CC BY
53
УДК 13058.616-092.9
ВЛИЯНИЕ АМЛОДИПИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ ГИБЕЛИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРПАРАТИРЕОЗЕ
М.В. Осиков , Д.А. Черепанов , Е.В. Листик
1д.м.н., профессор кафедры патофизиологии,
ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Челябинск, Россия
2аспирант кафедры патофизиологии,
ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Челябинск, Россия
3студентка 5 курса педиатрического факультета
ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Челябинск, Россия
Аннотация. Паратиреоидный гормон (ПТГ) может вносить вклад в изменение иммунного статуса при хронической почечной недостаточности (ХПН) и других состояниях, сопровождающихся развитием ги-перпаратиреоза (ГИТ), повышением концентрации ПТГ в сыворотке. Предполагаем, что изменение количества и функционирования иммунокомпетентных клеток при ГПТ может быть обусловлено внутриклеточным накоплением ионов кальция. Учитывая это, для иммунокоррекции при ХПН могут применяться препараты, влияющие на концентрацию кальция в иммунокомпетентных клетках. Для проверки гипотезы исследовали влияние блокатора кальциевых каналов амлодипина в суммарной дозе 1,75 мг/кг на показатели гибели лимфоцитов лабораторных животных с экспериментальным ГПТ. На проточном цитофлуориметре дифференцировали интактные клетки (Annexin-5-FITC-/AAD-), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/AAD-), клетки с поздними признаками апоптоза и частично некротические клетки (Annexin-5-FITC+/AAD +). Установлено, что при экспериментальном ГПТ в периферической крови наблюдается лимфоцитопения, увеличивается количество лимфоцитов с признаками позднего апоптоза и частично некроза. Количество лимфоцитов в периферической крови снижается по мере увеличения количества клеток, несущих признаки позднего апоптоза и некроза. Применение амлодипина при экспериментальном ГПТ приводит к увеличению количества лимфоцитов в периферической крови, увеличению количества интактных клеток и снижению количества клеток, несущих признаки раннего, позднего апоптоза и некроза.
Ключевые слова: гиперпаратиреоз, паратиреоидный гормон, амлодипин, лимфоциты, апоптоз, некроз.
—---------------------—
~ 12 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437
Осиков М.В., Черепанов ДА., Листик Е.В. Влияние амлодипина на показатели гибели лимфоцитов...
—-------------------------—
Актуальное!ь. Ранее нами установлены изменения иммунного статуса при терминальной стадии хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и в экспериментальных условиях, которые выражались в активации эффекторов врожденного иммунитета и подавлении адаптивного иммунитета [1]. Одним из механизмов депрессии адаптивного иммунитета при ХПН является лимфоцитопения и увеличение гибели лимфоцитов путем некроза и апоптоза в периферической крови [2; 3]. Патогенез усиленной гибели лимфоцитов в кровотоке при ХПН является многофакторным: накопление продуктов метаболизма, активация процессов свободно-радикального окисления, изменение цитокинового профиля, межклеточной кооперации и другие факторы. Общепринятым атрибутом терминальной стадии ХПН является развитие вторичного гиперпаратиреоза (ГПТ). Полагаем, что вторичный ГПТ и накопление в крови паратиреоидного гормона (ПТГ), а также сопутствующие изменения фосфорно-кальциевого обмена могут оказывать влияние на гибель лимфоцитов прямо или опосредованно, взаимодействуя со специфическими рецепторами для ПТГ на цитоплазматической мембране лимфоцитов или за счет внутриклеточного накопления ионов кальция. Учитывая это, для иммунокоррекции при ХПН могут применяться препараты, влияющие на концентрацию кальция в цитоплазме лимфоцитов. Для проверки гипотезы о роли ПТГ и вторичного ГПТ в активации гибели лимфоцитов и влиянии на эти процессы блокаторов кальциевых каналов целесообразным представляется исследовать показатели гибели лимфоцитов при изолированном экспериментальном ГПТ.
Цель работы — исследовать влияние блокатора кальциевых каналов амлодипина
на показатели гибели лимфоцитов периферической крови при экспериментальном ГПТ.
Материалы и методы. Работа выполнена на 30 белых нелинейных крысах-сам-цах массой 200—220 г, находящихся в стандартных условиях вивария и случайным образом разделенных на три группы: группа 1 (n = 10) — интактные животные, группа 2 (n = 10) — животные с экспериментальным ГПТ, группа 3 (n = 10) — животные, которым на фоне экспериментального ГПТ вводили блокатор кальциевых каналов амлодипин. ГПТ у крыс моделировали содержанием на гиперфосфатной диете [4]. В течение 120 дней рацион крыс включал синтетическую гиперфосфатную смесь (0,6% кальция и 4,2% фосфора). Развитие ГПТ верифицировали по увеличению концентрации ПТГ в плазме. Животным 3 группы per os ежедневно вводили блокатор кальциевых каналов ам-лодипин в составе препарата «Амлодипин-Тева» (международное непатентованное название: амлодипин, фирма «Тева», Израиль) в дозе 0,25 мг/кг в сутки в течение 7 дней, суммарная доза составила 1,75 мг/кг. Кровь для исследований забирали пункцией левого желудочка сердца.
Количество лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами. Для выделения чистой фракции лимфоцитов использовали градиент плотности стерильных растворов фиколла («Pharmacia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия). Лимфоциты трижды отмывали в среде 199, доводили до концентрации 3 • 106/л. Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin 5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5-FITC/7-AAD kit» («Beckman Coulter», США) на проточном цитофлуо-риметре «Navios» («Beckman Coulter», США) с дифференцировкой интактных клеток (An-
~ 13 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437
The Journal of scientific articles “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 3
—--------------------------—
nexin 5-FITC-/7-AAD-), клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin 5-FITC+/7-AAD-), клеток с поздними признаками апоптоза и частично некротических клеток (Annexin 5-FITC+/7-AAD+). Концентрацию ПТГ в сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с использованием специфической для крыс тест-системы компании «Cloud clone» (США). Результаты выражали в пг/мл. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica for Windows 8.0. Для оценки различий между группами использовали критерии Краскела-Уоллиса и Манна Уитни, при проведении корреляционного анализа — коэффициент корреляции Спирмена (R).
Результаты. В группе животных, находящихся на гиперфосфатной диете, через 120 суток увеличивается концентрация ПТГ в плазме (243,71 ± 35,80 пг/мл; у интактных
животных 19,60 ± 1,12 пг/мл; р < 0,05), что подтверждает развитие гиперпаратиреоза. Установлено, что при экспериментальном ГПТ снижается количество лимфоцитов в периферической крови как в относительных (2,23 ± 0,20%; у интактных животных 4,77 ± ± 0,54%; р < 0,05), так и в абсолютных (37,50 ± ± 3,25 • 109/л; у интактных животных 57,61 ± ± 1,19 • 109/л; р < 0 ,05) величинах. Одним из механизмов развития лимфоцитопении может выступать активация гибели лимфоцитов путем некроза и апоптоза. Нами выявлено увеличение количества клеток, несущих признаки позднего апоптоза и частично некроза (Annexin 5-FITC+/7-AAD+) (табл. 1). При проведении корреляционного анализа выявлена отрицательная средней силы связь между количеством лимфоцитов в периферической крови и количеством клеток, несущих признаки позднего апоптоза и некроза (R = -0,54; р < 0,05).
Таблица 1
Влияние амлодипина на показатели гибели лимфоцитов при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± т)
Показатели Группа 1 Интактные (п = 10) Группа 2 ГПТ (п = 10) Группа 3 ГПТ + АН (п = 10)
Annexin-5-FITC-/7-AAD-, % клеток 93,96 ± 0,69 93,18 ± 0,29 96,52 ± 0,45 р2—3 < 0,05
Annexin-5-FITC+/7-AAD-, % клеток 5,86 ± 0,66 5,96 ± 0,22 3,12 ± 0,39 р1—3 < 0,05 р2—3 < 0,05
Annexin-5-FITC+/7-AAD+, % клеток 0,16 ± 0,04 0,70 ± 0,14 р1—2 < 0,05 0,28 ± 0,03 р1—3 < 0,05 р2—3 < 0,05
Применение амлодипина в группе животных с экспериментальным ГПТ приводит
к увеличению количества лимфоцитов в относительных (50,83 ± 3,90%; в группе ГПТ
~ 14 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437
Осиков М.В., Черепанов ДА., Листик Е.В. Влияние амлодипина на показатели гибели лимфоцитов...
—-------------------------—
37,50 ± 3,25%;р < 0,05) и в абсолютных (3,91 ± ± 0,59 • 109/л; в группе ГПТ 2,23 ± 0,20 • 109/л; р < 0,05) величинах. Отмечается увеличение количества интактных лимфоцитов (Annexin 5-FITC-/7-AAD-), снижение количества клеток, несущих признаки раннего апоптоза (Annexin 5-FITC+/7-AAD-) и клеток, несущих признаки позднего апоптоза и частично некроза (Annexin 5-FITC+/7-AAD+) (табл. 1).
Известно, что ПТГ через взаимодействие с рецепторами на поверхности лимфоцитов приводит к активации Gs- и Gq-белок-ассоци-ированных внутриклеточных сигнальных путей, в том числе связанных с цАМФ/протеин-киназой А, фосфолипазой С, протеинкиназой С, ионизированным кальцием [5; 6]. Полагают, что протеинкиназа С-зависимый путь, повышение концентрации ионизированного кальция в цитоплазме лимфоцитов приводят к снижению клеточной пролиферации и активации апоптоза. Кальций может активировать фосфолипазу А2 и деградацию мембранных фосфолипидов, участвовать в изменении редокс-статуса клетки и как следствие приводить к инициации гибели лимфоцитов путем нек-роза/апоптоза. Полагаем, что применение блокатора кальциевых каналов амлодипина восстанавливает концентрацию кальция в цитоплазме лимфоцитов, что приводит к нормализации активности внутриклеточных мессенджеров, интенсивности углеводного обмена, захвата и утилизации кислорода и тем самым ограничивает гибель лимфоцитов.
Выводы
1. При экспериментальном гиперпарати-реозе в периферической крови наблюдается лимфоцитопения, увеличивается количество лимфоцитов с признаками позднего апоптоза и частично некроза.
2. Количество лимфоцитов в периферической крови снижается по мере увеличения
количества клеток, несущих признаки позднего апоптоза и некроза.
3. Применение амлодипина при экспериментальном гиперпаратиреозе приводит к увеличению количества лимфоцитов в периферической крови, увеличению количества интактных клеток и снижению количества клеток, несущих признаки раннего, позднего апоптоза и некроза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Осиков М.В., Телешева Л.Ф., Агеев Ю.И., Федосов А. А. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 4. URL: www.science-education.ru/ 110-9973 (дата обращения: 10.04.2015).
2. Осиков М.В., Телешева Л.Ф., Агеев Ю.И. Влияние эритропоэтина на апоптоз лимфоцитов при экспериментальной хронической почечной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015. Т. 159. № 3. С. 326— 328.
3. Роль уремической плазмы в активации апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Оси-ков, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, О. А. Гизингер, А.А. Аклеев, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. 2014. № 2. С. 132—135.
4. Draper H.H., Sie T.L., Bergan J.G. Osteoporosis in aging rats induced by high phosphorus diets //
J. Nutr. 1972. Vol. 102(9). Р. 1133—1141.
5. Geara A.S., Castellanos M.R., Bassil C. et al. Effects of parathyroid hormone on immune function // Clin. Dev. Immunol. 2010. Doi: 10.1155/2010/418695. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20886005 (дата обращения: 31.01.2015).
6. Vilardaga J.P., Romero G., Friedman P.A. et al. Molecular basis of parathyroid hormone receptor signaling and trafficking: A family B GPCR paradigm // Cell Mol Life Sci. 2011. Vol. 68 (1). P. 1—13.
~ 15 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437
The Journal of scientific articles “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 3
—-------------------------—
EFFECT OF AMLODIPINE
ON PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES DEATH IN EXPERIMENTAL HIPERPARATHIREOIDISM
M. V. Osikov1, D.A. Cherepanov2, E. V. Listik3
1professor of Department of Pathophysiology,
South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia 2
graduate student of Department ofPathophysiology,
South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia
3
5-year student, pediatrics faculty,
South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russia
Annotation. Parathyroid hormone (PTH) may contribute to changes in the immune status of patients with chronic renal failure (CRF) and other conditions involving the development of hyperparathyroidism (HPT), with increase in serum PTH concentrations. We assume that the change in the number and function of immune cells at the HPT may be due to the accumulation of intracellular calcium ions. With this in mind, for immuno-modulation in chronic renal failure may, under-changing drugs affecting the production of PTH and the calcium concentration in the blood. To test the hypothesis investigated the effect of a calcium channel blocker amlodipine in a total dose of 1,75 mg/kg on lymphocyte death of laboratory animals with experimental HPT. A flow cytometer differentiated intact cells (Annexin-5-FITC- / AAD-), cells with early signs of apoptosis (Annexin-5-FITC + / AAD-), cells with later apoptosis signs and partially necrotic cells (Annexin-5-FITC + / AAD +). It is found that that the experimental HPT in the peripheral blood observed lymphopenia, increased the number of lymphocytes with the signs of late apoptosis and necrosis in part. The number of lymphocytes in the peripheral blood decreases with increasing the number of cells carrying signs late apoptosis and necrosis. The use of amlodipine in experimental HPT increases the number of lymphocytes in the peripheral blood, increase in the number of intact cells and decrease the number of cells bearing the signs of early, late apoptosis and necrosis.
Key words: parathyroid hormone, amlodipine, lymphocytes, apoptosis, necrosis.
REFERENCES
1. Osikov M.V., Achmatov V.Y., Krivohizhi-na L.V. Effect of hemodialysis on the processes of free radical oxidation in patients with chronic renal failure. Bulletin of the South Ural State University. Series: Education, health, physical culture, 2007, no. 16 (71), pp. 95—97. Available at: www.science-education.ru/110-9973 (In Russian).
2. Osikov M.V., Telesheva L.F., Ageev Y.I. Effect of erythropoietin on apoptosis of lymphocytes in experimental chronic renal failure. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2015, vol. 159, no. 3, pp. 326—328. (In Russian).
3. Osikov M.V., Ageev Y.I., Cherepanov D.A., Gizinger O.A., Akleev A.A., Fedosov A.A. The role of uremic plasma activation of apoptosis of peripheral
blood lymphocytes in patients with chronic renal failure on hemodialysis. Fundamental’nye issledovaniya [Basic Research], 2014, no. 2, pp. 132—135. (In Russian).
4. Draper H.H., Sie T.L., Bergan J.G. Osteoporosis in aging rats induced by high phosphorus diets // J. Nutr. 1972. Vol. 102(9). Р. 1133—1141.
5. Geara A.S., Castellanos M.R., Bassil C. et al. Effects of parathyroid hormone on immune function. Clin. Dev. Immunol, 2010, doi: 10.1155/2010/418695. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 20886005.
6. Vilardaga J.P., Romero G., Friedman P.A. et al. Molecular basis of parathyroid hormone receptor signaling and trafficking: A family B GPCR paradigm. Cell Mol Life Sci., 2011, Vol. 68 (1), pp. 1—13.
~ 16 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
