CC BY
24
УДК 615.076.7
ВЛИЯНИЕ АМОКСИЦИЛЛИНА НА СОСТАВ И АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ АКТИВНОГО ИЛА.
Мащенко1 З.Е., Маслова1 Е.В., Шаталаев2 И. Ф., Расцветова2 Н.В.
1ФГБОУ ВО Самарский государственный технический университет, г. Самара, Российская Федерация; 2ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет, г. Самара, Российская Федерация.
Аннотация.В настоящее время лекарственные вещества относятся к новым органическим загрязнителям окружающей среды. Сточные воды городов, агропромышленных предприятий, медицинских центров - основной источник фармацевтических препаратов. О качестве биологической очистки воды можно судить по состоянию ферментных систем микроорганизмов активных илов. В работе представлены данные изменения состава и активности молекулярных форм малатдегидрогеназы водных микроорганизмов при действии амоксициллина тригидрата в зависимости от концентрации и времени инкубации. Результаты экспериментов показали увеличение активности цитоплазматических молекулярных форм фермента при действии антибиотика на микроорганизмы активного ила.
Ключевые слова: амоксициллин, активный ил, малатдегидрогеназа, электрофорез в полиакриламидном геле.
Сточные воды городов, агропромышленных предприятий, медицинских центров - основной источник фармацевтических препаратов. Концентрация их в поверхностных и грунтовых водах обычно составляет менее 0,1 дg/l. В тоже время подтверждено неблагоприятное влияния малых концентраций лекарственных веществ и их метаболитов на гидроэкосистему, а также наличие кумулятивного эффекта [1,2].
Для выяснения характера влияния тех или иных факторов внешней среды на микроценозы гидроэкосистем используется НАД-зависимая малатдегидрогеназа (НАД-МДГ) ^-малат:НАД-оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.37). Фермент обнаружен в клетках практически всех аэробно живущих организмов и может существовать в виде различных молекулярных форм (МФ), обеспечивая приспособляемость живых систем к меняющимся условиям внешней среды [3].
Цель работы - изучение влияния амоксициллина тригидрата на состав и динамику активности молекулярных форм малатдегидрогеназы активного ила в моделях.
Материал и методы исследования. Объект исследования - амоксициллина тригидрат - антибиотик группы пенициллинов. Амоксициллина тригидрат плохо растворим в воде, поэтому в качестве растворителя использовали водный раствор соляной кислоты как естественную среду человеческого организма. Опытным путем было установлено минимально необ-
ходимое количество кислоты, при котором растворитель не оказывал влияния на дегидрогеназные ферменты микроорганизмов активного ила [4].
В экспериментах использовали активный ил городских очистных сооружений г. Самара. Иловую суспензию инкубировали в течение 24 часов при температуре 200С в аэробно-анаэробных условиях с концентрациями амоксициллина 10; 40 и 70 мг/г биомассы ила. В качестве контроля использовали водные растворы соляной кислоты. Пробы отбирали через 1 и 24 часа. Ферментные образцы получали по методике [5]. Молекулярные формы МДГ определяли методом электрофореза в плоских блоках 7,5% полиакриламидного геля. В качестве электродного буфера использовали 1М трис-ЭДТА-боратный буфер (рН 9,2). Выявление изоформ МДГ проводили с помощью феназинметасу-льфаттетразолиевой реакции в чашках Петри [6]. Обработку фореграмм проводили с использованием компьютерной программы «ТСХ-менеджер».
Изменение относительной активности отдельных молекулярных форм МДГ рассчитывали как процентное отношение разницы относительных активностей в опытной и контрольной пробах к относительной активности фермента в контрольной пробе.
Результаты и их обсуждение. В таблице 1 представлены данные о составе и относительной активности молекулярных форм МДГ микроценоза активного ила при действии амоксициллина после 1 часа и 24 часов инкубации.
Таблица 1.
Фракционный состав и относительная активность молекулярных форм МДГ микроценоза активного ила при действии амоксициллина
МФ МДГ Относительная активность молекулярных форм МДГ, %
Контрольная проба Проба, содержащая амоксициллин, мг/г биомассы ила
К10 К40 К70 10 40 70
Инкубация 1 час
МДГ-1 8,74 14,73 10,56 15,14 32,55 5,24
МДГ-2 25,83 16,25 45,43 30,22 15,69 3,66
19,31 20,42 5,75 7,82
МДГ-3 46,12 49,61 44,01 48,89 46,84 91,1
Инкубация 24 часа
МДГ-1 14,25 19,3 15,39 28,62 24,64 40,66
МДГ-2 3,43 15,41 2,67 23,94 26,13 8,49
16,3 1,89 3,86 2,06 1,10 4,61
МДГ-3 66,05 61,52 78,07 45,35 41,95 47,41
Через 1 час после начала инкубации во всех пробах были обнаружены три молекулярные формы МДГ -МДГ-1, МДГ-2 и МДГ-3; причем в контроле и пробах с концентрацией антибиотика 10 и 40 мг/г биомассы ила в области МДГ-2 - двух зон активности фермента. В контроле и в пробах с концентрацией антибиотика 10 и 40 мг/г суммарная активность цитоплазматиче-ских форм МДГ (МДГ-1 и 2) находилась на уровне активности мембраносвязанной МДГ-3. В пробе с концентрацией антибиотика 70 мг/г наблюдали активацию
МДГ-3. Через 24 часа во всех пробах также были обнаружены три молекулярные формы МДГ (в области МДГ-2 - две зоны активности). В процессе инкубации в контроле происходило увеличение активности МДГ-3; а в пробах с антибиотиком активность цитоплазма-тических форм МДГ находилась на уровне активности мембраносвязанной МДГ-3.
Динамика относительной активности молекулярных форм МДГ представлена в таблице 2.
Таблица 2
Динамика относительной активности молекулярных форм МДГ микроценоза активного ила при действии амоксициллина.
МФ МДГ Изменение относительной активности молекулярных форм МДГ, %
Концентрация амоксициллина, мг/г биомассы ила
10 40 70
Инкубация 1 час
МДГ-1 +468,45 +99,48 -99,14
МДГ-2 +168,73 -97,87 -90,46
МДГ-3 -5,07 -24,16 -31,2
Инкубация 24 часа
МДГ-1 +38,38 +529,9 +422,28
МДГ-2 -68,25 +150,75 +560,46
МДГ-3 +0,76 +69,18 +63,16
После 1 часа инкубации во всех образцах установлено ингибирование МДГ-3. Концентрация антибиотика 70 мг/г ила угнетает работу также МДГ-2 и МДГ-1. Через 24 часа во всех пробах отмечено восстановление функции МДГ-3 и значительный подъем активности МДГ-1 и МДГ-2 в образцах с содержанием амокси-циллина 40 и 70 мг/г ила
Выводы. Снижение активности МФ МДГ через 1 час инкубации свидетельствует о токсическом действии амоксициллина на фермент. Суточная инкубация приводила к активации низкомолекулярных форм
цитоплазматических МФ МДГ, что указывает на усилении процессов окисления в цитозоле клетки микроорганизмов. Это, вероятно, является адаптационным механизмом, обеспечивающим устойчивость микроценоза активного ила к внешним неблагоприятным факторам [3].
Анализ состава и активности МФ МДГ может быть использован для биомониторинга сточных вод, содержащих в качестве загрязнителей антибиотики пени-циллинового ряда.
ЛИТЕРАТУРА
1. Radjenovic J., Petrovic M., Barcelo D. Complementary mass spectrometry and bioassays for evaluating pharmaceutical-transformation products in treatment of drinking water and wastewater // Trends in Analytical Chemistry. 2009. №5. P. 562580.
2. Michael I., Hapeshi E., Michael C., Varela A.R. et al. Solar photo-Fenton process on the abatement of antibiotics at a pilot scale: Degradation kinetics, ecotoxicity and phytotoxicity assessment and removal of antibiotic resistant enterococci // Waterre-search. 2012. vol. 46. №17. P. 5621-5634.
3. Телитченко М.М., Шаталаев И.Ф., Волгина Т.Б. Динамика молекулярных форм лактат-, малат- и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ в моделях экосистемы активного ила// Гидробиологический журнал. 1992. т.28. № 3. С. 32-39.
4. Определение токсичности амоксициллина тригид-рата для микроорганизмов активного ила / З.Е. Мащенко, Е.В. Маслова, Я.А. Клейн и др. // Биотехнология - от науки к практике: Материалы научных докладов участников Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Киреевой Наили Ахняфовны. Том 2. (Уфа, Россия, 23-26 сентября 2014 г.). Уфа: Башкирский ГУ, 2014. С. 177-179.
5. Влияние ампициллина на состав и активность молекулярных форм малатдегидрогеназы активного ила / З.Е. Мащенко, Е.В. Маслова, И.Ф. Шаталаев и др.// Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2017. № 19. С. 119-222.
6. Корочкин Л.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И. Генетика изоферментов. М.: Наука, 1977. - 275 с.
THE EFFECT OF AMOXICILLIN ON THE COMPOSITION AND ACTIVITY OF MOLECULAR FORMS OF ACTIVE SLUDGE MALATE DEHYDROGENASE.
Mashchenko1 Z. E., Maslova1 E. V., Shataaev21. F., Rastsvetova2 N. V.
1 Samara state technical University, Samara, Russian Federation;
2 Samara state medical University, Samara, Russian Federation.
Annotation. Currently, medicinal substances belong to the new organic environmental pollutants. The waste water of cities, agroindustries, health centres - the main source of pharmaceuticals. The quality of biological treatment of water can be judged by the enzyme systems of microorganisms of active sludge. The paper presents the results of changes in the composition and activity of molecular forms of malate dehydrogenase aquatic organisms by the action of amoxicillin trihydrate, depending on concentration and time of incubation. The results of the experiments showed an increase in activity of cytoplasmic molecular forms of the enzyme by the action of antibiotic on microorganisms of activated sludge.
Key words: amoxicillin, activated sludge, malate dehydrogenase, electrophoresis in polyacrylamide gel.
REFERENCES
1. Radjenovic J., Petrovic M., Barcelo D. Complementary mass spectrometry and bioassays for evaluating pharmaceutical-transformation products in treatment of drinking water and wastewater // Trends in Analytical Chemistry. 2009. №5. P. 562580.
2. Michael I., Hapeshi E., Michael C., Varela A.R. et al. Solar photo-Fenton process on the abatement of antibiotics at a pilot scale: Degradation kinetics, ecotoxicity and phytotoxicity assessment and removal of antibiotic resistant enterococci// Waterre-search. 2012. vol. 46. №17. P. 5621-5634.
3. Telitchenko, M. M., Shatalaev I. F., Volgina T. B. Dynamics of molecular forms of lactate, malate and glucose-6-fosfatdegidrogenaze in models of ecosystem with activated sludge// Gidrobiologicheskij zhurnal. 1992. vol. 28. № 3. P.32-39.
4. Toxicity determination amoxicillin trihydrate for microorganisms active sludge / Z. E. Mashchenko, E. V. Maslova, Y. A. Klein et al. / / Biotechnology - from science to practice: Materials of scientific reports of participants of all-Russian conference with international participation dedicated to the memory of Professor Kireeva naili of Ahmatovna. Volume 2. (Ufa, Russia, 2326 September 2014). Ufa: Bashkir GU, 2014. P. 177- 179.
5. The effect of ampicillin on the composition and activity of molecular forms of active sludge malate dehydrogenase/ Z. E.Mashchenko, E. V.Maslova, I. F. Shatalaev et all.//The Journal of scientific articles «Health and Education Millennium». 2017. Vol.19. № 1. P.119-122.
6. Korochkin L. I., Serov O. L., Pudovkin, A. I., Genetics of isoenzymes. M.: Nauka, 1977. 275 p.
