-8-ЛПС приводит к изменению характера экспрессии поверхностных Аг - gp100, MHC I. Уро-вень экспрессии gp100 снижается, в то время как количество клеток, несущих MHC I, увеличивается. К тому же снижается пролиферативная активность опухолевых клеток. При введении Ас3-8-ЛПС непосредственно в область ПОУ в нем увеличивается относительное количество клеток, экспрессирующих MHC I и CD8а.
Материал и методы
Животные. Мыши линии C57B1/6J, самки массой 18-20 г, были получены из питомника СМК «Стезар». Мыши содержались в виварии отдела лабораторных животных ФГБУ «НМИЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов со свободным доступом к корму и питьевой воде. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными Местным комитетом по этике (резолюция 4/17 от 13.07.2017). Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.
Культивирование клеток. Клетки линии меланомы В16 мышей, хранившиеся при -70°С, размораживали, дважды центрифугировали в среде RPMI-1640 при 250 g в течение 5 мин. Культивировали клетки в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из RPMI-1640 с 25мМ Hepes, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ глютамина и 40 мкг/мл гентамицина (все реактивы «ПанЭко», Россия) в пластиковых культуральных флаконах в СО2-инкубаторе при 37°С. На 4-е сутки, после образования плотного монослоя, клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА. Полученную клеточную суспензию дважды отмывали центрифугированием при 250 g в течение 5 мин,
ресуспендировали, подсчитывали количество живых и мертвых клеток с трипановым синим в камере Горяева и использовали для дальнейших экспериментов.
Культивирование клеток меланомы на стекле. В стерильные чашки Петри (диаметр 6 см) (NUNCLON, Дания) помещали покровные стекла 18*18x0,17 мм (ООО «МиниЛаб», Россия), простерилизованные в течение 2 ч при 160 °С. Затем в чашки вносили клетки меланомы В16 в количестве 0,5 • 106 клеток в 5 мл ПКС с добавлением или без добавления Ле3-8-ЛПС. Чашки помещали в СО2-инкубатор при 37 °С. Через 48 ч на всех стеклах образовывался монослой опухолевых клеток, который фиксировали 4 % формальдегидом (10 мин) и отмывали фостфатно-солевым буфером (ФБ) 3 раза по 5 мин и в дальнейшем определяли экспрессию на клетках TLRs и gp100.
Определение экспрессии TLRs на клетках меланомы. Клетки меланомы, зафиксированные на покровных стеклах 4 % формальдегидом, обрабатывали пермеабилизирующим буфером 0,1 % Triton-X-100 (MP Biomedicals, КНР) в течение 10 мин и отмывали ФБ
3 раза по 5 мин. После этого добавляли на 45 мин блокирующий буфер - 1 % бычий сывороточный альбумин (БСА). Затем без отмывки к клеткам были добавлены первичные Ат Polyclonal Antibody to Toll Like Receptor
4 (TLR4) (Cloud-Clone Corp., Китай) в разведении 1 : 50 в блокирующем буфере в объеме 100 мкл на стекло и в качестве контроля - тот же объем 1 % БСА без первичных Ат. Стекла инкубировали ночь при 4 °С во влажной камере. На следующий день стекла трижды отмывали ФБ и инкубировали с вторичными Ат PE-Linked Guinea pig Anti Rabbit IgG Antibody (Cloud-Clone Corp., Китай) в разведении 1 : 400 в 1 % БСА 1 ч при комнатной температуре в темноте. После инкубации стекла отмывали ФБ и окрашивали ядерным красителем DAPI (Invivogen, США) в течение 10 мин. Затем стекла отмывали ФБ и деионизированной водой. Окрашенные и высушенные покровные стекла наклеивали на предметные стекла клетками вниз с помощью монтирующей среды гистофлюида (Marienfeld, Германия) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica 5000B.
Определение экспрессии PMEL17/GP100 на клетках меланомы. После фиксации клеточного слоя на покровных стеклах 4 % формальдегидом проводили термическое извлечение Аг в антиген-восстанавлива-ющем буфере (100 мМ Tris, 5 % мочевина, рН 9,5) на водяной бане при 95 °С в течение 10 мин с последующей отмывкой ФБ. Затем стекла обрабатывали пермеабилизирующим буфером 0,1 % Triton-X-100 в течение 10 мин и после отмывки добавляли блокирующий буфер на 45 мин. После этого на стекла были нанесены первичные Ат DF2953 (БелкиАнтитела, Россия) в разведении 1 : 200 в объеме 100 мкл, на контрольные стекла -блокирующий буфер. Все стекла инкубировали ночь при 4 °С во влажной камере. На следующий день стекла трижды отмывали ФБ и инкубировали с вторичными Ат - PE-Linked Guinea pig Anti Rabbit IgG Antibody в разведении 1 : 400 1 ч при комнатной температуре
в темноте. После инкубации и отмывки стекла были окрашены DAPI (1 мкг/мл) в течение 10 мин с последующей отмывкой ФБ и деионизированной водой. Высохшие покровные стекла наклеивали гистофлюидом клетками вниз на предметные стекла и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica 5000B (Германия).
Проточная цитометрия. Для проточной цитомет-рии использовали меченные флуорохромами монокло-нальные Ат (МкАт) фирмы eBioscience (США) CD8a APC, CD45 FITC, MHC I PE, CD F4/80 APC. Пробы анализировали на проточном цитометре Gallios 6 Color (Beckman Coulter, США) согласно инструкции фирмы-производителя МкАт.
Оценка пролиферативной активности клеток -УРБ450-тест. Клеточную суспензию меланомы В16 помещали в полипропиленовую 15 мл пробирку, отмывали 2 раза центрифугированием 5 мин при 250 g в ФБ, чтобы убрать остатки ЭТС, считали клетки в камере Горяева и разводили в ФБ до концентрации 1-10 • 106/мл. Добавляли 1 мкл VPD450 (США) на 1 мл клеточной суспензии и инкубировали 15 мин при 37 °С на водяной бане. После инкубации еще раз отмывали ФБ в соотношении 9 частей ФБ - 1 часть клеточной суспензии 5 мин при 250 g и ПКС для последующего культивирования клеток. Клетки культивировали в течение 48 ч с добавлением или без добавления Ас3-8-ЛПС. До и после окончания культивирования определяли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) клеток в опытных и контрольных культурах, анализируя препараты под флуоресцентным микроскопом.
Индукция образования ПОУ. Мышей линии C57Bl/6J заражали клетками меланомы В16 внутримышечно в дозе 100 тыс. клеток в 50 мкл стерильного физиологического раствора в бедро правой задней лапы. На 14-18-е сутки узел измеряли, выделяли, измельчали, фильтровали через клеточное сито, центрифугировали при 250 g 5 мин.
Статистический анализ данных. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью стандартной прикладной программы Microsoft Excel 2013, рассчитывая средние значения показателей, ошибку средней и достоверность различий по /-критерию Стьюдента. Разницу считали достоверной при уровне значимости р < 0,05. Для анализа изображений, полученных под флуоресцентным микроскопом, использовали программу LAS X Office 1.4.4 (Leica Microsystems, GmbH, Германия). При учете результатов регистрировали как процент клеток, экспрессирующих маркер, так и СИФ, которую выражали в условных единицах (усл. ед.), соответствующих среднему каналу максимального свечения маркера. Позитивность определяли по отношению к негативному контролю.
Результаты
Экспрессия TLR4 на клетках меланомы В16
Для определения экспрессии TLR4 клетки мела-номы В16 выращивали на покровных стеклах в чашках
чМР
% р
т
\ f 20 мкм 1-1 20 мкм 1—1
Рис. 1. Монослой культуры клеток меланомы В16 на покровном стекле. Микроскоп Leica DM 5000B (Leica Microsystems, GmbH, Германия), объектив х40, окуляр х12.
Окраска: А. Азур-эозин. Б. Anti-TLR4 (Rabbit Anti-Mouse)+ Guinea pig Anti-Rabbit IgG polyclonal AB PE-Linked+DAPI. В. Guinea pig Anti-Rabbit IgG polyclonal AB PE-Linked+DAPI.
Петри в течение 48 ч (рис. 1). На рис. 1А представлена микрофотография (световой микроскоп) участка клеточного монослоя после фиксации 4 % формальдегидом и окраски азур-эозином. Это клетки с многогранным телом и длинными отростками-дендри-тами. В центре клетки локализуется большое ядро овальной формы. На рис. 1Б представлена микрофотография (флуоресцентный микроскоп) клеток монослоя, окрашенных первичными Ат, специфичными к TLR4 (Rabbit Anti-Mouse), а затем вторичными Ат (Guinea pig Anti-Rabbit IgG polyclonal AB PE-Linked), меченными фикоэритрином. На рис. 1В представлена микрофотография (флуоресцентный микроскоп) контрольной культуры, окрашенной только вторичными Ат.
На микрофотографии (см. рис. 1Б) достаточно четко видно, что клетки монослоя культуры меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, взаимодействуют с Ат, специфичными для TLR4.
Известно, что меланома относится к иммуногенным опухолям, на поверхности клеток которой присутствуют опухоль-специфичные Аг, такие как gp100, меланомный Аг 1, распознаваемый Т-клетками (MART-1), tyrosinase-related protein 2 (TRP-2) и ряд других, индуцирующих противоопухолевый иммунный ответ в результате активации Т-клеток, что позволяет использовать их для создания вакцинных препаратов [15].
Наиболее часто для этих целей используется gp100 (меланоцитарный белок PMEL) или его фрагменты. Gp100 представляет собой трансмембранный гликопро-теин типа I с молекулярной массой 100 кДа, он является структурным компонентом меланосом. Установлено, что gp100 несет различные иммуногенные эпитопы, которые распознаются цитотоксическими Т-лимфоци-тами, инфильтрирующими опухоль и оказывающими значительное влияние на ее иммуногенность [16, 17].
Для оценки влияния детоксифицированного ЛПС на экспрессию gp100 размороженные клетки меланомы
/
* N
»"
. . > / % V
У J* • W ■ 1 , '
20 мкм 1-1
Рис. 2. Клетки культуры меланомы В16 на покровном стекле, окрашенные Ат к gp100 + DAPI. Микроскоп Leica DM 5000B (Leica Microsystems, GmbH, Германия), объектив *20, окуляр *12
А - клетки культуры, в которую не добавляли Ас3-Б-ЛПС; Б - клетки, которые культивировали в присутствии Ас3-Б-ЛПС
Экспрессия Аг MHC-I на клетках меланомы после культивирования в присутствии Ac3-S-ЛПС
Экспрессия Аг MHC-I на клетках меланомы после культивирования без Ac3-S-ЛПС
20 мкм
0 5 10 15 20 25 30 35 40 % МИО-1+-клеток
Рис. 3. Суспензия клеток меланомы В16, окрашенная анти-MHC класса I (H-2Kb) МкАт, меченными фикоэритрином. Микроскоп Leica DM 5000B (Leica Microsystems, GmbH, Германия), объектив x40, окуляр x12
В16 культивировали в присутствии Ас3-8-ЛПС в течение 48 ч, а затем окрашивали поликлональными Ат к РМЕЬ.17/ОР100 согласно протоколу фирмы-производителя Ат (АЕйик, КНР) и анализировали под флуоресцентным микроскопом. Культивирование клеток меланомы В16 с Ас3-8-ЛПС привело к значительному снижению экспрессии ^100 (рис. 2). Полученные результаты позволяют предположить, что под воздействием Ас3-8-ЛПС иммуногенность опухоли будет снижаться. Однако было показано, что пептиды, выделенные из опу-холь-ассоциированных Аг, вызывают ответ цитотоксичес-ких Т-лимфоцитов, рестриктированный по МНС [18], причем эффективность иммунных реакций зависит как от уровня экспрессии меланома-ассоциированных Аг, так и от уровня экспрессии молекул МНС класса I [19].
Поэтому в следующей серии экспериментов мы изучали влияние Ас3-8-ЛПС на экспрессию Аг МНС класса I на клетках меланомы В16. Для этого суспензию клеток культивировали в течение 48 ч с агонистом, окрашивали МкАт к МНС I, меченными фикоэритрином и затем сравнивали среднюю интенсивность флуоресценции отдельных клеток. Полученные результаты представлены на рис. 3.
Эти результаты свидетельствуют о значительном увеличении количества клеток меланомы В16, несущих Аг МНС класса I, после культивирования с Ас3-8-ЛПС, что подтверждается результатами анализа этих же популяций клеток с помощью проточного цитометра (рис. 4).
Ac3-S-ЛПС снижает экспрессию на малигнизиро-ванных клетках меланома-ассоциированного Аг gp100, увеличивает экспрессию на этих клетках Аг МНС I и, следовательно, детоксифицированный ЛПС, непосредственно взаимодействуя с опухолевыми клетками, может изменять их свойства, что, естественно, будет оказывать влияние на прогрессирование опухоли.
В следующей серии экспериментов мы оценили влияние Ac3-S-ЛПС на интенсивность пролиферации клеток меланомы В16. Перед началом культивирования с Ac3-S-ЛПС доля живых опухолевых клеток в культуре, согласно тесту с трипановым синим, составляла 98 %. После окончания культивирования через 48 ч она не изменялась, что свидетельствует об отсутствии прямого цитотоксического действия препарата на клетки меланомы В16. При этом количество клеток в культуре, в которую добавляли Ac3-S-ЛПС, было статистически достоверно ниже, чем в контрольной. Количество клеток во флаконах без препарата составляло (12,75 ± 0,92) • 105 в 0,5 мл, а во флаконах с препаратом - (6,25 ± 0,39) • 105 в 0,5 мл. Это позволяет предположить, что наблюдаемое в экспериментах снижение количества клеток в культурах, в которые добавляли Ac3-S-ЛПС, связано с увеличением продолжительности клеточного цикла. Данное предположение подтверждается результатами экспериментов с использованием красителя VPD 450 (BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450, BD Biosciences, Люксембург). При добавлении в культуру
э
Экспрессия MHC-I на клетках контрольных культур меланомы В16
10°
101
102
FL2-H:: МНС-I PE
103
104
Экспрессия MHC-I на клетках меланомы В16 после культивирования с Ас3^-ЛПС
10°
101
102
FL2-H:: МНС-I PE
103
104
Немеченные клетки Клетки контрольных культур
Клетки меланомы В16 после культивирования с Ас3-8-ЛПС
Рис. 4. Влияние ЛсЗ-Б-ЛПС на экспрессию МНС класса I
0
0
клеток нефлуоресцирующий краситель VPD 450 пассивно диффундирует через клеточную мембрану внутрь клетки, где он гидролизуется внутриклеточными неспецифическими эстеразами и ковалентно связывается с клеточными компонентами, приобретая при этом способность флуоресцировать под действием излучения с длиной волны 450 нм.
Мертвые клетки VPD 450 не окрашиваются. При каждом делении клеток, предварительно окрашенных VPD 450, интенсивность флуоресценции уменьшается приблизительно в 2 раза, что позволяет оценивать влияние различных препаратов на пролиферацию в течение того или иного периода культивирования клеток [20]. Перед началом культивирования в опытные и контрольные культуры добавляли VPD 450 и определяли начальную среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), выраженную в условных единицах (усл. ед.), анализируя препараты под флуоресцентным микроскопом. Клетки культивировали в течение 48 ч и после окончания культивирования определяли СИФ клеток в опытных и контрольных культурах (рис. 5).
Из представленных на рис. 5 данных следует, что значение СИФ клеток культур, в которые добавляли Ас3-8-ЛПС, было статистически достоверно выше, чем контрольных, что свидетельствовало о замедлении пролиферации клеток под влиянием препарата в культурах, в которые добавляли агонист.
На следующем этапе было изучено влияния Ac3-S-ЛПС на субпопуляционный состав ПОУ после введения препарата in vivo. Для этого мышам линии C57BL/6 в мышцу бедра правой задней конечности вводили 100 тыс. клеток меланомы В16. На 3-и, 8, 14 и 16-е сутки после инокуляции клеток меланомы мышам внутри-брюшинно вводили раствор Ас3-8-ЛПС в концентрации
100 мкг/мышь в объеме 100 мкл. На 11-12-е сутки после введения опухолевых клеток у мышей при пальпации было зарегистрировано появление ПОУ На 18, 21 и 22-е сутки мышам из опытной группы в область ПОУ вводили раствор Лс3-8-ЛПС в концентрации 2 мкг/мл в объеме 50 мкл (0,1 мкг/мышь). Мышам из контрольной группы в опухолевый узел вводили стерильный физиологический раствор в те же сроки и в том же объеме.
Анализ субпопуляционного состава ПОУ показал, что относительное содержание СБ45+-лимфоцитов было значительно выше в узлах, образовавшихся у мышей, которым вводили Лс3-8-ЛПС (рис. 6). При этом у животных опытной группы отмечено значительное увеличение в ПОУ относительного количества лимфоцитов СБ45+/СБ8а+ (рис. 7).
250
я 200
150
100
50
С
р<0,05
I
Et
Клетки перед культивированием
Клетки культуры, в которую добавляли
Ac3-S-nnC
Контроль Немеченные
Рис. 5. Сопоставление средней интенсивности флуоресценции опухолевых клеток из культур, в которые добавляли Лс3-Б-ЛПС, и контрольных
0
клетки
э
Цитограмма лимфоцитов ПОУ животных, получавших Ac3-S-ЛПС
te
Ó
5M
4M -
3M -
1M
100 101 102 10 FL1-H:: CD45 FITC
104
О
800
600
400
200
10°
10
10
2
103
104
FL1-H:: CD45 FITC
э
Цитограмма лимфоцитов ПОУ í контрольной группы
5M
£ 4M
м
-H C-
3M -
1M
100
10
10
103
FL1-H:: CD45 FITC
104
1500
1000
C
500
100
10
10
103
FL1-H:: CD45 FITC
104
C 2M
C 2M
0
0
Рис. 6. Относительное содержание СБ45+-лимфоцитов в первичных опухолевых узлах экспериментальных животных, получавших ЛеЗ-Б-ЛПС (А), и животных из контрольной группы (Б)
При цитометрическом анализе субпопуляций клеток ПОУ у животных, которым вводили Ас3-8-ЛПС, было отмечено значительное увеличение количества клеток, экспрессирующих Аг MHC I, и некоторое увеличение количества клеток, экспрессирующих детерминанты CD F4/80 (см. таблицу).
Таким образом, введение in vivo Ас3-8-ЛПС Shigella sonnei приводит к увеличению в ПОУ количества клеток, экспрессирующих MHC I, и стимулирует миграцию в них CD8a+-лимфоцитов (см. рис. 7).
Обсуждение
В представленном исследовании на экспериментальных моделях in vitro и in vivo было изучено влияние детоксифицированного ЛПС Shigella sonnei, фаза I, на клетки злокачественной меланомы В16. Было показано, что клетки перевиваемой линии меланомы экспресси-руют TLR4. Наличие данного рецептора на поверхности малигнизированных меланоцитов позволяет предположить, что эффекты, которые были отмечены при культивировании клеток с Ас3-8-ЛПС, обусловлены его
взаимодействием с TLR4, так как установлено, что ЛПС грам-отрицательных микроорганизмов, к которым относятся Shigella sonnei, являются лигандами этого рецептора [21].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что культивирование клеток меланомы с Ac3-S-ЛПС приводит к уменьшению экспрессии опухоль-ассоци-ированного меланомного Аг gp100 (см. рис. 2), от которого в значительной степени зависит иммуногенность опухоли. Известно, что гидрофобный гликопротеин gp100 относится к семейству дифференцировочных Аг, экспрессируемых большинством малигнизированных меланоцитов. В его молекуле представлены различные иммуногенные эпитопы, которые распознаются цито-токсическими CD8+-Т-лимфоцитами пациентов со злокачественной меланомой [17]. Возможно, снижение экспрессии gp100 будет приводить к снижению имму-ногенности клеток опухоли. Однако установлено, что активация опухоль-специфичных CD8+-Т-лимфоцитов происходит в результате взаимодействия Аг-распозна-ющего рецептора с фрагментами опухолевых Аг в ком-
104
103
102
101
100
Цитограмма лимфоцитов ПОУ животных, получавших Ac3-S-ЛПС
Q1 7 Q2
1,91% 4,48%
CD45 FITC, CD8 APC subset 3,31%
10° 101 102 103 FL1-H:: CD45 FITC
104
э
C
P AP
8 D
C
L F
104
103
102
101
Цитограмма лимфоцитов ПОУ животных контрольной группы
Q1 ' Q2~
2,30% 0,859%
CD45 FITC, CD8 APC subset 0,429%
10"
10"
10
10
103
104
FL1-H:: CD45 FITC
Рис. 7. Относительное содержание СБ45+/СБ8а+-лимфоцитов в первичных опухолевых узлах экспериментальных животных, получавших ЛеЗ-Б-ЛПС (А), и животных из контрольной группы (Б)
плексе с молекулами МНС I, поэтому эффективность иммунных реакций зависит как от уровня экспрессии опухолевых Аг, так и от уровня экспрессии молекул МНС класса I.
Как известно, молекулы МНС класса I экспресси-руются всеми ядросодержащими клетками организма, а их присутствие является обязательным условием для формирования эффективного иммунного ответа и распознавания опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Экспериментально доказано, что в процессе роста опухоли малигнизированные клетки теряют молекулы МНС класса I [22].
Согласно существующим представлениям, утрата поверхностных Аг МНС I является одним из механизмов защиты малигнизированных клеток от цитотоксиче-ских лимфоцитов хозяина. Результаты исследования ранее нелеченных пациентов с меланомой показали, что частичная или полная потеря экспрессии МНС класса I приводит к значительному снижению эффективности противоопухолевого Т-клеточного иммунного ответа [23].
При исследовании первичных меланом и метастатических поражений было установлено, что отсутствие или низкий уровень Аг НЬЛ класса I характерны для большинства первичных опухолей, коррелируют со стадией заболевания и продолжительностью жизни пациентов. При этом количество молекул НЬЛ, присут-
ствующих на поверхности опухолевых клеток, может количественно влиять на их лизис цитотоксическими лимфоцитами.
Поэтому нами было изучено влияние Ас3-8-ЛПС не только на экспрессию опухолевого Аг gp100, но и на экспрессию Аг MHC класса I. Установлено, что культивирование клеток меланомы В16 в присутствии Ас3-8-ЛПС приводит к повышению экспрессии Аг MHC класса I на малигнизированных меланоцитах (см. рис. 3).
При введении in vivo Ас3-8-ЛПС в область первичного опухолевого узла (см. таблицу) также было зафиксировано увеличение количества клеток, несущих Аг MHC класса I. При этом в ПОУ животных, которым вводили препарат, относительное количество MHC I+/ CD45+- и MHC T/CD45+-клеток было значительно выше. И если стимулирующее влияние продуктов бактериального происхождения на экспрессию Аг MHC класса I на Аг-представляющих клетках было неоднократно описано [24], то данных в научной литературе о модуляции экспрессии этих Аг непосредственно на малигнизиро-ванных меланоцитах нами не обнаружено.
Увеличение экспрессии Аг MHC класса I после воздействия лигандов толл-подобных рецепторов было отмечено в экспериментах с глиомой GL261, клетки которой, как и клетки меланомы В16, несут TLR2, TLR3 и TLR4 [25]. Возможно, следует ожидать, что и на клетках других опухолей, экспрессирующих TLRs,
Влияние ЛеЗ-Б-ЛПС на инфильтрацию лимфоцитами и макрофагами первичных опухолевых узлов (ПОУ), в %
Маркер Животные, получавшие Ac3-S-JII 1С (размер ПОУ - 577,5 мм3) Животные контрольной группы (размер ПОУ - 1414 мм3)
MHC I+ 37,3 7,6
MHC I+/CD45+ 16,3 3,13
MHC I+/CD45- 21,0 4,47
CD F4/80+ 2,13 0,847
после взаимодействия с соответствующими лигандами будет увеличиваться экспрессия Аг MHC класса I, а это, в свою очередь, будет способствовать интенсивности противоопухолевого иммунного ответа.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что увеличение на клетках меланомы экспрессии Аг MHC класса I, после введения in vivo Ac3-S-ЛПС, сопровождается увеличением содержания CD8+-T-лимфоцитов в опухолевых узлах, что подтверждается результатами цитометрического анализа (рис. 7). Так, при анализе 100 000 клеток ПОУ контрольной группы мышей в гейте, содержащем CD8+CD45+-лимфоциты, было зарегистрировано 427 клеток, в то время как в группе мышей, получавших Ac3-S-ЛПС, среди 100 000 клеток ПОУ в аналогичном гейте было зарегистрировано 3310 CD8+CD45+-лимфоцитов.
Особый интерес к изучению уровня экспрессии Аг МНС I на поверхности клеток меланомы в настоящее время связан с впечатляющими результатами, полученными при комбинированной терапии больных меланомой c применением МкАт к CTLA-4 и к PD-1, которая обеспечивала хорошие клинические результаты на поздних стадиях развития заболевания [23, 26]. Клинические наблюдения высокой эффективности терапии больных меланомой МкАт к CTLA-4 и к PD-1 также подтверждаются результатами экспериментов по изучению комбинированной терапии меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J. Показано, что блокирование CTLA-4 и PD-1 совместно с перепрограммированием миелоидных клеток с помощью агониста TLR-4 оказалось гораздо более эффективным по сравнению с чек-пойнт-блокадой и использованием TLR-4-агониста по отдельности в виде монотерапии [27].
При изучении корреляции экспрессии белков MHC класса I и II на опухолевых клетках пациентов с мела-номой, ранее не получавших лечения, и результатами транскрипционного и геномного анализа, а также с клиническим ответом на анти-CTLA-4 МкАт, анти-PD-1-МкАт или комбинированную терапию было установлено, что частичная или полная потеря мембранной экспрессии Аг MHC класса I на клетках меланомы наблюдалась в 78 из 181 случая (43 %), связана с подав-
■ Литература
1. Coati I., Miotto S., Zanetti I., Alaibac M. Toll-like receptors and cutaneous melanoma (Review). Oncology Letters. 2016; 12: 3655-61. DOI: https://doi.org/10.3892/ol.2016.5166
2. Salaun B., Lebecque S., Matikainen S., Rimoldi D., Romero P. Tolllike receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy? Clin. Cancer Res. 2007; 13: 4565-74. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432. CCR-07-0274
3. Adams S. Toll-like receptor agonists in cancer therapy. Immuno-therapy. 2009; 1: 949-64. DOI: https://doi.org/10.2217/imt.09.70
4. Burns E.M., Yusuf N. Toll-like receptors and skin cancer. Front Immunol. 2014; 5: 135. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2014. 00135
5. Joo Hee Ahn, Tae Jun Park, Sun Hee Jin, Hee Young Kang. Human melanocytes express functional Toll-like receptor 4. Experimental Dermatology. 2008; 17: 412-7. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-0625. 2008.00701.x
лением транскрипции генов HLA-A, HLA-B, HLA-C и B2Mи приводит к первичной резистентности к терапии анти-С1ЪА-4 МкАт, но не анти-PD-1-МкАт. Таким образом, экспрессия молекул MHC может модулировать реакцию на ингибиторы иммунной контрольной точки у пациентов с прогрессирующей меланомой. Результаты клинических исследований свидетельствуют, что пациенты с низкой экспрессией Аг MHC класса I реагируют на ингибитор PD-1 в гораздо меньшей степени, чем пациенты с более высокой экспрессией MHC класса I [23]. Потеря Аг MHC класса I тесно связана с прогрессированием заболевания и указывает на отсутствие клинического ответа.
Согласно существующим представлениям, основным следствием терапии ингибиторами контрольной точки является развитие ЦТЛ, которым требуется опосредованная MHC класса I презентация Аг опухолевыми клетками, значительно сниженная у пациентов с данным заболеванием. Возможно, этим можно объяснить отсутствие реакции на иммунокорригирующую терапию. Полученные результаты позволяют предположить, что включение в комплексную терапию меланомы препаратов, восстанавливающих на малигнизированных меланоцитах экспрессию Аг МНС класса I, в частности, детоксифицированного Ас3-8-ЛПС, поможет решить эту проблему.
Заключение
Установлено, что детоксифицированный ЛПС Shigella sonnei, фаза I, оказывает влияние на экспрессию поверхностных Аг на малигнизированных мелано-цитах и замедляет пролиферацию опухолевых клеток меланомы В16. Культивирование опухолевых клеток с Ас3-8-ЛПС приводит к снижению экспрессии опухоль-ассоциированного Аг gp100 и значительно увеличивает экспрессию Аг MHC класса I на клетках меланомы (см. рис. 3, 4). Увеличение экспрессии Аг MHC класса I на клетках меланомы было выявлено как при культивировании опухолевых клеток с Ас3-8-ЛПС, так и при введении его в область опухолевого узла, что приводило к усилению противоопухолевого иммунного ответа.
6. Hong Y., Song B., Chen H.-D., Gao X.-H. Melanocytes and skin immunity. J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 2015; 17 (1): 37-9. DOI: https://doi.org/10.1038/jidsymp.2015.14
7. Goto Y., Arigami T., Kitago M., Nguyen S.L., Narita N., Ferrone S., Morton D.L., Irie R.F., Hoon D.S. Activation of Toll-like receptors 2, 3 and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors. Mol. Cancer Ther. 2008; 7 (11): 3642-53. DOI: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-08-0582. PMID: 19001446
8. Maibach F., Sadozai H., Seyed Jafari S.M., Hunger R.E., Schenk M. Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Their Prognostic Value in Cutaneous Melanoma. Front Immunol. 2020; 11: 2105. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2020.02105
9. Patra M.C., Shah M., Choi S. Toll-like receptor-induced cyto-kines as immunotherapeutic targets in cancers and autoimmune diseases. Semin. Cancer Biol. 2020; 64: 61-82. DOI: https://doi.org/10.1016/j. semcancer.2019.05.002
10. Abarca-Merlin D.M., Maldonado-Bernal C., Alvarez-Arellano L. Toll-like receptors as therapeutic targets in central nervous system tumors. Biomed. Res. Int. 2019; 2019: 5286358. DOI: https://doi. org/10.1155/2019/5286358
11. Tran T.H., Tran T.T.P., Truong D.H., Nguyen H.T., Pham T.T., Yong C.S., Kim J.O. Toll-like receptor-targeted particles: a paradigm to manipulate the tumor microenvironment for cancer immunotherapy. Acta Biomater. 2019; 94: 82-96. DOI: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.05.043
12. Korneev K.V., Atretkhany K.N., Drutskaya M.S., Grivennikov S.I., Kuprash D.V., Nedospasov S.A. TLR-signaling and proinfammatory cytokines as drivers of tumorigenesis. Cytokine. 2017; 89: 127-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2016.01.021
13. Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н.А., Чухина Е.С., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н. Влияние капсульного полисахарида и детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на рост опухолевого узла и синтез цитокинов у мышей линии C57Bl/6 после инокуляции меланомы В16. Иммунология. 2023; 44 (2): 167-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-167-80
14. Gata V.A., Lisencu C.I., Vlad C.I., Piciu D., Irimie A., Achimas-Cadariu P. Tumor infiltrating lymphocytes as a prognostic factor in malignant melanoma. Review of the literature. J. Buon. 2017; 22 (3): 592-8. PMID: 28730761
15. Hailemichael Y., Overwijk W.W. Cancer vaccines: Trafficking of tumor-specific T cells to tumor after therapeutic vaccination. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2014; 53: 46-50. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.biocel.2014.04.019
16. Kawakami Y., Dang N., Wang X., Tupesis J., Robbins P.F., Wang R.F., Wunderlich J.R., Yannelli J.R., Rosenberg S.A. Recognition of shared melanoma antigens in association with major HLA-A alleles by tumor infiltrating T lymphocytes from 123 patients with melanoma. J. Immunother. 2000; 23 (1): 17-27. DOI: https://doi.org/10.1097/00002371-200001000-00004
17. Eisenberg G., Machlenkin A., Frankenburg S., Mansura A., Pitcovski J., Yefenof E., Peretz T., Lotem M. Transcutaneous immunization with hydrophilic recombinant gp100 protein induces antigen-specific cellular immune response. Cell Immunol. 2010; 266 (1): 98-103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.09.003
18. Boon T., van der Bruggen P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J. Exp. Med. 1996; 183 (3): 725-9. DOI: https://doi. org/10.1084/jem.183.3.725
19. Rivoltini L., Barracchini K.C., Viggiano V., Kawakami Y., Smith A., Mixon A., Restifo N.P., Topalian S.L., Simonis T.B., Rosenberg S.A., Marincola F.M. Quantitative correlation between HLA class I allele expression and recognition of melanoma cells by antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 1995; 55 (14): 3149-57. PMID: 7541714
20. Elia J., Sundarrajan M., Ernst D. Technique for Loading Cells with BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450). BD Biosciences Technical Bulletin. 2012; 1-11.
21. Ciesielska A., Matyjek M., Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021; 78 (4): 1233-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-020-03656-y
22. Garrido F., Aptsiauri N. Cancer immune escape: MHC expression in primary tumours versus metastases. Immunology. 2019; 158: 255-66. DOI: https://doi.org/10.1111/imm.13114
23. Rodig S.J., Gusenleitner D., Jackson D.G., Gjini E., Giobbie-Hurder A., Jin C., Chang H., Lovitch S.B., Horak C., Weber J.S., Weira-ther J.L., Wolchok J.D., Postow M.A., Pavlick A.C., Chesney J., Hodi F.S. MHC proteins confer differential sensitivity to CTLA-4 and PD-1 blockade in untreated metastatic melanoma. Sci. Transl. Med. 2018; 10 (450): 3342. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aar3342
24. Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N., D'amico G., Stoppacciaro A., Mancinelli R., van't Veer C., Penton-Rol G., Ruco L.P., Allavena P., Mantovani A. Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. Immunol. 2000; 164: 5998-6004. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.164.11.5998
25. Visintin A., Mazzoni A., Spitzer J.H., Wyllie D.H., Dower S.K., Segal D.M. Regulation of Toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells. J. Immunol. 2001; 166: 249-55. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.166.1.249
26. MHC Expression Predicts Checkpoint Blockade Response. [No authors listed]. Cancer Discov. 2018; 8 (9): 1052. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-NB2018-104
27. Пичугин А.В., Подсвирова С.А., Ушакова Е.И., Спирин Д.М., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Перепрограммирование миело-идных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте. Иммунология. 2022; 43 (6): 673-690. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690
■ References
1. Coati I., Miotto S., Zanetti I., Alaibac M. Toll-like receptors and cutaneous melanoma (Review). Oncology Letters. 2016; 12: 3655-61. DOI: https://doi.org/10.3892/ol.2016.5166
2. Salaun B., Lebecque S., Matikainen S., Rimoldi D., Romero P. Tolllike receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy? Clin Cancer Res. 2007; 13: 4565-74. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432. CCR-07-0274
3. Adams S. Toll-like receptor agonists in cancer therapy. Immuno-therapy. 2009; 1: 949-64. DOI: https://doi.org/10.2217/imt.09.70
4. Burns E.M., Yusuf N. Toll-like receptors and skin cancer. Front Immunol. 2014; 5: 135. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00135
5. Joo Hee Ahn, Tae Jun Park, Sun Hee Jin, Hee Young Kang. Human melanocytes express functional Toll-like receptor 4. Experimental Dermatology. 2008; 17: 412-7. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-0625.2008.00701.x
6. Hong Y., Song B., Chen H.-D., Gao X.-H. Melanocytes and skin immunity. J Invest Dermatol Symp Proc. 2015; 17 (1): 37-9. DOI: https:// doi.org/10.1038/jidsymp.2015.14
7. Goto Y., Arigami T., Kitago M., Nguyen S.L., Narita N., Ferrone S., Morton D.L., Irie R.F., Hoon D.S. Activation of Toll-like receptors 2, 3 and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors. Mol Cancer Ther. 2008; 7 (11): 3642-53. DOI: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-08-0582
8. Maibach F., Sadozai H., Seyed Jafari S.M., Hunger R.E., Schenk M. Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Their Prognostic Value in Cutaneous Melanoma. Front Immunol. 2020; 11: 2105. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2020.02105
9. Patra M.C., Shah M., Choi S. Toll-like receptor-induced cyto-kines as immunotherapeutic targets in cancers and autoimmune diseases. Semin Cancer Biol. 2020; 64: 61-82. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.semcancer.2019.05.002
10. Abarca-Merlin D.M., Maldonado-Bernal C., Alvarez-Arellano L. Toll-like receptors as therapeutic targets in central nervous system tumors. Biomed Res Int. 2019; 2019: 5286358. DOI: https://doi. org/10.1155/2019/5286358
11. Tran T.H., Tran T.T.P., Truong D.H., Nguyen H.T., Pham T.T., Yong C.S., Kim J.O. Toll-like receptor-targeted particles: a paradigm to manipulate the tumor microenvironment for cancer immunotherapy. Acta Biomater. 2019; 94: 82-96. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.actbio.2019.05.043
12. Korneev K.V., Atretkhany K.N., Drutskaya M.S., Grivennikov S.I., Kuprash D.V., Nedospasov S.A. TLR-signaling and proinfammatory cytokines as drivers of tumorigenesis. Cytokine. 2017; 89: 127-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2016.01.021
13. Novikova E.M., Kozyreva O.V., Razvalyayeva N.A., Chukhina E.S., Golovina M.E., L'vov V.L., Aparin P.G., Stepanenko R.N. Effect of capsular polysaccharide and detoxified lipopolysaccharide Shigella sonnei on tumor node growth and cytokine synthesis in C57Bl/6 mice after inoculation of melanoma B16. Immunologiya. 2023; 44 (2): 167-80. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-167-80 (in Russian)
14. Gata V.A., Lisencu C.I., Vlad C.I., Piciu D., Irimie A., Achimas-Cadariu P. Tumor infiltrating lymphocytes as a prognostic factor in malignant melanoma. Review of the literature. J Buon. 2017; 22 (3): 592-8. PMID: 28730761
15. Hailemichael Y., Overwijk W.W. Cancer vaccines: Trafficking of tumor-specific T cells to tumor after therapeutic vaccination. Int J Biochem Cell Biol. 2014; 53: 46-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biocel.2014.04.019
16. Kawakami Y., Dang N., Wang X., Tupesis J., Robbins P.F., Wang R.F., Wunderlich J.R., Yannelli J.R., Rosenberg S.A. Recognition of shared melanoma antigens in association with major HLA-A alleles by tumor infiltrating T lymphocytes from 123 patients with melanoma. J Immunother. 2000; 23 (1): 17-27. DOI: https://doi.org/10.1097/00002371-200001000-00004
17. Eisenberg G., Machlenkin A., Frankenburg S., Mansura A., Pitcovski J., Yefenof E., Peretz T., Lotem M. Transcutaneous immunization with hydrophilic recombinant gp100 protein induces antigen-specific cellular immune response. Cell Immunol. 2010; 266 (1): 98-103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.09.003
18. Boon T., van der Bruggen P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J Exp Med. 1996; 183 (3): 725-9. DOI: https://doi. org/10.1084/jem.183.3.725
19. Rivoltini L., Barracchini K.C., Viggiano V., Kawakami Y., Smith A., Mixon A., Restifo N.P., Topalian S.L., Simonis T.B., Rosenberg S.A., Marincola F.M. Quantitative correlation between HLA class I allele expression and recognition of melanoma cells by antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 1995; 55 (14): 3149-57. PMID: 7541714
20. Elia J., Sundarrajan M., Ernst D. Technique for Loading Cells with BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450). BD Biosciences Technical Bulletin. 2012; 1-11.
21. Ciesielska A., Matyjek M., Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021; 78 (4): 1233-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-020-03656-y
Сведения об авторах
Новикова Елена Михайловна - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. экспериментальной технологии иммуно-препаратов отд. фундаментальной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4477-0790
Чухина Елена Станиславовна - мл. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов отд. иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6036-0372
Разваляева Надежда Алексеевна - мл. науч. сотр. лаб. экспериментальной технологии иммунопрепаратов отд. фундаментальной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4445-9695
Козырева Ольга Валентиновна - науч. сотр. лаб. экспериментальной технологии иммунопрепаратов отд. фундаментальной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6499-1444
22. Garrido F., Aptsiauri N. Cancer immune escape: MHC expression in primary tumours versus metastases. Immunology. 2019; 158: 255-66. DOI: https://doi.org/10.1111/imm.13114
23. Rodig S.J., Gusenleitner D., Jackson D.G., Gjini E., Giobbie-HurderA., Jin C., Chang H., Lovitch S.B., Horak C., Weber J.S., Weirather J.L., Wolchok J.D., Postow M.A., Pavlick A.C., Chesney J., Hodi F.S. MHC proteins confer differential sensitivity to CTLA-4 and PD-1 blockade in untreated metastatic melanoma. Sci Transl Med. 2018; 10 (450): 3342. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aar3342
24. Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N., D'amico G., Stoppacciaro A., Mancinelli R., van't Veer C., Penton-Rol G., Ruco L.P., Allavena P., Mantovani A. Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. Immunol. 2000; 164: 5998-6004. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.164.11.5998
25. Visintin A., Mazzoni A., Spitzer J.H., Wyllie D.H., Dower S.K., Segal D.M. Regulation of Toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells. J Immunol. 2001; 166: 249-55. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.166.1.249
26. MHC Expression Predicts Checkpoint Blockade Response. [No authors listed]. Cancer Discov. 2018; 8 (9): 1052. DOI: https://doi. org/10.1158/2159-8290.CD-NB2018-104
27. Pichugin A.V., Podsvirova S.A., Ushakova E.I., Spirin D.M., Lebedeva E.S., Ataullakhanov R.I. Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment increases the efficiency of CTLA-4 and PD-1 blockade in experimental malignant melanoma immunotherapy. Immu-nologiya. 2022; 43 (6): 673-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690 (in Russian)
Authors' information
Elena M. Novikova - PhD, Leader Researcher of Experimental Technologies of Immunopreparations Lab., Fundamental Immunology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4477-0790
Elena S. Chukhina - Junior Researcher of Lab. of Modeling of Immunological Processes, Dept. of Immunodiag-nostics and Immunocorrection, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6036-0372
Nadezhda A. Razvalyayeva - Junior Researcher of Experimental Technologies of Immunopreparations Lab., Fundamental Immunology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4445-9695
Olga V. Kozyreva - Researcher of Experimental Technologies of Immunopreparations Lab., Fundamental Immunology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-6499-1444
Головина Марина Эдуардовна - канд. биол. наук, и.о. вед. науч. сотр. лаб. полисахаридных вакцин отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: m [email protected]
Львов Вячеслав Леонидович - канд. хим. наук, зав. лаб. препаративной биохимии антигенов отд. фундаментальной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0609-8331
Апарин Петр Геннадьевич - д-р мед. наук, зав. лаб. полисахаридных вакцин отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7899-2626
Степаненко Родион Николаевич - д-р мед. наук, зав. лаб. экспериментальной технологии иммунопрепа-ратов отд. фундаментальной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7577-8613
Marina E. Golovina - PhD, Acting Leader Researcher of Polysaccharide Vaccines Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Vyacheslav L. L'vov - PhD, Head of Preparative Biochemistry of Antigens Lab., Fundamental Immunology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0609-8331
Petr G. Aparin - MD, PhD, Head of Polysaccharide Vaccines Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7899-2626
Rodion N. Stepanenko - MD, PhD, Head of Experimental Technologies of Immunopreparations Lab., Fundamental Immunology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7577-8613
