CC BY
56
Том 150, кн. 2
Естественные науки
2008
УДК 573.663
ВЛИЯНИЕ БАЗАЛЬНОГО УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SERRATIA MARCESCENS НА СТАБИЛЬНОСТЬ И КОПИЙНОСТЬ ПЛАЗМИД pHISNUCSMA В РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММАХ ESCHERICHIA COLI
О.А. Гимадутдинов, Е.В. Крякунова, Р.Г. Хамидуллина, Б.И. Барабанщиков
Аннотация
В работе были определены активности мутантных нуклеаз Serratia marcescens при базальном уровне экспрессии их генов, находящихся в плазмиде pHisNucSma. Установлена обратная корреляция между элиминацией плазмид pHisNucSma и активностью эндонуклеаз S. marcescens при базальном уровне экспрессии их генов. Показано, что чем выше уровень активности мутантных эндонуклеаз S. marcescens, тем выше устойчивость рекомбинантных штаммов к ампициллину. Выявлена корреляция между уровнем устойчивости к ампициллину, активностью Р-лактамазы и количеством копий плазмид pHisNucSma в рекомбинантных штаммах E. coli TGE900.
Ключевые слова: эндонуклеаза, Р-лактамаза, плазмида, элиминация плазмид, ко-пийность плазмид.
Введение
В настоящее время методы генетической инженерии применяются для решения широкого круга задач в области молекулярной биологии и биотехнологии. Одной из таких задач, наиболее часто реализуемой на практике, является создание на основе технологии рекомбинантной ДНК штаммов, обладающих способностью синтезировать в большом количестве необходимый белок. Такой сверхсинтез может осуществляться в результате как повышения дозы гена, так и увеличения его транскрипционной активности [1]. Векторная ДНК придает клетке-хозяину новые свойства, дающие ей селективные преимущества. Однако репликативный синтез плазмидной ДНК, сверхсинтез продукта чужеродного гена являются дополнительной метаболической нагрузкой для клетки-хозяина [2], поэтому в неселективных условиях плазмида может элиминировать из клетки. В связи с этим для поддержания высокого уровня генной экспрессии чужеродной ДНК очень важной является проблема стабильности вектора.
Эндонуклеаза Serratia marcescens в последние годы находит широкое применение в биохимических исследованиях, молекулярной биологии, медицине и сельском хозяйстве. Возрастающие потребности в препарате вызывают необходимость в исследованиях, направленных на получение новых сверхпродуцентов этого фермента и изучение его свойств [3, 4]. Фермент может быть использован для деградации ДНК и РНК, очистки белков, может служить моделью
для исследования механизмов транспорта белков из клетки во внеклеточную среду у грамотрицательных бактерий [5].
Для некоторых представителей семейства родственных нуклеаз показано участие в процессах, включающих размножение праймеров для репликации митохондриальной ДНК посредством более предпочтительного расщепления GC-богатых последовательностей, содержащихся в транскриптах консервативной последовательности block II (CSBII) в участке D-петли mtDNA и в области перед митохондриальным геном tRNAPhe в случае бычьей нуклеазы EndoG [6], репарации и рекомбинации ДНК в случае Nucl [7] и, по-видимому, трофическую функцию для внеклеточных нуклеаз Anabaena sp. и Serratia marcescens. Внеклеточная эндонуклеаза S. marcescens обладает избирательностью расщепления отдельных фосфодиэфирных связей в молекуле субстрата. Как в одноце-почечной, так и в двуцепочечной ДНК в первую очередь расщепляются GC-бо-гатые районы, а последовательности, обогащенные АТ-парами, разрушаются с гораздо меньшей скоростью [8]. ДНК/РНК гибриды, в свою очередь, являются лучшими субстратами вероятно потому, что нити ДНК в гибридном дуплексе проявляют общую А-подобную конформацию [9].
Цель настоящей работы - определить влияние базального уровня экспрессии эндонуклеазы Serratia marcescens на стабильность и копийность плазмид pHisNucSma в клетках рекомбинантных штаммов Escherichia coli.
1. Материалы и методы
1.1. Объекты исследования. В работе были использованы штаммы Escherichia coli TGE900 и LK111A, несущие плазмиды pHisNucSmaHis89Ala, pHisNucSmaArg57Ala и pHisNucSmawt. В этих плазмидах мутантные варианты генов эндонуклеазы Serratia marcescens находятся под контролем Рь-промотора фага X, а транскрипционная активность регулируется термочувствительным С1 -репрессором (рис. 1) [4].
Р - promoter
f,ori
Рис. 1. Конструкция плазмиды pHisNucSma
1.2. Питательные среды. Для выращивания штаммов микроорганизмов использовались жидкая и твердая ЬБ-среды [11].
Для создания селективных условий при культивировании рекомбинантных штаммов в ЬБ-среду вносили ампициллин в концентрации 150 мкг/мл.
Плазмидная ДНК выделялась из клеток штаммов ЬК111Л по стандартной методике [11].
Для проведения электрофореза использовалась 1%-ная агароза в трис-бо-ратном буфере, рН 8.0 [12].
Компетентные клетки бесплазмидного штамма E. coli TGE900 получали по методике [13].
Для трансформации клеток-хозяев использовали метод теплового шока [14].
Для индукции генов эндонуклеазы ночную культуру клеток, выращенную при 30 °С на LB-агаре, высевали в 10 мл LB-бульона и инкубировали 4-5 ч при 30 °С, после чего температуру культивирования повышали до 42°С и инкубировали в течение 2 ч. Затем отбирали 1 мл культуры, осаждали центрифугированием, надосадок удаляли, а к осадку добавляли 50 мкл буфера для нанесения проб и кипятили в течение 8 мин на кипящей водяной бане.
Разделение белков проводили по стандартной методике [12].
1.3. Элиминация плазмид с помощью этидиум бромида. К 4.9 мл LB-
бульона добавляли 0.1 мл свежеобновленной культуры, выращенной в LB-буль-оне, и этидиум бромид в концентрациях 50 и 200 мкг/мл. После 18-часового инкубирования бактерий при 28 °С делали высевы по 0.1 мл культуры из разных разведений на чашки с LB-агаром. Параллельно производили высевы культуры, не обработанной элиминирующим агентом. Выросшие отдельные колонии перекалывали на чашки с LB-агаром с добавлением ампициллина в концентрации 125 мкг/мл. Об элиминации судили по потере клетками признака устойчивости к ампициллину.
1.4. Определение активности неспецифических нуклеаз с помощью индикаторного агара. Индикаторная среда готовилась по методике, предложенной Майсс с соавт. [15].
К 100 мкл пробы, отобранной до начала лизиса культуры, добавляли 10 мкл лизата, отобранного через 10 мин после начала лизиса. Лизис клеток проводили лизоцимом в концентрации 0.2 г/мл при температуре 37 °С. На чашки с индикаторной средой наносились 10 мкл пробы и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Активность нуклеазы на индикаторной среде определяли по формуле:
A = пг2, (1)
где А - активность нуклеазы; r - радиус зоны с измененной окраской индикаторной среды.
1.5. Определение уровня резистентности к антибиотику. В чашки Петри заливали LB-агар с градиентом антибиотика. Засевали на следующий день петлей с культурой клеток по направлению к максимальной концентрации антибиотика. Инкубировали в течение ночи при 28 °С.
0.1 мл культуры в стационарной фазе роста, разведенной в физиологическом растворе (4-103 - 6-103 бактериальных клеток), высевали на LB-агар, содержащий различные концентрации ампициллина (± 500 мкг/мл от точки прекращения роста на чашках). За уровень резистентности принимали минималь-
ную концентрацию антибиотика, при которой не происходило видимого роста через 18-20 ч инкубирования при 28 °С [16].
1.6. Определение активности Р-лактамазы. Культуру клеток выращивали в течение 18 ч при 28 °С в 50 мл LB-бульона. В качестве контроля были взяты клетки бесплазмидных штаммов TGE900. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 25 мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл буфера TES следующего состава: 0.1 М NaCl; 10 мМ трис-HCl; 1 мМ ЭДТА; рН 7.8 и доводили оптическую плотность образцов на ФЭК до величины А530 = 0.18. Отбирали 10 мл и разрушали клетки с помощью лизоцима в концентрации 0.2 г/мл при 37 °С в течение 1 ч. Затем к полученной вязкой субстанции добавляли ДНКазу в концентрации 0.1 мкг/мл и выдерживали 30 мин при 37 °С до исчезновения вязкости.
Йодометричесоке титрование проводилось по методике, предложенной С. Перрет[17].
Р-лактамазную активность рассчитывали по формуле:
х = (V - V2)'kT10'd, (2)
F- 60-2-1
где x - условные единицы активности Р-лактамазы; V - количество 0.01 н. раствора гипосульфита натрия, пошедшего на титрование в контрольном опыте, мл; V2 - количество 0.01 н. раствора гипосульфита натрия, пошедшего на титрование исследуемого раствора, мл; k - поправка 0.01 н. раствора гипосульфита натрия (1); Т - теоретическая активность натриевой (1667 ед/мл) или калиевой (1600 ед/мл) солей бензилпенициллина; d - степень разведения основного раствора, содержащего Р-лактамазу; F - количество 0.01 н. раствора йода, поглощаемого 1 мг бензилпенициллина (для натриевой соли - 2.26, для калиевой соли - 2.15), мл; множитель «10» - коэффициент разведения исходной суспензии объемом 1 мл, к которой добавлено 9 мл раствора бензилпенициллина; множитель «60» - количество единиц пенициллина, инактивируемого 1 ед. пеницил-линазы за 60 мин при 37 °С; множитель «2» - количество испытуемого раствора, взятого для испытания, мл; множитель «1» - объем раствора, взятого для определения активности в 1 мл.
2. Результаты и обсуждения
С развитием техники рекомбинантной ДНК и выяснением механизмов регуляции активности генов появилась возможность создавать генноинженерные конструкции, содержащие структурные гены донора ДНК и регуляторные последовательности из генома реципиента, что способствует эффективной экспрессии структурных генов в гетерологичной системе клетки [18]. Но даже в отсутствие индуктора существует определенный базальный уровень выражения гена, он может быть ниже (в присутствии большего количества белка-репрес-сора) или выше (если количество белка-репрессора уменьшено) среднего ба-зального уровня [19].
В качестве клетки-хозяина при создании рекомбинантных штаммов широко используется бактерия Escherichia coli. Ее генетическая система хорошо изуче-
на на молекулярном уровне, она легко идентифицируется, обладает высокой скоростью роста. Кроме того, Е. coli способна секретировать чужеродные белки во внешнюю среду [20].
2.1. Введение плазмидной ДНК в клетки Escherichia coli методом трансформации. Экспериментально доказано, что в процессе плазмидной трансформации E. coli критическую роль играет состояние липидов мембраны клеток [14]. Фазовый переход липидов мембраны из двухслойной в гексагональную конформацию происходит во время температурного шока клеток и сопровождается поглощением экзогенных двуцепочечных молекул ДНК [21]. Показано, что при тепловом шоке (быстрое нагревание от 0 до 37 °C) поглощение ДНК продолжается лишь в течение 20 с [14]. Если после нагревания смесь клеток и ДНК снова охладить до 0 °С, то в процессе индуцируемого фазового перехода липидов молекулы ДНК смогут опять проникать в клетки, при этом время проникновения ДНК продолжительнее. Выявленные фазовые переходы липидов приводят к нарушению структуры внешней мембраны, но практически не затрагивают цитоплазматическую мембрану [22].
На первом этапе трансформации экзогенная ДНК независимо от ее природы связывается с компетентными клетками, по-видимому, на определенных ре-цепторных участках поверхности бактерии [23]. Для этого фрагмент ДНК вначале прикрепляется к клетке немногими точками, большая часть ДНК остается свободной. Затем происходит нарезание молекулы ДНК на фрагменты, обусловленное действием особой эндонуклеазы, требующей для своей работы наличие ионов магния [24]. После этого одна цепь молекулы ДНК разрушается, а другая проникает в клетку, гидролизуясь с концов [25].
Культура E. coli обладает различной способностью к трансформации в разные периоды роста. В самом начале и конце роста культуры трансформантов почти не возникает. Наибольшее их число образуется, если берут клетки в середине-начале логарифмической фазы роста [18].
Клетки штамма E. coli TGE900, чувствительные к ампициллину и не обладающие нуклеазной активностью, трансформировались плазмидами pHisNucSmaHis89Ala, pHisNucSmaArg57Ala и pHisNucSmawt, которые содержат гены эндонуклеазы S. marcescens, кодирующие ферменты с различной активностью. В этих генах замена гистидина в положении 89 на аланин (His89Ala) в гене эндонуклеазы Serratia marcescens делает белок дефектным по каталитической функции. При замене аргинина в положении 57 на аланин (Arg57Ala) ферментативная активность белка понижается на 65% [10]. Данные плазмидные ДНК были ранее выделены из рекомбинантных штаммов E. coli LK111A, в которых промотор гена эндонуклеазы является неиндуцибельным в отличие от штаммов TGE900. Для доказательства наличия плазмидной ДНК в полученных образцах был проведен электрофорез (рис. 2).
В результате клонирования трех вариантов плазмид, несущих экспресси-рующиеся на базальном уровне гены эндонуклеазы S. marcescens с разными активностями, нами были отобраны клоны, которые приобрели устойчивость к ампициллину. В качестве контроля была проведена трасформация бесплазмид-ного штамма E. coli TGE900 физиологическим раствором, не содержащим ДНК.
12 3 4
Рис. 2. Электрофоррограмма плазмидной ДНКpHisNucSma, взятой для трансформации: 1 - маркер нуклеиновых кислот фирмы Fermentas 1 kb DNA Ladder; 2 - плазмидная ДНК рекомбинантного штамма E. coli LK111Ä pHisNucSmaHis89Ala; 3 - плазмидная ДНК рекомбинантного штамма E. coli LK111Ä pHisNucSmaArg57Ala; 4 - плазмидная ДНК рекомбинантного штамма E. coli LK111Ä pHisNucSmawt
2.2. Доказательства введения плазмидной ДНК в клетки E. coli. Существует несколько методов доказательства введения чужеродной ДНК в клетку, основанных на изменении свойств штамма-хозяина. В данной работе были использованы следующие методы: индукция синтеза эндонуклеазы под действием температуры с последующим электрофоретическим разделением белков и элиминация плазмид.
2.2.1. Индукция синтеза эндонуклеазы S. marcescens под действием температуры. Так как температурочувствительный белок-репрессор С1 инактиви-руется при повышенной температуре, проводилась индукция экспрессии гена эндонуклеазы S. marcesens под действием температуры. Как видно из рис. 3, индукция под действием температуры приводит к значительному увеличению синтеза внеклеточной эндонуклеазы. Известно, что в результате такой индукции выход очищенного белка нуклеазы составляет более 30 мг из 1 л культураль-ной жидкости. В результате такого сверхсинтеза нуклеазы белок переходит в нерастворимую форму, образуя связанные с мембранами агрегаты [4].
При температуре инкубации 28 °С у всех рекомбинантных штаммов не наблюдалось индукции синтеза эндонуклеазы S. marcescens. Максимальный уровень индукции синтеза эндонуклеазы S. marcescens достигается при температуре инкубации рекомбинантных штаммов 42 °С. Это подтверждается данными электрофоретического анализа белков культуральной жидкости рекомбинант-ных штаммов E. coli. Как видно из рис. 3, после индукции при температуре 42 °С у рекомбинантных штаммов значительно увеличивается количество белка в зоне, соответствующей положению белка эндонуклеазы (29 kDa), тогда как у неин-дуцируемых рекомбинантных штаммов такого увеличения не наблюдается.
2.2.2. Элиминация плазмид с помощью этидиум бромида. Для выяснения того, насколько стабильно данная плазмида наследуется в ряду клеточных поколений, а также для доказательства того, что изменения в уровне резистентности к антибиотику у рекомбинантных штаммов не связаны с мутациями самого штамма-хозяина или с транспозицией гена устойчивости из плазмиды в хромосому, необходимо показать, что вместе с утратой плазмиды происходит и утрата способности расти на средах с ампициллином. Для этого нами проводилась
[Ша]
=5 В
Я
- -
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 3. Электрофоррограмма белков, выделенных из рекомбинантных штаммов E. coli TGE900 до и после индукции гена эндонуклеазы: 1 - белки-стандарты "Merck IV"; 2 -белки из E. coli TGE900 pHisNucSmaHis89Ala (нет индукции); 3 - белки из E.coli TGE900 pHisNucSmaHis89Ala (индукция); 4 - белки из E. coli TGE900 pHisNucSmaArg57Ala (нет индукции); 5 - белки из E. coli TGE900 pHisNucSmaArg57Ala (индукция); 6 - белки из E. coli TGE900 pHisNucSmawt (нет индукции); 7 - белки из E. coli TGE900 pHisNucSmawt (индукция)
элиминация плазмид pHisNucSma из рекомбинатных штаммов E. coli TGE900 при помощи этидиум бромида.
Сущность метода элиминации заключается в том, что с помощью специальных агентов штаммы бактерий исцеляются от плазмиды и приобретают свои исходные свойства [26]. Общий принцип действия этих агентов (в нашем случае EtBr) заключается в том, что они нарушают распределение плазмидных копий ДНК между дочерними клетками, ингибируя начало репликации, что ведет к тому, что часть из них оказывается лишенной плазмиды.
Как известно, origin-сайты, ответственные за начало репликации ДНК, богаты АТ-парами и образуют В-форму ДНК. Интеркаляция молекулы EtBr в origin-сайт должна привести к изменению угла между плоскостью оснований и осью двойной спирали ДНК, что индуцирует переход из В-формы в А-форму ДНК, характерную для GC-богатых последовательностей [27]. По-видимому, ДНК-топоизомеразы, работа которых необходима для инициации репликатив-ного синтеза, не опознают топологически измененную область origin, что ведет к ингибированию процесса начала репликации плазмид и к нарушению передачи их копий из родительских клеток в дочерние.
Известно, что эндонуклеаза S. marcescens предпочтительно расщепляет А-форму ДНК по сравнению с В-формой [8]. Возможно, что нуклеаза разрезает область origin, модифицированную бромистым этидием в А-форму, тем самым заменяя инициирующее репликацию действие ДНК-топоизомеразы.
Как видно из данных, представленных в табл. 1, обработка этидиум бромидом приводит к снижению выживаемости бактерий. Выжившие клетки анализировали на потерю маркера устойчивости к ампициллину. Из табл 2 видно, что с увеличением концентрации этидиум бромида происходит увеличение процента элиминации, однако у рекомбинантного штамма E. coli TGE900 pHisNucSmaHis89Ala утрата плазмид происходит с более высокой частотой,
Табл. 1
Выживаемость рекомбинантных штаммов E. coli под действием этидиум бромида
Штамм Концентрация EtBr, мкг/мл Выживаемость, %
0 100
TGE900 pHisNucSmaHis89Ala 50 27.33
200 1.36
0 100
TGE900 pHisNucSmaArg57Ala 50 2.15
200 0.04
0 100
TGE900 pHisNucSmawt 50 1.35
200 0.006
Табл. 2
Элиминация плазмид из клеток E. coli TGE900 под действием этидиум бромида
Штамм Концентрация EtBr, мкг/мл Утрата устойчивости
к Amp, %
0 57.7
TGE900 pHisNucSmaHis89Ala 50 100
200 100
0 12
TGE900 pHisNucSmaArg57Ala 50 20
200 68
0 7
TGE900 pHisNucSmawt 50 9
200 28
чем у двух других штаммов. Плазмиды pHisNucSmaArg57Ala элиминируют с меньшей частотой, чем плазмиды pHisNucSmaHis89Ala, но с большей по сравнению с плазмидами pHisNucSmawt. Это, по-видимому, можно объяснить следующим образом. Известно, что в популяции бактерий имеются клетки, у которых белок-репрессор С1 может быть непрочно связан с операторным участком Рь-промотора, и поэтому возможна транскрипция гена эндонуклеазы S. marce-ъсвт, находящегося под контролем Рь-промотора (базальный уровень экспрессии гена). Поскольку мутантный белок Ш889АШ не обладает нуклеазной активностью, а мутант А^57АШ имеет лишь 35%-ную активность нуклеазы по сравнению с исходным белком (дикий тип) [10], то полученные нами результаты указывают на то, что существует обратная корреляция между активностью эн-донуклеазы и элиминацией плазмид.
Идентификацию плазмидной ДНК проводили с помощью электрофореза. Как видно из рис. 4, плазмидная ДНК присутствовала только в клетках, выросших в селективных условиях, тогда как в клетках, утративших маркер устойчивости к ампициллину после действия этидиум бромида, плазмидная ДНК не была выявлена.
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 4. Электрофоррограмма плазмидной ДНК pHisNucSma: 1 - маркер нуклеиновых кислот фирмы Fermentas 1 kb DNA Ladder; 2 - плазмидная ДНК штамма E. coli TGE900 pHisNucSmaHis89Ala, выросшего в селективных условиях и не подвергшегося действию EtBr; 3 - плазмидная ДНК штамма E. coli TGE900 pHisNucSmaHis89Ala, выросшего под действием EtBr в отсутствие селектирующего фактора; 4 - плазмидная ДНК штамма E. coli TGE900 pHisNucSmaArg57Ala, выросшего в селективных условиях и не подвергшегося действию EtBr; 5 - плазмидная ДНК штамма E. coli TGE900 pHis-NucSmaArg57Ala, выросшего под действием EtBr в отсутствие селектирующего фактора; 6 - плазмидная ДНК штамма E. coli TGE900 pHisNucSmawt, выросшего в селективных условиях и не подвергшегося действию EtBr; 7 - плазмидная ДНК штамма E. coli TGE900 pHisNucSmawt, выросшего под действием EtBr в отсутствие селектирующего фактора
2.3. Определение активности неспецифических нуклеаз с помощью индикаторного агара. Определение активности неспецифических нуклеаз при базальном уровне экспрессии генов проводилось при использовании индикаторной среды, содержащей краситель толуидиновый голубой и полимерную ДНК [15]. В зависимости от уровня активности нуклеазы площадь изменения окраски индикаторной среды, образующаяся вокруг точки нанесения пробы, будет различаться: чем больше площадь изменения окраски, тем выше активность фермента. В основе обесцвечивания среды лежит специфическая реакция толуиди-нового голубого на изменение рН, сопровождающее гидролиз ДНК нуклеазой.
Как видно из рис. 5, нуклеазная активность присутствует лишь в лизате клеток тех штаммов (TGE900 pHisNucSmawt и TGE900 pHisNucSmaArg57Ala), которые несут плазмиды с геном нуклеазы дикого типа (100%-ная активность нуклеазы) и с геном нуклеазы с 35%-ной активностью, о чем свидетельствует наличие розовой зоны вокруг места нанесения пробы. Причем размер зоны напрямую зависит от уровня активности нуклеазы: розовое пятно вокруг места нанесения лизата клеток, несущих плазмиды с геном эндонуклеазы дикого типа, значительно крупнее, чем у мутанта с частичной (35%) активностью нук-леазы (плазмида pHisNucSmaArg57Ala). Отсутствие розовой зоны на месте нанесения лизата клеток TGE900 pHisNucSmaHis89Ala и TGE900 говорит об отсутствии нуклеазной активности, что соответствует мутантной форме нуклеазы, имеющей нулевую активность данного фермента, и бесплазмидному штамму.
Активность нуклеаз в рекомбинантных штаммах E. coli TGE900 pHisNucSmaArg57Ala и pHisNucSmawt определяли по формуле (1). Нуклеазная активность, показанная перечисленными выше штаммами на индикаторной среде, составляет 100% для нуклеазы дикого типа и 36% для мутанта Arg57Ala, что соответствует литературным данным [10, 28].
Рис. 5. Базальный уровень экспрессии генов мутантных эндонуклеаз на индикаторной среде: 1 - TGE900pHisNucSmaHis89Ala; 2 - TGE900pHisNucSmaArg57Ala; 3 - TGE900 pHisNucSmawt; 4 - TGE900
2.4. Определение уровня резистентности к антибиотику и активности ß-лактамазы в рекомбинантных штаммах E. coli. Известно, что устойчивость бактериальных клеток к ампициллину (пенициллину) обусловлена ß-лактамаза-ми (пенициллиназами), расщепляющими ß-лактамное кольцо антибиотика. Ген bla, детерминирующий синтез ß-лактамазы, входит в состав хромосом, некоторых транспозонов и плазмид [29].
В ряде работ было показано, что существует связь между дозой гена, обусловливающего устойчивость к ампициллину и его экспрессией, то есть обнаружена линейная зависимость между устойчивостью к ампициллину и синтезом фермента и между синтезом фермента и копийностью гена bla [30]. Показано также, что увеличение числа копий плазмид сопровождается повышением уровня резистентности к ампициллину [31]. Таким образом, изменение уровня устойчивости к антибиотику и активности ß-лактамазы может служить косвенным доказательством изменения количества ее генов. Для проверки вышесказанного проводилось определение активности ß-лактамазы и уровня резистентности к ампициллину для рекомбинантных штаммов E. coli TGE900, несущих плаз-миды pHisNucSma. Результаты экспериментов приведены в табл. 3.
Для того чтобы выяснить, коррелирует ли изменение уровня резистентности к антибиотику с изменением активности ß-лактамазы, проводили измерение активности фермента йодометрическим методом, основанном на способности продуктов гидролиза ß-лактамных антибиотиков восстанавливать йод до йодида, вызывая обесцвечивание йодокрахмального комплекса [32]. ß-лактамазная активность выражается в условных единицах активности и рассчитывается по формуле (2). За единицу активности принимается наименьшее количество пени-циллиназы (ß-лактамазы), способной инактивировать 10-7 М бензилпенициллина или 59.3 ед. пенициллина за 1 ч при 37 °С в фосфатном буфере, рН 6.8-7.0, при наличии в растворе достаточного количества пенициллина [17]. В качестве ре-ференс-плазмиды с известным числом копий была взята плазмида рАР42 : Tn1.
Табл. 3
Зависимость между устойчивостью клеток к ампициллину, активностью ß-лактамазы и копийностью плазмид pHisNucSma в рекомбинантных штаммах E. coli TGE900
Уровень резистент- Активность ß-лак- Количество
Плазмида ности к ампицилли- тамазы (в условных копий
ну, мкг/мл ед., 2-105 кл) плазмиды
pAP42 : Tn1 500 114.8 1-2
pHisNucSmaHis89Ala 1000 350.365 3-4
pHisNucSmaArg57Ala 13000 4191.74 40
pHisNucSmawt > 15000 10842.49 100
Как видно из табл. 3, клетки E. coli, несущие плазмиду рАР42 : Tn1, растут на среде с ампициллином в концентрации не более 500 мкг/мл, штамм E. coli TGE900 pHisNucSmaHis89Ala устойчив к концентрации антибиотика 1000 мкг/мл, штамм E. coli TGE900 pHisNucSmaArg57Ala - к концентрации 13000 мкг/мл, и наиболее резистентный к ампициллину штамм E. coli TGE900 pHisNucSmawt - к концентрации, большей 15000 мкг/мл. У референс-плазмиды число копий составляет 1-2 на клетку, что соответствует наименьшей активности ß-лактамазы (114.8 ед.). У штамма, несущего плазмиду pHisNucSmaHis89Ala, уровень ß-лактамазной активности составил 350.365 ед., что соответствует 3-4 копиям плазмиды (из расчета около 100 ед. активности на 1 копию). У штамма E. coli TGE900pHisNucSmaArg57Ala активность ß-лактамазы составила 4191.74 ед., что соответствует приблизительно 40 копиям. Активность ß-лактамазы у клеток, несущих плазмиду pHisNucSmawt, составляет 10842.49 ед., то есть эти клетки несут около 100 копий плазмиды.
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что существует прямая зависимость уровня устойчивости клеток к ампициллину от количества копий плазмиды, несущей ген bla, в клетке: антибиотикорезистентность тем выше, чем больше копийность плазмиды. Наблюдается также увеличение копий-ности плазмиды с увеличением активности нуклеазы, ген которой экспрессиру-ется на базальном уровне: копийность у плазмид с геном эндонуклеазы дикого типа выше, чем у плазмид, несущих ген неактивной нуклеазы. Как уже было отмечено ранее, эндонуклеаза S. marcescens в первую очередь расщепляет GC-богатые районы, образующие А-конформацию ДНК, характерную для ДНК-РНК-гибридов, а последовательности, обогащенные АТ-парами, разрушаются с гораздо меньшей скоростью [8]. Возможно, нуклеаза S. marcescens инициирует репликацию как плазмиды, так и хромосомы, заменяя действие РНКазы Н, разрезающей РНК в ДНК/РНК-гибриде в точке начала репликации с образованием 3'-конца, который используется в качестве затравки для синтеза ДНК.
В заключение можно сделать вывод, что базальный уровень экспрессии гена эндонуклеазы с большей активностью фермента приводит к увеличению уровня устойчивости к ампициллину, активности ß-лактамазы, количества плазмид-ных копий. При этом наблюдается более стабильное наследование плазмид, несущих ген нуклеазы дикого типа, чем у мутантных аналогов.
Summary
O.A. Gimadutdinow, E.V. Kriakounova, R.G. Khamidullina, B.I. Barabanschikov. Influence of the Basal Level of Serratia marcescens Endonuclease Expression on Stability and Copy Number of pHisNucSma Plasmids in Recombinant Escherichia coli Strains.
The present work determines the activities of mutant Serratia marcescens nucleases by basal expression level of their genes situated in the pHisNucSma plasmid. Invert correlation between elimination of pHisNucSma plasmids and activity of the S. marcescens nuclease was established at the basal level of their genes' expression. It was shown that the higher an activity level of the mutant S. marcescens nuclease, the higher ampicillin resistance. The correlation between ampicillin resistance level, ß-lactamase activity, and plasmid copies amount in recombinant E. coli strains was also revealed.
Key words: endonuclease, ß-lactamase, plasmid, plasmid elimination, plasmid copy number.
Литература
1. Gribskov M., Burgess R.R. Overexpression and purification of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase // Gene. - 1983. - V. 26, No 2. - P. 109-118.
2. Goldwin D., Stater J.N. The influence of the grouth on the stability of a drug resistance plasmid in Escherichia coli K-12 // J. Gen. Microbiol. - 1979. - V. 111. - P. 201-209.
3. Biederman K., Jepsen P.K., Riise E. et al. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease activity // Carlsberg Rec. Commun. - 1989. - V. 54. - P. 17-21.
4. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Ruter T., Wende W., Urbanke C., Thole H., PingoudA. A procedure for renaturation and purification of the extracellular Serratia marcescens nuclease from genetically engineered Escherichia coli // Protein Expr. Purif. - 1994. -V. 5, No 1. - P. 37-43.
5. Jepsen P.K., Riise E., Biedermann K., Kristensen P.Ch.R., Emborg C. Two-level factorial screening for influence of temperature, pH and aeration on production of Serratia marcescens nuclease // Appl. Envirom. Microbiol. - 1987. - V. 53, No 10. - P. 25932596.
6. Ruiz-Carillo A., Côté J. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G // Science. - 1993. - V. 261. - P. 765-769.
7. Dake E., Hoffman T. Purification and properties of the major nuclease from mitohondria of Saccharomyces cerevisiae // Biol. Chem. - 1988. - V. 263. - P. 7691-7702.
8. Meiss G., Friedhoff P., Hahn M, Gimadutdinow O., Pingoud A. Sequence preferences in cleavage of dsDNA and ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease // Biochemistry. - 1995. - V. 34, No 37. - P. 11979-11988.
9. Gyi J.I., Conn G.L., Lane A.N., Brown T. Comparison of the thermodynamic stabilities and solution conformations of DNA.RNA hybrids containing purine-rich and pyrimidine-rich strands with DNA and RNA duplexes // Biochemistry. - 1996. - V. 35, No 38. -P. 12538-12548.
10. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Pingoud A. Identification of catalytically relevant amino acids of the extracellular Serratia marcescens endonuclease by alignment-guided muta-genesis // Nucl. Acids Res. - 1994. - V. 22, No 16. - P. 3280-3287.
11. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. - N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1982. - 560 p.
12. Westermeier R. Elektrophorese Praktikum. - Weinheim, Germany: Wiley-VCH, 1990. -98 S.
13. Chung C.T., Niemala S.L., Miller R.H. One step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution // Proc. Natl. Acad. Scie. USA. - 1989. - V. 86, No 7. - P. 2172-2175.
14. Van Die I.M., Bergmans H.E.N., Hoekstra W.P.M. Transformation in Escherichia coli: studies on the role of the heat shock in induction of competence // J. Gen. Microbiol. -1983. - V. 129, No 3. - Р. 663-670.
15. Meiss G., Gimadutdinow O., Friedhoff P., Pingoud A. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonucleases. Review. No abstract available // Methods Mol. Biol. - 2001. - V. 160. - P. 37-48.
16. Barth P.T., Richards H., Datta N. Copy number of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. - 1978. - V. 135, No 3. - P. 760-765.
17. Perret C.J. Iodometric assay of penicillinase // Nature (London). - 1954. - V. 174, No 4439. - Р. 1012-1013.
18. Щелкунов С.Н. Клонирование генов. - Новосибирск: Наука, 1986. - 232 с.
19. Льют Б. Гены / Пер. с англ. - М.: Мир, 1987. - 544 с.
20. Yanagida N., Uozumi T., Berru T. Specific excretion of Serratia marcescens protease through the membrane of Escherichia coli // J. Bacteriol. - 1986. - V. 166, No 3. -Р. 937-944.
21. Van Die I.M., OosterhoutA., Bergmans H.E.N., Hoekstra W.P.M. The influence of phase transition of membrane lipids on uptake of plasmid DNA in Escherichia coli transformation // FEMS Microbiol. Lett. - 1983. - V. 18. - Р. 127-130.
22. Bergmans H.E., van Die I.M., Hoekstra W.P. Transformation in Escherichia coli: stages in the process // J. Bacteriol. - 1981. - V. 146, No 2. - Р. 564-570.
23. Garcia E., Lopez P., Perez UrenaM.T., EspinosaM. Association between DNA and surface structures in the B. subtilis transformation system // Proc. 4th Eur. Meet. Bacter. Transform and Transfect. - Oxford, 1979. - Р. 103-111.
24. Dubnau D. Genetic transformation in Bacillus subtilis // Molecular Biology of the Bacilli. V. 1. Bacillus subtilis / Ed. D. Dubnau. - N. Y.: Academic Press, 1982. - Р. 147178.
25. Te Riele H.P.J., Venema G. Molecular fate of heterologous bacterial DNA in competent Bacillus subtilis: Further characterization of unstable association between donor and recipient DNA and the involvement of the cellular membrane // Mol. Gen. Genet. - 1984. -V. 195, No 1-2. - Р. 200-208.
26. Tomas M., Kay W. A simple and rapid method for the elimination of R plasmids from enteric bacteria // Current Microb. - 1984. - V. 11, No 3. - Р. 155-158.
27. Fuller W., Waring M.J. A molecular model for the interaction of ethidium bromide with deoxyribonucleic acid // Ber. Bunsen Ges. Phys. Chem. - 1964. - V. 68. - Р. 805-808.
28. Friedhoff P., Kolmes B., Gimadutdinow O., Wende W., Krause K.L., Pingoud A. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis // Nucl. Acids Res. - 1996. - V. 24, No 14. - Р. 2632-2639.
29. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. - М.: Боргес, 2002. - 381 с.
30. Uhlin B., Nordström K. R plasmid gene dosage effects in Escherichia coli K-12: ^py mutants of the R plasmid R1drd-19 // Plasmid. - 1977. - V. 1, No 1. - P. 1-7.
31. Ely S., Staudenbauer W.L. Regulation of plasmid DNA synthesis: Isolation and characterization of copy number mutant of mini R6-5 and miniF plasmids // Mol. Gen. Genet. -1981. - V. 181, No 1. - Р. 29-35.
32. Livermore D.M. Mechanisms of resistance to P-lactam antibiotics // Scand. J. Infect. Dis. -1991. - V. 78, Suppl. - Р. 7-16.
Поступила в редакцию 12.11.07
Гимадутдинов Олег Александрович - кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики Казанского государственного университета.
E-mail: [email protected]
Крякунова Елена Вячеславовна - аспирант кафедры генетики Казанского государственного университета.
Хамидуллина Раиса Гусмановна - кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики Казанского государственного университета.
Барабанщиков Борис Иванович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики Казанского государственного университета."
