CC BY
61
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10006 УДК 612.826.4
Ключевые слова: антагонист кисспептиновых рецепторов р-234, поведение, нейропептиды Key words: kisspeptin p-234 receptor antagonist, behavior, neuropeptides
Ткачева М. А., Инюшкина Е. М., Шарафутдинова А. Ю., Анцырев Я. А., Инюшкин А. Н.
ВЛИЯНИЕ АНТАГОНИСТА КИССПЕПТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ Р-234 НА ПОВЕДЕНИЕ КРЫС В ТЕСТАХ «ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ», «ТЕМНО-СВЕТЛАЯ
КАМЕРА» И «ЛАБИРИНТ БАРНС»
KISSPEPTIN P-234 RECEPTOR ANTAGONIST INFLUENCE AT BEHAVIOR OF RATS IN TESTS "OPENFIELD", "DARK-LIGHTCAMERA" AND "LABIRINTHBARNS"
ФГАОУ ВО «Самарский национальный исследовательский университет им. академика С.П. Королева» Адрес: 443086, Россия, г. Самара, Московское ш., д. 34 Samara National Research University named after S.P. Korolev, Federal State Educational Institution of Higher Education
Address: 443086, Russia, Samara, Moskovskoe highway, 34
Ткачева М.А., учебный мастер кафедры физиологии человека и животных. E-mail: [email protected]. Тел. +7 (906) 125-76-69 Tkacheva M.A., Study Master of the Dept. of Animal and Human Physiology. E-mail: [email protected]. Tel. +7 (906) 125-76-69 Инюшкина Е.М., доцент кафедры физиологии человека и животных. E-mail: [email protected]. Тел. +7 (902) 324-49-14 In'ushina E.M., Associate Professor of the Dept. of Animal and Human Physiology.
E-mail: [email protected]. Tel. +7 (902) 324-49-14 Шарафутдинова А.Ю., аспирант кафедры физиологии человека и животных. E-mail: [email protected]. Тел.+7 (927) 026-80-48 Sharafutdinova A.Yu., Post-Graduate Student of the Dept. of Animal and Human Physiology. E-mail: [email protected]. Tel. + 7 (927) 026-80-48 Анцырев Я.А., бакалавр кафедры физиологии человека и животных. E-mail: [email protected]. Тел. +7 (937) 645-60-14 Antcyrev Y.A., Bachelor of the Dept. of Animal and Human Physiology. E-mail: [email protected]. Тел. +7 (937) 645-60-14 Инюшкин А.Н., д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии человека и животных. E-mail: [email protected]. Тел. +7 (908) 390-97-10 In'ushin A.N., Doctor of Biology Science, Professor, Head of the Dept. ofAnimal and Human Physiology. E-mail: [email protected]. Tel. +7 (908) 390-97-10
Аннотация. Недавно открытый эндогенный пептид кисспептин является регулятором репродукции. Поскольку в реализации эффектов кисспептина центральную роль играют GRP-54 рецепторы, целью настоящей работы на самцах крыс было исследование влияния интраназального введения специфического антагониста этих рецепторов р-234 (0,1 мМ) на показатели поведения в стандартных тестах «Открытое поле», «Темно-светлая камера» и «Лабиринт Барнс». В поведенческой установке «Открытое поле» после введения антагониста кисспептиновых рецепторов выявлено снижение медианы показателя «Длительный груминг», в установке «Темно-светлая камера» обнаружено увеличение количество подъемов на задние лапы и заходов в темный отсек. Данные изменения поведения свидетельствуют о стимуляции некоторых аспектов исследовательского поведения в условиях блокады кисспептиновых рецепторов, причем эти реакции реализуются через рецепторы GPR-54.
Summary. The newly discovered endogenous neurochemical regulator kisspeptin is a reproduction regulator. Since GRP-54 receptors play a central role in realizing effects of kisspeptin, the purpose of this work at male rats was to study specific p-234 receptor antagonist (0.1 mM) intranasal injection effect on behavioral indicators in standard tests "Open Field", "Dark - Light camera" and "Labyrinth Barnes". The indicator "Long grooming" decreasing was found after kisspeptide receptors antagonist injection in behavioral installation "Open Field", increasing in the number of hind legs and hikes into dark camera was detected in installation "Dark - Light Camera". These behavioral changes suggest the stimulation of certain aspects of exploratory behavior under kisspeptin receptors block, and these reactions are realized through GPR-54 receptors.
Введение
В настоящее время не подвергается сомнению ключевая роль гипоталамической секреции гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) в контроле репродуктивной функции у млекопитающих. В то же время при изучении нейронной сети ГнРГ клеток в начале 90-х годов были обнаружены особенности, позволяющие говорить о её функциональной ограниченности. В частности, у крыс в этих клетках не было обнаружено экспрессии специфического эстрогеннового альфа-рецептора, что предполагало существование промежуточного пути передачи сигнала обратной связи от гонад. Основой для революционного пересмотра существовавших представлений о нейроэндокринной регуляции репродукции у млекопитающих и человека послужило открытие нового эндогенного регулятора - нейропептида кис-спептина. В 1996-м г. был идентифицирован ген KISS1 [7]. В 1999-м г. был открыт его рецептор, ассоциированный с G-протеи-ном, и соответствующий ген на Ch19p13, а в 2001-м г. был охарактеризован белковый продукт гена KISS1R [6, 8]. Первое время после открытия кисспептина он носил название «метастин», и его изучали в качестве эндогенного ингибитора метастатической активности опухолей. Впервые догадки о том, что кисспептин может участвовать в процессах эндокринной регуляции репродукции, возникли в связи с обнаружением экспрессии кисспептиновых рецепторов KISS1R в плаценте, аденогипофизе и гипоталамусе. Кисспептиновая сигнализация играет исключительную роль в активации секреции ГнРГ. Уровень продукции ГнРГ, в свою очередь, определяет выраженность влияния последнего на переднюю долю гипофиза. Данное влияние включает в себя регуляцию продукции лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Эти гонадотропные гормоны стимулируют половое созревание и га-метогенез.
В соответствии с принципом плейотроп-ности, характерным для подавляющего большинства нейропептидов, наряду с участием в центральных механизмах контроля
фертильности и репродукции, кисспептин вовлечен в регуляцию других физиологических функций. В частности, доказано участие кисспептина в регуляции гомеостаза энергии на уровне аркуатного ядра, при этом данный пептид активно взаимодействует с лептином [9]. Имеются данные о том, что экспрессия гена Kiss1 в гиппокампе лежит в основе участия кисспептина в регуляции когнитивных функций и эпилептогенеза [1]. Однако роль и механизмы участия кисспеп-тина в регуляции поведения пока практически не исследованы. Имеются лишь отдельные указания на возможное участие этого пептида в регуляции памяти и исследовательского поведения [4].
В ходе настоящей работы изучали влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на исследовательское поведение и уровень тревожности у самцов крыс вистар в стандартных тестах «Открытое поле», «Темно-светлая камера» и «Лабиринт Барнс».
Материалы и методы
Все экспериментальные протоколы были согласованы и одобрены комиссией по биологической этике Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева. Было исследовано по 6 животных контрольной и экспериментальной группы крыс самцов вистар (массой 240-270 г). До и во время эксперимента все животные содержались в виварии биологического факультета Самарского университета и получали пищу и питьевую воду ad libitum. Животные содержались в условиях суточного режима освещения (свет/темнота) 12:12 ч. Экспериментальным животным интраназально в объёме 10 мкл и в концентрации 0,1 мМ вводили антагонист кисспептиновых рецепторов р-234. Вещество вводили троекратно (в течение трёх последовательных суток) в первую половину циркадианного дня в ZT=2-6 (ZT=0 соответствует моменту включения освещения при световом режиме 12:12 часов). Контрольной группе крыс вводили интрана-зально воду для инъекций в объёме 10 мкл в соответствии с графиком для эксперимен-
8
тальной группы. Экспериментальная методика интраназального введения веществ даёт возможность их быстрого проникновения непосредственно в головной мозг в значительной концентрации вдоль обонятельных и тройничных нервов, минуя ге-матоэнцефалический барьер [5]. При этом вводимое вещество практически не попадет в кровоток [2], что дает возможность изучать центральные эффекты изолированно от периферических, возникающих при системном введении. Через 15 мин после интрана-зального введения антагониста кисспепти-на крысу помещали в установку «Открытое поле», «Тёмно-светлая камера» или «Лабиринт Барнс» и в течение 10-ти мин производили видеорегистрацию поведения. Для регистрации перемещений животных осуществляли видео-трекинг с использованием камеры Panasonic fullhd hc-x810, установленной на штатив. Регистрация и первичная статистическая обработка исследуемых параметров поведения производилась с помощью программы ANY-maze 4.99. Последующая обработка данных производилась с использованием программы Sigma-Plot 12.5. Для оценки различий исследуемых показателей в ходе экспериментальных воздействий использовали t-тест или тест Манна-Уитни. Нормальность распределения данных в выборках проверяли с помощью теста Левена. Статистические данные о значениях параметров, соответствующих нормальному распределению, были представлены как средние арифметические ± стандартные ошибки среднего. Изменения исследуемых параметров считались статистически значимыми при р<0,05.
В тестовой методике «Открытое поле» были зарегистрированы следующие характеристики поведения: количество посещенных квадратов, исследование отверстий, обнюхивание, длительный груминг (умывание области глаз с заведением лап за уши и переходом на умывание всей головы, лап, боков, туловища, ано-генитальной области, хвоста). В тесте «Тёмно-светлая камера» регистрировали количество заходов в темный отсек, количество подъемов на задние лапы. В тестовой методике «Лабиринт Барнс»
регистрируемыми параметрами были: груминг, обследование ложных убежищ, время нахождения истинного убежища, обнюхивание отверстий, число вертикальных стоек, седация.
Результаты исследований
В исходном состоянии исследуемые показатели поведения в стандартных тестах у животных контрольной и экспериментальной групп не различались (Р>0,05).
В поведенческой установке «Открытое поле» в условиях интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 были получены следующие данные. Изменений количества посещённых квадратов обнаружено не было (Р>0,05). Было выявлено снижение медианы количества актов длительного груминга (Р=0,021, рис. 1).
У животных контрольной и экспериментальной групп не было обнаружено статистически значимых различий значения параметра «Исследование отверстий» и параметра «Обнюхивание» (Р>0,05).
В поведенческой установке «Темно-светлая камера» при интраназальном введении 0,1 мМ антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 были получены следующие данные.
Количество заходов в тёмный отсек у животных экспериментальной группы оказалось большим, чем у животных контрольной группы (р=0,002, рис. 2).
Контроль Антагонист р-234
Рис. 1. Влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведенческий параметр «Длительный груминг».
9
Рис. 2. Влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведенческий параметр «Количество заходов в тёмный отсек».
Рис. 3. Влияние интраназального введения антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 на поведенческий параметр «Количество подъемов на задние лапы».
Одновременно после интраназального введения антагониста увеличилось количество подъемов на задние лапы по сравнению с контролем (Р=0,034, рис. 3).
В поведенческой установке «Лабиринт Барнс» при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 не были обнаружены статистически значимые изменения поведенческих параметров. Сравнение параметров «Обследование ложных убежищ», «Количество вертикальных стоек», «Обнюхивание отверстий», «Седа-ция» не выявило различий между контрольной и экспериментальной группами животных (Р>0,05). Время нахождения истинного убежища также не изменялось в условиях блокады кисспептиновых рецепторов, несмотря на тенденцию к увеличению (P=0,414).
Обсуждение результатов
В настоящей работе на самцах крыс выявлены основные изменения поведенческой активности животных, возникающие в условиях блокады кисспептиновых рецепторов.
В частности, в поведенческой установке «Открытое поле» при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 выявлено снижение медианы показателя «Длительный груминг», в установке «Темно-светлая камера» обнаружено увеличение количество подъемов на задние лапы и заходов в темный отсек. Данные изменения поведения свидетельствуют о стимуля-
ции некоторых аспектов исследовательского поведения в условиях блокады кисспепти-новых рецепторов. Эти данные согласуются с результатами исследования на самцах мышей с нокаутом кисспептиновых рецепторов, у которых также было обнаружено снижение уровня тревожности и стимуляция исследовательского поведения в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» [3]. В другой работе, выполненной на самках крыс, было выявлено увеличение времени поиска истинного убежища в лабиринте Барнс под действием хронической инфузии антагониста кисспептиновых рецепторов [4]. В ходе настоящей работы с интраназальным введением антагониста статистически значимых изменений данного показателя установить не удалось, несмотря на его тенденцию к увеличению. В целом полученные результаты в совокупности с данными других работ подтверждают участие элементов кисспептино-вой системы мозга в регуляции поведения. Данные настоящей работы свидетельствуют о том, что блокада центральных рецепторов кисспептина приводит к стимуляции исследовательской активности, причем эти реакции реализуются через рецепторы GPR54.
Выводы
Установлено, что антагонист кисспептиновых рецепторов р-234 при интраназальном введении самцам крыс вызывает стимуляцию исследовательского поведения.
10
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 18-34-00542 «Исследование роли антагониста кисспептина (Р-234) в регуляции биологических ритмов у крыс».
Список литературы
1. Arai A.C. The role of kisspeptin and GPR54 in the hippocampus // Peptides. 2009. № 30. Р. 16-25.
2. Born J. Sniffing neuropeptides: a transnasal approach to the human brain / J. Born, T. Lange, W. Kern [et al.] // Nat. Neurosci. 2002. №5. Р. 514-516.
3. Delmas S. Altered aspects of anxiety-related behavior in kisspeptin receptor-deleted male mice / S. Delmas, R. Porteous, D. H. Bergin [et al.] // Sci. Reports. 2018. № 8. Р. 2794.
4. Eyuboglu Dinc S. Effects of chronic infusion of kisspeptin and its antagonist on cognitive functions and behavior in female rats / S. Eyuboglu Dinc, S. Canpolat,
H. Akkaya [et al.] // Proc. Physiol. Soc. Proc 37th IUPS, PCC161. 2014. № 8. P. 373-377.
5. Frey W.H. Bypassing the blood-brain barrier to deliver therapeutic agents to the brain and spinal cord // Drug Deliv. Tech. 2002. № 2. P.46-49.
6. Lee D.K. Discovery of a receptor related to the galanin receptors / D. K. Lee, T. Nguyen, G. P. O'Neill [et al.] // FEBS Lett. 1999. № 446. P.103-107.
7. Li G. Mapping Longitudinal Development of Local Cortical Gyrification in Infants from Birth to 2 Years of Age / G. Li, L. Wang, F. Shi [et al.] // J. Neurosci. 2014. № 34. P. 4228-4238.
8. Ohtaki T. Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor / T. Ohtaki, Y. Shintani, S. Honda [et al.] // Nature. 2001. №411 (6837). P. 613-617.
9. Smith J.T. KiSS-1 neurones are direct targets for leptin in the ob/ob mouse / J.T. Smith, B.V. Acohido, D.K. Clifton [et al.] // J. Neuroendocrinol. 2006. № 18. P. 298-303.
ПРЕДСТАВЛЯЕМ КНИГУ:
«Ультразвуковое и рентгенологическое исследование брюшной полости мелких домашних животных»
Издательство: ЧОУДПО «Институт Ветеринарной
Биологии», Санкт-Петербург, 2016 Тираж: 500 экз.
Формат: 210 х 297 мм, твёрдый переплет, 760 с. с илл.
Данная монография обобщает многолетний опыт работы сотрудников Института Ветеринарной Биологии в области УЗИ и рентгенодиагностики, а также многолетний опыт проведения курсов повышения квалификации для ветеринарных специалистов по УЗИ и рентгенологии. Кроме текстовой информации, изложенной в доступной форме, книга содержит большое количество иллюстрационного материала: оригинальные схемы, облегчающие понимание сложных процессов, сканы ультразвуковых исследований, рентгеновские снимки, фотографии макро- и гистопрепа-ратов.
Одной из отличительных особенностей данного издания является то, что материал, представленный в книге, дан в сравнительном аспекте. Органы и системы, норма и патология описаны с точки зрения УЗИ, рентгеновского исследования и показаны в виде макропрепаратов.
Книга рассчитана на ветеринарных специалистов, работающих в области ультразвуковой и рентгенологической диагностики, на врачей общей практики, а также студентов, планирующих специализацию в области УЗИ и рентгенодиагностики.
Стоимость:
Розничная цена 1 экз. - 9600 руб.
Для оптовых покупателей - система скидок.
Где купить в Санкт-Петербурге:
Институт Ветеринарной Биологии по адресу: ул. Ораниенбаумская, д. 3-Б (ст. м. "Чкаловская") Т. 812 232-55-92 [email protected].
По вопросам оптового приобретения книг и журналов издательства ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» обращаться по е-mail: [email protected]; т. (812) 232-55-92.
