CC BY
39
БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 612.592.3.019:59
ВЛИЯНИЕ АЦЕТАМИДА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МОЗГА КРЫС
ПРИ ГИПОТЕРМИИ
© 2010 г. З.Г. Рабаданова, Р.Г. Абдурахманов, И.С. Мейланов
Дагестанский государственный университет, Dagestan State University,
ул. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, 367025, Gadjiev St., 43a, Makhachkala, 367025,
[email protected] [email protected]
Исследована зависимость спектральной плотности и распределения биопотенциалов электрокортикограммы крысы от температуры тела при общей гипотермии. Охлаждение организма приводит к индукции тэта-ритма, частота которого уменьшается вслед за снижением температуры тела. Ацетамид снижает критическую температуру, при которой электрокортикограмма становится плоской.
Ключевые слова: гипотермия, электрокортикограмма, спектральная плотность, температурная зависимость, крысы, ацетамид.
Temperature dependence of spectral density and biopotentials distribution in rat's electrocorticogramm (ECoG) at whole body hypothermia and following rewarming were studied. Cooling induces theta-rhythm whose frequency decreases according to lowering of body temperature. Intraperito-nially injection of acetamide before cooling decreases critical body temperature at which ECoG becomes flat.
Keywords: hypothermia, electrocorticogram, spectral density, temperature dependence, rat, acetamide.
Умеренная гипотермия (33-31 °С) оказывает ней-ропротективное действие при гипоксических и ише-мических состояниях мозга и используется в хирургии при операциях на сердце и мозге [1]. В то же время гипотермия (в особенности глубокая) может приводить к неврологическим нарушениям [2]. Механизм защитного действия умеренной гипотермии не вполне ясен. Гипотермия снижает электрическую активность мозга, потребление кислорода его тканью, проницаемость гематоэнцефалического барьера, образование свободных радикалов, выделение экситотоксических нейротрансмиттеров [3]. Снижение электрической активности мозга при гипотермических состояниях, возможно, является ключевым фактором её защитного действия при ишемических состояниях. Однако механизм подавления электрической активности мозга при снижении температуры тела не выяснен. В связи с этим нами предпринято исследование зависимости электрокортикограммы (ЭКоГ) крыс от температуры тела при общем охлаждении организма.
Методика исследования
Опыты проведены на 10 белых беспородных крысах-самцах весом 140-180 г, содержавшихся на обычном рационе в условиях вивария. Половина животных служила контролем, а 5 другим перед охлаждением вводили ацетамид в дозе 0,003 М (177 мг) на 100 г веса тела. Все опыты проведены под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг живого веса). Охлаждение животных производили посредством обкладки туловища полиэтиленовыми пакетами с битым льдом. Температуру тела измеряли с помощью ртутного термометра в
прямой кишке. По достижении температуры, при которой ЭКоГ становится плоской (критическая), охлаждение прекращали и начинали согревание, подложив под тело животного грелку с теплой водой. Общее время охлаждения до ректальной температуры 20 °С -1,5 ч, время согревания до 36 °С - примерно столько же. При этих скоростях изменения температуры тела разность между температурой мозга и ректальной -0,5^1,0 °С. Регистрация ЭКоГ осуществлялась бимодально с помощью нихромовых ^=0,3 мм) электродов, вживлённых в соматосенсорную область коры головного мозга. Сигнал с регистрирующих электродов через усилитель биопотенциалов УБП1-02 (полоса частот от 0 до 10 кГц) подавался на аналого-цифровой преобразователь Ь-780 фирмы Ь-СаМ. Частота оцифровки 500 Гц. Время сбора данных 33 с (16500 точек). Результаты хранились в электронном виде и обрабатывались с помощью пакета 8ТАТ18Т1-СА. Анализировались спектральная плотность и гистограмма распределения биопотенциалов ЭКоГ.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 приведены ЭКоГ при различных температурах тела животного. Тиопенталовый наркоз в дозе 40 мг/кг веса тела существенно подавляет терморегуляцию у крыс. Поэтому при комнатной температуре 22^23 °С ректальная температура тела животного уже снижена до 36^35 °С и ниже. Первая запись ЭКоГ соответствует этой температуре. Ее снижение с помощью охлаждающих мешков со льдом подавляет электрическую активность мозга. При ректальной температуре примерно 20^18 °С ЭКоГ становится
плоской [4]. При этом частота сердечных сокращений составляет 1^2 с1, дыхание редкое, но ритмичное. Дальнейшее снижение температуры резко увеличивает риск летального исхода, поэтому температура, при которой ЭКоГ становится плоской, является критической. При согревании животных после достижения критической температуры электрическая активность мозга восстанавливается. Однако имеет место гистерезис: первые признаки электрической активности при согревании появляются при температуре более высокой (24-26 °С), чем температура, при которой она прекратилась. Величина гистерезиса может составлять 10 °С и более. Причём чем ниже критическая температура, тем сильнее гистерезис (разность между критической температурой и температурой восстановления электрической активности) [4]. Гистерезис, возможно, вызван отёком мозга при глубокой гипотермии, так как температура мозга несколько отстаёт от ректальной температуры при согревании крыс [4].
°С
-^Aw^/vywifyyiw^
Рис. 1. ЭКоГ крысы для различных температур тела при охлаждении и последующем согревании. Масштаб по вертикали 400 мкВ, по горизонтали - 1 с, справа указана ректальная температура
На рис. 2 показана типичная картина частотного распределения спектральной плотности ЭКоГ при различных температурах тела при общей гипотермии и последующем согревании. Значительная доля спектральной плотности локализована в диапазоне частот 0^10 Гц. Это обусловлено тем, что животное находится под наркозом. Высокочастотные колебания подавлены. При исходной высокой (36 °С) температуре тела в этом диапазоне частот спектр почти сплошной, причём доминируют низкие частоты. Охлаждение животного до ректальной температуры 33^31 °С существенно изменяет картину спектральной плотности: появляется пик, соответствующий частоте 5-7 Гц. Теперь большая доля спектральной плотности прихо-
дится на эту полосу частот. Согласно принятой классификации, это диапазон тэта-ритма [5]. Дальнейшее снижение температуры тела приводит к смещению этой полосы в низкочастотную область. В диапазоне температур 30^20 °С величина коэффициента Вант-Гоффа р10 для температурной зависимости частоты тэта-ритма составила 2,5±0,3, что соответствует обычным значениям температурной зависимости биологических процессов.
°С
Рис. 2. Частотная зависимость спектральной плотности ЭКоГ крыс при охлаждении и согревании. По оси абсцисс - частота, Гц, по оси ординат - спектральная плотность, % от общей плотности в диапазоне от 0 до 10 Гц, принятой за 100 %.
Кривые смещены по вертикали для наглядности
Таким образом, снижение температуры тела привело к синхронизации электрической активности нейронов коры мозга. Чувствительность различных нейронов коры мозга к снижению температуры не одинакова. Поэтому при снижении температуры ткани мозга происходит селективное выключение нейронов. Об этом свидетельствуют гистограммы распределения биопотенциалов. При высоких температурах тела (36 °С) гистограмма распределения биопотенциалов ЭКоГ близка к нормальному распределению (рис. 3а). Это связано с тем, что ЭКоГ является результатом суммирования активности большого числа нейронов. По мере снижения температуры тела отклонение от нормальности распределения увеличивается, что указывает на уменьшение числа нейронов, дающих существенный вклад в ЭКоГ (рис. 3б), выявляя неоднородность их популяции. При согревании животного распределение биопотенциалов вновь приближается к нормальному (рис. 3в), что свидетельствует о постепенном восстановлении активности всё большего числа нейронов.
Рис.3. Гистограммы распределения биопотенциалов ЭКоГ крысы. а - перед охлаждением при температуре тела 36 °С; б - при охлаждении до температуры тела 19 °С; в - после согревания до температуры тела 36 °С. По оси абсцисс -разность потенциалов, мкВ, по оси ординат - частота встречаемости данного значения разности потенциалов в ЭКоГ. Сплошная линия соответствует ожидаемому нормальному распределению
Резкое изменение картины спектральной плотности при температуре тела 33 ^31 °С - индукция тэта-ритма, возможно, свидетельствует об аресте (блокаде) ионных каналов наиболее чувствительных к дефициту энергии нейронов головного мозга как защитной реакции на снижение мозгового кровотока при гипотермических состояниях. Это явление (арест ионных каналов) имеет место у пресмыкающихся в условиях гипоксии и анок-сии [6]. Защитное действие гипотермии при ишемии мозга объясняют снижением потребности нейронов в энергии при низкой температуре ткани мозга [7]. Однако по какой причине снижается потребность мозга в энергии при гипотермии до конца неясно. Можно предположить, что снижение температуры ткани экс-
поненциально снижает скорость производства адено-зинтрифосфорной кислоты (АТФ) в ней. Если электрическая активность линейно зависит от производства АТФ в клетке, то вслед за снижением синтеза АТФ последует соответствующее снижение интенсивности электрической активности мозга, а это в свою очередь снизит потребности мозга в энергии. Но в этом случае в неявной форме предполагается, что именно производство энергии в клетке определяет интенсивность энергетического метаболизма, а не наоборот. Это действительно имело бы место, если бы энергетические механизмы всегда работали на пределе своих возможностей. Но тогда была бы невозможна регуляция энергетического обмена. Совершенно ясно, что именно уровень физиологической активности должен определять уровень энергетического метаболизма. Следовательно, гипотермия должна сначала подавить электрическую активность нейронов, чтобы снизить потребность этих клеток в энергии, а это уже приведёт к снижению потребления кислорода и энергетических субстратов мозгом. Интенсивность физиологической работы мозга определяется потребностями организма. Электрографически интенсивность работы мозга проявляется в явлениях синхронизации/десинхронизации. Чем интенсивней работа мозга, тем выше частота колебаний на ЭКоГ и тем меньше амплитуда этих колебаний, и напротив, снижение активности проявляется в уменьшении частоты и увеличении амплитуды колебаний.
Тот факт, что частота доминирующей полосы спектральной плотности плавно смещается вслед за изменением температуры тела, говорит о том, что по мере снижения температуры тела не происходит смены пейсмейкера, т.е. это смещение отражает температурную зависимость частоты, генерируемой пейсмейке-ром. Относительно того, в какой области мозга находится первичный генератор тэта-ритма, не существует определённого ответа. Предполагается, что основной генератор находится в подкорковых ядрах (таламус), откуда идут проекции в вышележащие корковые структуры [5]. Подкорка - эволюционно более древняя структура и поэтому более устойчива к экстремальным воздействиям (гипоксия, гипотермия). Это отчасти может быть обусловлено тем, что гликолиз играет более важную роль в энергетическом обеспечении подкорковых структур, так как гликолиз - более древний (анаэробный) метаболический путь по сравнению с окислительным фосфорилированием. Для выяснения механизма генерации электрических колебаний мозгом предлагаются различные математические модели. Ясно, что физический механизм, генерирующий стабильные колебания, должен представлять собой динамическую систему с фазовым портретом, содержащим предельный цикл. В [8] рассматриваются различные модели возникновения колебаний в нервной системе позвоночных, которые предсказывают различную зависимость частоты импульсации нейронов от управляющих параметров модели. Возможно, температурная зависимость тэта-ритма отражает температурную зависимость какого-то критического параметра. Главными детерминантами частоты пейсмейкера являются кинетические характеристики ионных каналов нейронов, определяющих частоту импульсации. Температурная
а
б
в
зависимость этих характеристик, видимо, и определяет температурную зависимость тэта-ритма. В связи с этим уместно отметить, что исследование электроэнцефалограммы у джунгарских хомяков во время суточного оцепенения показало, что частота тэта-ритма у них также смещается в область низких частот по мере снижения температуры тела (естественная гипотермия) [9, 10]. Авторы этой работы считают, что температурная зависимость частоты тэта-ритма определяется температурной зависимостью активности №Д-насоса, для которого Ql0 в диапазоне температур 37^- 22 °С также составляет примерно 2,5. Известно, что №Д-насос электрогенен, поскольку за один рабочий цикл 3 иона переносит в экстраклеточное пространство, а внутрь закачивает только 2 [11]. Поэтому от скорости работы ионного насоса зависит скорость реполяризации мембраны и, соответственно, длительность рефрактерного периода. При снижении температуры активность насоса уменьшается, а это может влиять на длительность потенциала действия и рефрактерного периода. Однако величина этого эффекта не может быть слишком большой. Вклад тока, генерируемого насосом, в потенциал покоя кардиоцитов составляет примерно 10 % [11].
Ещё в 1967 г. Э.С. Гершенович с сотр. [12] обнаружили, что внутрибрюшинное введение мочевины крысам приводит к существенному повышению их выживаемости при глубокой гипотермии. Кроме того, животные могли держать позу даже при температуре тела 10 °С. Естественно было предположить, что электрическая активность мозга тоже сохраняется при более низкой температуре тела. В связи с этим нами было исследовано влияние мочевины и её аналогов на электрическую активность мозга при гипотермии [4]. Было показано, что мочевина и некоторые родственные ей соединения, в том числе и ацетамид, снижают критическую температуру, при которой ЭКоГ становится плоской. Ацетамид отличается от мочевины заменой одной аминогруппы в молекуле мочевины на метильную группу. Возможно, поэтому он лучше проникает через гемато-энцефалический барьер. В той же дозе, что и мочевина, ацетамид существенно снижал критическую температуру [4]. На рис. 4 приведены ЭКоГ при различных температурах тела при введении ацетамида в дозе 3 мМ/100 г веса тела. Как и в [4], ацетамид снизил критическую температуру ЭКоГ (20-18 °С в контроле, 16-14 °С при введении ацетамида). На фоне введения ацетамида, как и в контроле, при низких температурах тела в ЭКоГ начинает доминировать тэта-ритм. Однако это также наблюдается при более низких температурах тела (рис. 5). Гистограммы распределения биопотенциалов в ЭКоГ при введении ацетамида существенно не отличаются от их распределения в контроле. Механизм влияния мочевины и её аналогов на электрическую активность мозга остаётся неизвестным. Осмотическая гипотеза могла бы объяснить снижение критической температуры при сверхглубокой гипотермии, поскольку при температуре тела 20 °С ионный насос, по-видимому, не может справиться с пассивной проницаемостью мембран нейронов. Однако повышение активности при введении мочевины и её аналогов при более вы-
соких температурах тела, когда отёк ещё не достиг значительной величины, видимо, имеет иную природу. Кроме того, глубокая гипотермия достигается за довольно продолжительный период времени (примерно 90 мин). За это время осмотические градиенты должны уже диссипировать. Одной из возможных причин понижения критической температуры может быть влияние ацетамида на активность ионных каналов, формирующих потенциалы покоя и потенциалы действия, или на активность Na^-АТФ. Исследование in vitro могло бы прояснить этот вопрос.
32 28 26
Vvл^MгvVvД/\AA/^^Vw^-vj'^v^/y 24
3J
Рис. 4. ЭКоГ крысы при охлаждении и последующем согревании при введении ацетамида в дозе 3 мМ/100 г веса тела
t, °C
32
25
26 24
22 19 17
16 19 21
23 23 27 30 35
О 1
10
Рис. 5. Спектральные плотности ЭКоГ крысы при охлаждении и последующем согревании при введении ацетамида в дозе 3 мМ/100 г веса тела
Литература
1. Therapeutic effect of post-ischemic hypothermia duration on
cerebral ischemic injury / H. Zhang [et al.] // Neurol. Res. 2008. Vol. 30. P. 332-336.
2. Mallet M.L. Pathophysiology of accidental hypothermia
// Q.J. Med. 2002. Vol. 95. P. 775-785.
3. Liu L., Yenari M.A. Therapeutic hypothermia: neuroprotec-
tive mechanisms // Frontiers in Bioscience. 2007. Vol. 12. P. 816-825.
4. Абдурахманов Р.Г., Мейланов И.С. Вызванные потен-
циалы в мозгу крыс при гипотермии на фоне введения мочевины и её аналогов // Научная мысль Кавказа.
2001. Спецвыпуск. С. 119-126.
5. Buzsaki G. Theta oscillations in the hippocampus // Neuron.
2002. Vol. 33. P. 325-340.
6. Hochachka P. Defense strategies against hypoxia and hypo-
thermia // Science. 1986. Vol. 231. P. 234-241.
Поступила в редакцию
7. Sakoh M, Gjedde A. Neuroprotection in hypothermia linked
to redistribution of oxygen in brain // Am.J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. Vol. 285. Р. 17-25.
8. Ermentrout B. Neural Oscillators. Tutorials in Mathematical
Biosciences. Mathematical Neuroscience. Berlin, 2005. P. 69-106.
9. Deboer T., Tobler I. Temperature dependence of EEG fre-
quencies during natural hypothermia // Brain Res. 1995. Vol. 670. P. 153-156.
10. Deboer T. Electroencephalogram theta frequency changes in
parallel with euthermic brain temperature // Brain Res. 2002. Vol. 930. P. 212-215.
11. Glitsch H.G. Electrophysiology of the Sodium-Potassium-
ATPase in cardiac cells // Physiol. Rev. 2001. Vol. 81(4). P. 1791 -1826.
12. Мочевина и амиды в метаболизме мозга в нормальных и
экстремальных условиях существования. Биохимия и функции нервной системы / З.С. Гершенович [и др.]. Л., 1967. С. 90-96.
6 ноября 2009 г.
