CC BY
66
Семихин Александр Сергеевич - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.,
Котнова Алина Петровна - канд. хим. наук, науч. сотр.,
Башкиров Виктор Николаевич - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., e-mail: [email protected],
Карягина-Жулина Анна Станиславовна - д-р биол. наук, гл. науч. сотр., e-mail: akaryagina@ gmail.com,
Лунин Владимир Глебович - д-р биол. наук, зав. лаб., e-mail: [email protected],
Гинцбург Александр Леонидович - акад. РАМН, д-р биол. наук, проф., дир.
Институт инженерной иммунологии Куликова Наталья Леонидовна - ст. науч. сотр., Хлебников Валентин Сергеевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб.,
Центральный НИИ туберкулеза РАМН Кондратьева Татьяна Константиновна - д-р биол. наук, вед. науч. сотр.,
Апт Александр Соломонович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб.,
НИИ ФхБ им. А.Н. Белозерского МГУ Веселов Андрей Михайлович - аспирант.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лящук А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Журнал микро-биол. - 2006. - № 4. - С. 65-68.
2. Лящук А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология.
- 2006. - № 5. - С. 32-38.
3. Andersen P. // Scand. J. Immunol. - 1997. - Vol. 45, N 2. - P. 115-131.
4. Arend S. M., Andersen P., van Meijgaarden K. E. et al. // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 181, N 5. - P. 1850-1854.
5. BerthetF. X., RasmussenP. B., RosenkrandsI. et al. // Microbiology.
- 1998. - Vol. 144, N 11. - P. 3195-3203.
6. Colditz G. A., Brewer T. F, Berkey C. S. et al. // J. A. M. A. - 1994. -Vol. 271. - P. 698-702.
7. Cole S. T, Brosch R., Parkhill J. et al. // Nature. - 1998. - Vol. 393, N 6685. - P. 537-544.
8. Cole S. T., Eiglmeier K., Parkhill J. et al. // Nature. - 2001. - Vol. 409. - P. 1007-1011.
9. Dillon D. C., Alderson M. R., Day C. H. et al. // J. Clin. Microbiol. -2000. - Vol. 38, N 9. - P. 3285-3290.
10. Fine P. E. // Lancet. -1995. - Vol. 346. - P.1339-1345.
11. FleischmannR. D., AllandD., Eisen J. A. et al. // J. Bacteriol. - 2002.
- Vol. 184, N 19. - P. 5479-5490.
12. GordonS. V., EiglmeierK., Garnier T. et al. // Tuberculosis. - 2001.-Vol. 81, N 1-2. - P. 157-163.
13. Johnson P. D., Stuart R. L., Grayson M. L. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol. 6, N 6. - P. 934-937.
14. Lalvani A., Brookes R., Wilkinson R.J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95, N 1. - P. 270-275.
15. Lein A. D., von Reyn C. F., Ravn P. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol. 6, N 4. - P. 606-609.
16. Munk M. E., Arend S. M., Brock I. et al. // J. Infect. Dis. - 2001.- Vol. 183, N 1. - P. 175-176.
17. PathanA. A., Wilkinson K. A., Wilkinson R .J. et al. // Eur. J. Immunol. -2000. - Vol. 9. - P. 2713-2721.
18. Pollock J. M., Andersen P. // Infect. and Immun. -1997. - Vol. 65, N
7. - P.2587-2592.
19. Rodrigues L. C., Divan V. D., Wheeler J. G. // Int. J. Epidemiol. -1993. - Vol. 22. - P. 1154-1158.
20. Smith S. M, Klein M. R., Malin A. S. et al. // Infect. and Immun. -2000. - Vol. 68, N 12. - P. 7144-7148.
21. TerpeK. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2003. - Vol. 60. - P. 523-533.
22. Ulrichs T., Anding P., Porcelli S. et al. // Infect. and Immun. - 2000. - Vol. 68, N 10. - P. 6073-6076.
23. van Pinxteren L. A., Ravn P., Agger E. M. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2000. - Vol. 7, N 2. - P. 155 -160.
24. Williams A., Hatch G. J., Clark S. O.et.al. // Tuberculosis. - 2005. -Vol. 85. - P. 29-38.
PRODUCTION OF MYCOBACTERIAL ANTIGENES MERGED WITH CELLULOSE BINDING PROTEIN DOMAIN IN ORDER TO PRODUCE SUBUNIT VACCINES AGAINST TUBERCULOSIS
O. V. Sergienko1, A. M. Lyashchuk1, E. I. Aksenova1, Z. M. Galushkina1, N.N. Poletaeva1, N. E. Sharapova1, A. S. Semikhin1, A. P. Kotnova1, A.M. Veselov1, V. N. Bashkirov1, N. L. Kulikova3, V. S. Khlebnikov3, T. K. Kondrat'eva2, A.S. Karyagina-Zhulina14, A. S. Apt2, V. G. Lunin1, A.L. Gintsburg1
1 Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the
Russian Federation, Moscow, Russia
2 Central Scientific-Research Institute of Tuberculosis, Russian
Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia 3 Institute of Immunological Engineering, Lyubuchany, Chekhov District, Moscow Region, Russia
Protein genes Ag85A, Esat-6, and Qp10 of Mycobacterium tuberculosis were sequenced using the database GenBank to implement selection and synthesis of primer pairs of given genes. PCR was used to obtain target amplicons of the genes. Chromosome DNA of M. tuberculosis H37Rv was used as the DNA amplification matrix. The PCR products were obtained using the plasmid pQE6, cloned, and amplified in the Escherichia coli М15 strain. Chimere products containing mycobacterial genes and cellulose binding protein domain (CBD), were obtained using the plasmid treated with restriction endonucleases. CBD fragment obtained using similar treatment of the pttW plasmid. The plasmids containing merged sequences of mycobacterial genes-antigenes and CBD were selected. The 3 mycobacterial genes were expressed in the E. coli М15 cells resulting in biosynthesis of corresponding recombinant proteins of expected molecular weight. Concentration of CBD, CfpD-CBD, Ag85A-CBD, and ESAT6-CBD was 20%, 15%, and 15% total protein, respectively. The resulting chimere proteins provide high affinity for cellulose and high stability. Immobilization of CBD-containing recombinant proteins proceeds as one-stage process providing target protein purification and adsorption on cellulose. The vaccines produced using this technology are inexpensive because of low cost of cellulose sorbents as well as simultaneous use of cellulose for purification and immobilization of protein. Many cellulose preparations are not toxic, biocompatible, and widely used in medicine.
Key words: Tuberculosis, Mycobacteirum tuberculosis, antigens, cellulose
Поступила 08.06.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 577.21.08
Н. С. Щербакова, А. Н. Чикаев, Л. И. Карпенко, А. А. Ильичев влияние биотинилирования антител 2f5 на отбор пептидов
из комбинаторной фаговой библиотеки
ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора,
пос. Кольцово, Новосибирская область
В статье рассматривается влияние биотинилирования моно-клональных антител (МКА) в процедуре аффинной селекции на выход и репертуар отбираемых пептидов. Был проведен сравнительный анализ пептидов, отобранных из фаговой би-
блиотеки с помощью биотинилированных и небиотинилиро-ванных МКА 2F5. Показано, что выход пептидов, имеющих гомологию с нативным эпитопом, в 1,7 раза выше для биоти-нилированных антител, при этом связывание отобранных бак-
териофагов с МКА 2Е5 в иммуноферментном анализе (ИФА) выше в случае использования небиотинилированных антител. Следует отметить, что наиболее эффективно связываются с антителами бактериофаги, экспонирующие пептиды, имеющие гомологию с последовательностью нативного эпитопа в 4-5 а. о. Бактериофаги с 3 а. о. показывают различное связывание. На основании полученных данных сделан вывод о рациональном проведении аффинной селекции в зависимости от поставленных задач.
Ключевые слова: фаговый пептидный дисплей, МКА 2F5, биотинилирование антител
Фаговый дисплей является одним из наиболее привлекательных методов современной молекулярной биологии, белковой инженерии и функциональной геномики благодаря невысокой стоимости и простоте выполнения эксперимента. Эта технология основана на встраивании чужеродных нуклеотидных последовательностей в один из генов, кодирующих оболо-чечные белки бактериофага. При этом производится гетерогенная смесь фаговых частиц (фаговая библиотека), каждая из которых экспонирует на поверхности свой пептид, закодированный встроенным фрагментом ДНК. Физическая связь между экспонированным пептидом и генетической информацией о нем делает возможным селекцию специфического фага из больших библиотек и определение последовательности пептида, ответственного за связывание, путем секвенирова-ния ДНК [15, 16]. Более 10 тыс. работ, опубликованных к настоящему времени (www.scholar.google.com), описывают способы применения фагового дисплея для решения различных генно-инженерных задач.
Данный подход предоставил новые возможности для картирования эпитопов, узнаваемых монокло-нальными антителами (МКА), получения диагностических пептидов и пептидов, способных имитировать иммуногенность эпитопов различной природы [4-7, 9, 17, 18]. Для решения такого типа задач проводится процедура аффинной селекции. Существует несколько ключевых моментов, на которые стоит обратить внимание при проведении данной процедуры. Один из них - иммобилизация антител, которая может проводиться либо на поверхность чашки Петри или лунки иммунологических планшет, либо на поверхность шариков из полистирола, латекса, магнитных носителей [10, 14]. Большинство исследователей берут за основу методику, согласно которой предварительно осуществляют биотинилирование МКА, а затем их сорбцию на поверхность, покрытую стрептавидином [2]. Иммобилизация антител в этом случае обеспечивается специфическим взаимодействием стрептави-дина с биотином. Считается, что биотинилирование позволяет увеличить стерическую доступность анти-генсвязывающего участка антител [12].
Однако в ряде работ было показано, что биотини-лирование МКА приводит к нежелательным эффектам. В частности, в работе G. Ноуег-На^еп и соавт. [8] продемонстрировано, что данная процедура часто снижает как аффинность связывания антитела с антигеном, так и его специфичность. Несмотря на попытки оптимизировать процедуру биотинилирова-ния [13], вопрос о целесообразности проведения этой процедуры остается открытым.
Цель данной работы заключалась в анализе эффективности аффинной селекции пептидов из фаговой библиотеки с использованием общепринятой проце-
дуры, предполагающей биотинилирование антител, в сравнении с прямой иммобилизацией антител на пластик. В качестве модельного антитела мы использовали нейтрализующие МКА 2F5, которые узнают консервативную последовательность из 6 а. о. ELDKWA на поверхности gp41 ВИЧ-1 возле трансмембранного региона молекулы [11].
Материалы и методы
МКА. В работе использовали широконейтрализующие МКА 2F5, узнающие участок из 6 а. о. ELDKWA в эктодомене gp41 на поверхности ВИЧ-1 [11].
Фаговая пептидная библиотека. В работе использовали коммерческую фаговую пептидную библиотеку 12-mer, содержащую рандомизованный репертуар пептидов длиной 12 а. о., которые экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII. Амплификацию библиотеки и индивидуальных клонов, титрование бактериофагов проводили согласно руководству фирмы - производителя набора (New England BioLabs).
Аффинная селекция. Аффинную селекцию проводили в три раунда согласно руководству (Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit/New England BioLabs). Иммобилизацию антител проводили в двух вариантах: без биотинилирования и с биотинили-рованием.
В случае проведения селекции с небиотинилированными антителами в лунки иммунологических планшет вносили по 100 мкл раствора антител в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М NaHCO3, рН 8,6, сорбцию продолжали в течение ночи при 4oC. Затем не-связавшиеся антитела удаляли и для подавления неспецифического связывания в лунки добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина в 0,1 М NaHCO3, рН 8,6, содержащий 0,02% азида натрия, и выдерживали 1,5 ч при 4oC. После этого лунки 6 раз промывали ТБС, содержащим 0,1% Tween-20 (ТБСТ) в первом раунде селекции и 0,5% Tween-20 во втором и третьем раундах. Затем в лунки вносили по 4-1010 вирионов пептидной библиотеки бактериофагов в ТБСТ при проведении первого раунда селекции и 1011 вирионов из амплифицированного элюа-та при проведении второго и третьего раундов и инкубировали 1 ч при комнатной температуре на шейкере при 500 об/мин. Не-связавшиеся фаги удаляли 10-кратной промывкой лунок ТБСТ. Элюирование специфически связавшихся фагов проводили буфером 0,2 М глицин-HCl (рН 2,2). Элюированные бактериофаги титровали и амплифицировали согласно руководству (Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit/New England BioLabs).
Во втором случае антитела биотинилировали согласно руководству (Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit/New England BioLabs). В лунки иммунологических планшет вносили по 100 мкл стрептавидина в концентрации 100 мкг/мл в 0,1 М NaHCO3 рН 8,6. Сорбцию проводили в течение ночи при 4oC. Затем био-тинилированные антитела в концентрации 1 мкг/мл инкубировали с фаговой библиотекой при комнатной температуре в течение 1 ч в пробирках на 1,5 мл типа Eppendorf. После отмывки лунок от блокирующего раствора в них вносили смесь фагов с антителами и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем в лунки вносили 0,1 мМ биотина и дополнительно инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Последующие раунды аффинной селекции проводились по той же схеме.
С целью выявления неспецифического связывания бактериофагов с пластиком проводили селекцию на пустые лунки. В лунки планшета вносили по 100 мкл 0,1 М NaHCO3, рН 8,6, буфера и инкубировали ночь при 4oC. Все остальные процедуры проводили, как описано в первом случае.
Титрование бактериофагов, амплификацию элюата, выде-
ление и наработку индивидуальных фаговых клонов осуществляли на основании руководства фирмы-производителя (Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit/New England BioLabs) на штамме E. coli ER2738.
Секвенирование. Нуклеотидные последовательности фаговых ДНК в области встройки определяли с использованием автоматического секвенатора ABIPrizm Genetic Analyzer 310.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Оценку связывания отобранных пептидов с антителами проводили с помощью ИФА. Для этого 100 мкл раствора МКА в концентрации 2 мкг/мл в 0,1 М NaHCO3 (рН 8,6) сорбировали в лунки иммунологических планшет (Greiner bio-one, med. binding), инкубировали в течение 2 ч в термостате при 37oC, затем ночь при 4oC. Блокировку проводили буфером, содержащим 5 мг/мл БСА и 0,02% азида натрия в течение 1 ч при 4oC. После блокировки иммунологический планшет отмывали 6 раз ТБС, содержащим 0,5% Tween-20, вносили 1012 вирионов в первую лунку с последующим 4-кратным разведением и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на качалке при 300 об/мин. Затем проводили 6-кратную отмывку планшета ТБС-Твин (0,5%), вносили раствор конъю-ганта анти-М13-антител с пероксидазой хрена («GE Helthcare») в разведении 1:5000 и инкубировали 1 ч при комнатной температуре на качалке при 300 об/мин. После инкубации планшет снова отмывали 6 раз ТБС-Твин (0,5%) и добавляли субстрат для пероксидазы хрена: 700 мкл TMB («Amresco») разводили в 10 мл буфера для субстрата.
Окрашивание проводили в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, реакцию останавливали добавлением 0,25 М H2SO4. Результаты ИФА оценивали по оптической плотности при длине волны 405 нм на спектрофотометре Microplate reader («BioRad»). Сравнение результатов проводили для лунок, содержащих 1010 вирионов бактериофагов, в качестве отрицательного контроля использовали бактериофаг М13, который не экспонирует пептиды на своей поверхности. Степень связывания фаговых клонов определяли по уровню сигнала связывания данного клона в ИФА (количество физических частиц - вирио-нов - для каждого клона было одинаково).
Результаты и обсуждение
1. Оценка специфичности аффинной селекции
Сравнили два варианта процедуры иммобилизации МКА 2F5. В первом случае проводили непосредственную сорбцию небиотинилированных антител на поверхности полистирольных лунок иммунологических планшет. Во втором варианте использовали планшеты, на поверхность которых адсорбировали стрептавидин, а затем вносили антитела, конъю-гированные с биотином. Последующую процедуру аффинной селекции с 12-мерной рандомизованной библиотекой осуществляли аналогичным образом для обоих вариантов. Для анализа бактериофагов, отбираемых на пластик [3], провели три раунда аффинной селекции на пустые лунки иммунологических планшет.
После каждого раунда аффинной селекции связавшиеся с лигандом бактериофаги элюировали, как это описано в разделе «Материалы и методы». Элюат амплифицировали в клетках E. coli для последующих раундов. Во всех случаях проводили три раунда аффинной селекции с целью получения обогащения популяции фагов с целевыми последовательностями.
Степень обогащения популяции фаговых клонов определяли с помощью титрования неамплифициро-ванных бактериофагов после каждого раунда аффин-
ной селекции. Обогащение популяции вычисляли по формуле:
элюированные фаги
---• 100%.
внесенные фаги
Считается, что фоновое значение выхода бактериофагов обычно составляет 3 • 10-5% [15]; если процент выхода не превышает это значение, то обогащения фаговой популяции не происходит.
Наши результаты показали, что выход бактериофагов после третьего раунда аффинной селекции достигал 0,52, 2,15 и 1,8% (небиотинилированные, биоти-нилированные антитела и пустые лунки иммунологических планшет соответственно). Эти цифры говорят о существенном обогащении фаговой популяции во всех трех типах селекций.
2. Анализ аминокислотных последовательностей фаговых клонов после трех раундов аффинных селекций
Определение нуклеотидной последовательности встройки в отобранных фагах проводили при помощи поставляемого с фаговой библиотекой праймера. На основе данных о нуклеотидных последовательностях с использованием программ muscle и BioEdit были выравнены последовательности ДНК этого района в отобранных бактериофагах. С помощью этой же программы были выравнены и аминокислотные последовательности (табл. 1).
При сравнении аминокислотных последовательностей пептидов, экспонируемых на поверхности фаговых частиц, которые отобраны в результате аффинной селекции с небиотинилированными и биотинилированными антителами, установили, что количество пептидов, имеющих гомологию с нативным эпитопом как минимум в 3 а. о. (значимый мотив), в первом случае больше примерно в 1,7 раза (93 и 55,5% соответственно).
Возможно, причиной такого результата является большая стерическая доступность различных участков как антитела, так и сорбционных поверхностей для связывания. Как было показано в работе [8], использование стрептавидин-биотинового мостика при сорбции антитела, аффинность их связывания с антигеном снижаются.
Как уже отмечалось, МКА 2F5 узнает последовательность из 6 а.о. ELDKWA [11]. В нашем случае среди отбираемых мотивов чаще всего встречается максимально схожий с нативным эпитопом мотив из 5 а.о. LDKWA. В случае биотинилированных антител процент фагов, содержащих мотив из 5 а.о., составил 53,9% от количества целевых бактериофагов, тогда как для небиотинилированных антител эта величина составила 42,3%. Если учесть, что при использовании биотинилированных антител в 7,7% отбирается мотив LDRWA (в большинстве случаев замена остатка Arg на остаток Lys не влияет на взаимодействие антигена с антителом [1]), то количество бактериофагов, содержащих мотив из 5 а.о., достигает при биотинилировании антител 61,6% количества значимых бактериофагов. Этот результат может быть обусловлен тем, что при наличии стрептавидин-биотинового мостика относительная стерическая доступность антигенсвязывающего центра возрастает.
Подсчет количества фагов, содержащих мотив из 4 а.о. (LDKW или DKWA), показал, что проведение
Таблица 1
Аминокислотные последовательности имитаторов после трех раундов аффинной селекции с МКА 2F5 в сравнении с нативным эпитопом 2F5
частота (в %) встречаемости аминокислотных пептидах на N-конце белка pill 12-mer фаговой библиотеки
Таблица 2 остатков в пептидной
Нативный эпитоп 2F5 gp160 QELLELDKWASLWNWFNITNWLW Ами-нокис-лотный остаток 12-mer библиотека, расчетное значение* 12-mer библиотека, наблюдаемое значение** МКА 2F5 небио-тинилиро-ванные Пластик иммунологических планшет
МКА ими татор количество последовательность
2F5 небиотини- Nbl 8 HNHAALDKWATY Gly 6,2 2,6 4,2 7,3
лированное Nbl2 2 LTLDKWAHSGPN Ala 6,2 6,0 10,8 3,1
Nbl6 l TLDKWAHADWQR Val 6,2 3,9 1,7 0
Nbl4 2 YAPDKWNYLGPA Leu 9,4 9,3 7,5 3,1
Nb5 5 SMLSHDKWSGLG Ile 3,1 3,4 2,5 6,25
Nb25 l TYSMRLDKWSFI Pro 6,2 12,2 3,3 10,4
Nb8 l SKPYPLDKWGTI Met 3,1 2,6 3,3 1,0
Nb3 l NYKDEDKWAHMA Phe 3,1 3,3 1,7 3,1
Nb7 l QSHYDKWASWGF Trp 3,1 2,2 9,2 14,6
Nbl5 l ELTSPDKWSMVP Ser 9,4 10,0 6,7 8,3
Nb23 l GEMDKWVHLLRN Thr 6,2 11,1 5 7,3
Nb6 l VELPHDKWHSLT Cys 3,1 0,5 0,8 0
Nb4 l VEPDKWSSMSMG Tyr 3,1 3,6 5,8 4,2
Nbl3 l WHWNAWNWSSQQ Asn 3,1 4,6 3,3 5,2
Nb27 l DHVQHLINYRP Gln 6,2 5,1 2,5 5,2
2F5 биотинили- b9 HNHAALDKWATY Asp 3,1 2,8 9,2 1,0
рованное b30 l THLDKWAFAPFK Glu 3,1 3,1 2,5 1,0
bl l DAYLDKWAAVRS Lys 3,1 2,8 10 0
bl6 l TDDLDRWA MIKW Arg 9,4 4,7 0,8 7,3
b29 l ALSPDKWQTVHS His 3,1 6,3 9,2 10,4
b8 bl2 b22 b6 b27 bl9 bl5 b28 b20 b24 b25 bl7 bl3 b5 b4 b7 bl0
SEHLMDKWHHLF AMFDKWSHWPTP VELPHDKWHSLT YAPDKWNYLGPA QQATSHKNTFHL HWSLFRLNQLGL DALEGNVQM*VH WHRIPTWPYTFS DPYPKTHLGSLP SLSHWLNWHRFN WHWRWTPPDHFI GMGLHPSTNTN VQCVNCATSYTS WHYPYKLFYTNA TPMHFHITQARA YHKNNFHNKSLI QVYSHSHILWEL
аффинной селекции с применением небиотинилиро-ванных антител дает 15,4% количества значимых бактериофагов. Проведение этой процедуры с биотини-лированными антителами давало 7,7% (0%, если не брать во внимание мотив LDRWA).
Процент бактериофагов, содержащих последовательность, которая имеет гомологию с нативным эпитопом в 3 а.о. DKW, в случае небиотинилированных антител составил 50%, а биотинилированных 38,5%
Примечание. * - ожидаемое количество случайных образцов, рассчитанное по схеме для каждого кодона (NNK) = количество кодонов для аминокислоты/32 кодона • 100%; ** - по данным (Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit/New England BioLabs).
значимых бактериофагов, что также можно объяснить повышением стерической доступности антигенсвя-зывающего центра.
3. Анализ аминокислотных последовательностей клонов, полученных после селекции на пустые лунки иммунологических планшет
На следующем этапе работы стояла задача охарактеризовать бактериофаги, которые неспецифически отбираются на сорбционную поверхность (в нашем случае - пластик иммунологических планшет). При анализе клонов установили, что пептиды, отобранные на пластик иммунологических планшет, содержат большое количество остатков Trp, мало Met, Asp, Glu и не содержат остатков Val, Cys, Lys (табл. 2). Такая работа необходима для дискриминации специфических клонов от неспецифических, с тем чтобы исключить из исследования клоны, отобранные на поверхности иммунологических планшет.
Результаты сравнения аминокислотных последовательностей фаговых клонов, полученных при селекции на пластике и антителах 2F5, представлены в табл. 3. В случае использования как небиотинилированных, так и биотинилированных антител достаточно редко, но отбираются пептиды, аминокислотные последовательности которых совпадают с таковыми пептидов, отобранных на пластик. Следует отметить, что при использовании небиотинилированных антител 2F5
Таблица 3
Результаты сравнения аминокислотных последовательностей клонов, полученных при селекции на МКА 2F5 и пустых плашках
Небиотинилирован- Биотинилирован- Пластик
ные 2F5-антитела ные 2F5-антитела
WHWNAWNWSSQQ QQATSHKNTFHL WHWNAWNWSSQQ (2)
DHVQHLINYRP whriptwpytfs whriptw pytfs (2)
HWSLFRLNQLGL GIGRGLRYTSPT
DALEGNVQM*VH IIGGQPHLWRHH
DPYPKTHLGSLP NGLIPEMARDGM
SLSHwLNwHRFN FPWHHHSRTPYP
wHwRWTPPDHFI
GMGLHPSYTNTN
VQCVNCATSYTS
wHYPYKLFYTNA
TPMHFHITQARA
YHKNNFHNKSLI
QVYSHSHILWEL
количество таких пептидов меньше. Таким образом, включение процедуры аффинной селекции на пустые плашки позволяет дискриминировать бактериофаги, связывающиеся с сорбционной поверхностью.
При сравнительном анализе последовательностей пептидов в отобранных фагах при разных способах иммобилизации антител отметили различие количества пептидов, не имеющих гомологии с нативным эпитопом (см. табл. 3). В случае, когда антитела сорбировались непосредственно на пластик, количество таких последовательностей достигало 7% общего количества отобранных пептидов. При этом половина из них имела полную гомологию с последовательностями, отобранными на пластик. Если сорбция антител
31 2,52- г: 1,5-
проходила через предварительное биотинилирование и стрептавидиновую модификацию поверхности планшет, количество фагов, не имеющих гомологии с нативным эпитопом, составило 44,5%, из них у пятой части (7,7%) присутствовала полная гомология с последовательностями пептидов, отобранных на пластик.
Эти результаты можно объяснить различной стери-ческой доступностью поверхности пластика со стреп-тавидином и без него. В случае отсутствия стрептави-дина доминирующим объектом связывания являются сами антитела, поэтому процент фагов, отбирающихся на участки без антител, мал (7%). Во втором случае появляются дополнительные лиганды, доступные для взаимодействия бактериофагам библиотеки. Это и может служить причиной отбора большого количества фагов с последовательностями, не имеющими гомологии с исходным эпитопом.
4. Подтверждение реактивности фаговых клонов с антителом 2F5
Результат анализа последовательностей фагов, связавшихся с антителом, и последовательность фагов, связавшихся с пластиком, подтверждается результатами ИФА.
Оценку связывания фагов с лигандом проводили с помощью ИФА по двум параметрам. Во-первых, определили количество фагов, связывающихся с антителом. Так, в случае биотинилирования антител количество связавшихся фаговых клонов, имеющих положительный сигнал в ИФА, достигает 13 (55,5% общего количества), в то время как для небиотинили-рованных - 26 (93%) (см. рисунок).
Второй параметр, по которому оценивали связывание фагов с лигандом, - степень связывания. Как видно из рисунка, у бактериофагов, несущих пептиды, которые не имеют сходства с мотивом ELDKWA (Nb13, Nb27, b27, b28, b25, b17, b13), выявлен уровень связывания, сопоставимый с контролем - бактериофагом, не экспонирующим чужеродный пептид (phage). Это подтверждает, что данные бактериофаги отобраны на другие лиганды, а не являются имитаторами эпитопа 2F5.
Следует отметить, что при использовании биотинилированных антител степень связывания целевых бактериофагов в среднем выше, чем при применении небиотинилированных антител, на 32,6%. В случае же небио-тинилированных антител наблюдался больший разброс в уровне связывания. Примечательно, что наибольшую степень связывания показывают бактериофаги, несущие последовательности, совпадающие на 4-5 а.о. с нативным эпитопом. Бактериофаги с совпадением в 3 а.о. показывают различные уровни связывания: от наименьшей для nb4 до наибольшей для b 16.
Как показывают наши данные, поверхность планшета является мишенью для связывания бактериофагов, что необходимо учитывать при процедуре аффинной селекции и отбора целевых пептидных последовательностей. Это позволяет отсеять связавшиеся с сорб-
-0,5Jn
СП СМ СО (О ю ю
- i- Я Я ■о - Z
z те
„ J3
СО О 1- СО 00 С\1 см <п п т- л т-п п л л л
N О Ю S О (D см см см а
п п п п п п
Взаимодействие отобранных бактериофагов с МКА 2F5 в ИФА.
В качестве отрицательного контроля (phage) взят фаг M13, который не экспонирует на своей поверхности пептид. Буквами и цифрами указаны номера клонов из табл. 1, несущих пептиды, которые представлены на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки. По оси абсцисс - наименование фаговых клонов; по оси ординат - оптическая
плотность (405 нм).
ционной поверхностью фаги и сэкономить время и материалы при проведении последующих манипуляций. Кроме того, результаты нашего исследования продемонстрировали, что использование биотинилированных МКА 2F5 приводит к уменьшению количества специфически связавшихся фаговых клонов, однако данные клоны обладают большим уровнем связывания. Таким образом, решение о биотинилировании антител должно приниматься в каждом конкретном случае самим исследователем в зависимости от поставленных задач. Если же требуется отобрать пептидные последовательности, обладающие наибольшей специфичностью связывания с антителами (к примеру, для отбора диагностических пептидов), предпочтительно, по нашему мнению, использовать небиотинилированные антитела для аффинной селекции. А для получения большого разнообразия пептидов, но с разной специфичностью, целесообразно производить биотинилирование.
Сведения об авторах: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Щербакова Н.С. - научн.сотр. отдела иммуноте-рапевтических препаратов, e-mail: [email protected], Чикаев А.Н. - стажер-исследователь отдела имму-нотерапевтических препаратов,
Карпенко Л.И. - зав. лабораторией разработки средств иммунопрофилактики,
Ильичев А.А. - зав. отделом иммунотерапевтиче-ских препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ерошкин А. М. // Молекул. биол. - 1988. - Т. 2. - C. 635-644.
2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. - М., 1984.
3. AdeyN., Mataragnon A., Rider J. et al. // Gene. - 1995. - Vol. 156. -P. 27-31.
4. Amin N., Aguilar A., Chamacho F. et al. // Malaysian J. Med. Sci. -2009. - Vol. 16. - P. 4-14.
5. Böttger V., Böttger A. // Meth. Mol. Biol. - 2009. - Vol. 524. - P. 181-201.
6. Casey J., Coley A., Parisi K. et al. // Protein Eng. Des. Sel. - 2009. -Vol. 22. - P. 85-91.
7. Fack F., Hügle-Dörr B., Song D. et al. // J. Immunol. Meth. - 2009. - Vol. 206. - P. 43-52.
8. Huyer-Hansen G., HamersM. J. A. G., Pedersen A. N. et al. // J. Immunol. Meth. - 2000. - Vol. 235. - P. 91-99.
9. Knittelfelder R., Riemer A., Jensen-Jarolim E. // Expert Opin. Biol. Ther. - 2009. - Vol. 9. - P. 493-506.
10. LiuN., Wu G., LiH. et al. // Int. Immunopharm. - 2009. - Vol. 9. - P. 291-297.
11. Parker C., Deterding L., Hager-Braun C. et al. // J. Virol. - 2001. -Vol. 69. - P. 6609-6617.
12. Peluso P., Wilson D., Do D. et al. // Anal. Biochem. - 2003. - Vol. 312. - P. 113-124.
13. Scholle M., Collart F., Kay B. // Prot. Expr. Purific. - 2004. - Vol. 37. - P. 243-252.
14. Scott J., Smith G. // Science. - 1990. - Vol. 249 - P. 386-390.
15. Scott J., Craig L. // Curr. Opin. Biotechnol. - 1994. - Vol. 5. - P. 40-48.
16. Smith G. // Science. - 1990. - Vol. 228. - P. 1315.
17. SongaH., Luo W., Chena Y. // Vet. Microb. - 2010. - Vol. 145. - P. 17-22.
18. Wallmann J., Epstein M., Singh P. et al. // Clin. Exp. Allergy. - 2010. - Vol. 40. - P. 650-658.
Поступила 16.06.11
THE IMPACT OF THE ANTIBODY 2F5 BIOTINYLATION ON THE SELECTION OF THE PEPTIDES FROM COMBINATORIAL PHAGE LIBRARY
N. S. Shcherbakova, A. N. Chikaev, L. I. Karpenko, A. A. Ilichev
State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia
The impact of monoclonal antibodies (mAb) biotinylation on the output and the repertoire of selected peptides in the biopanning procedure were tested. A comparative analysis of the peptides selected from phage library using the biotinylated and non-biotinylated mAb 2F5 was performed. It was shown that the output of peptides homologous to the native epitope was 1.7-fold higher for biotinylated antibodies, whereas the binding capacity of the selected phages with mAb 2F5 in ELISA was higher in the case of using non-biotinylated antibodies. It should be noted that the phages exposing peptides, which have 4-5 amino acid sequence similarity with the native epitope, demonstrate the highest binding affinity. The phages that expose peptides with 3 amino acid sequence similarity demonstrate different binding affinity: from the smallest to the largest. Based on the obtained data, it is safe to suggest that the rational biopanning may proceed in accordance with the task.
Key words: phage-peptide display, mAb 2F5, biotinylation of antibodies
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.852.12:579.222].083.1
О. А. Смоленцева, Д. Р. Яруллина, О. Н. Ильинская
индукция синтеза ш у лактобацилл в условиях стресса
Кафедра микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета
Установлено, что увеличение биосинтеза оксида азота (NO) в клетках Lactobacillus plantarum 8Р-А3 происходит при сильном стрессовом воздействии, сопровождающемся значительным снижением жизнеспособности микробных клеток: нагревании при 70 и 80°C, продолжительном культивировании, токсическом действии гексилрезорцина. Факторы, не вызывающие гибель клеток, такие как прогревание при 60°C, гомосеринлактон в концентрации 50 мкг/мл и экзогенная рибонуклеаза Bacillus intermedius 7P в концентрации до 300 мкг/мл, не индуцируют синтез NO. Активация биосинтеза NO в ответ на стрессовые воздействия свидетельствует в пользу универсальности ключевых механизмов стресс-ответа клеток различного уровня организации и важной роли в них NO.
Ключевые слова: оксид азота (NO), Lactobacillus plantarum, высокотемпературный стресс, гомосеринлактон, гексилрезорцин, рибонуклеаза Bacillus intermedius 7P (биназа)
Биосинтез оксида азота (NO) в клетках лактобацилл осуществляется по альтернативному пути NO-синтазной денитрификации (NOS) [12], подобно тому, как это происходит у ряда грамположительных бактерий [17] и в клетках эукариот [15]. Консервативность NOS-подобных белков в процессе эволюции предполагает универсальность физиологических функций NO.
Наряду с такими многочисленными функциями, как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, реакция иммунной системы, регуляция тонуса гладких мышц, состояние памяти и др. [15], сигнальная молекула NO играет важную роль
