CC BY
92
УДК 612.821
Вестник СПбГУ. Сер. 3,2004, вып. 3
Д. А. Хрусталев, Е. Л. Доведова, Н. Д. Ещенко ВЛИЯНИЕ АМФЕТАМИНА
НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НЕЙРОМЕДИАТОРОВ В СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ЛИНИЙ ВИСТАР И АВГУСТ
Изучение различных сторон действия амфетамина (фенамина) привлекает внимание нейрохимиков в связи с «дофаминовой» теорией шизофрении, согласно которой развитие этого заболевания во многом обусловлено гиперфункцией дофаминергической медиаторной системы [11, 18]. Амфетамин широко используется исследователями для создания экспериментальной модели шизофрении. Введение этого препарата животным приводит к появлению двигательных расстройств и нарушению поведения в форме так называемой фенаминовой стереотипии [1, 17], причем показано, что выраженность стереотипной гиперлокомоции у крыс зависит как от объема лабильного пула дофамина, так и от активности ферментов утилизации медиатора и от чувствительности постсинаптических рецепторов [3].
К настоящему времени доказано, что амфетамин усиливает высвобождение дофамина и норадреналина из синаптических окончаний, что сопровождается активацией постсинаптических рецепторов дофамина и адренорецепторов [12, 16]. В литературе накапливаются сведения о том, что наряду с этими четко установленными нарушениями отдельных звеньев дофаминергической передачи амфетамин влияет и на другие нейромедиаторные системы, в частности на холинергическую трансмиссию [2,15].
В экспериментах на животных разных генетических линий обнаружены существенные отличия в поведении, рефлекторной деятельности, чувствительности к воздействиям (в том числе к стрессорным факторам), которые могут быть связаны со структурнофункциональными и метаболическими особенностями мозга. Так, устойчивые к эмоциональному стрессу крысы обладают более высоким уровнем норадреналина и более низким содержанием серотонина в ряде структур мозга по сравнению с неустойчивыми к такому стрессу животными [5, 9]. Разная реакция крыс линий Август (предрасположенные к стрессу) и Вис-тар (устойчивые к стрессу) на эмоциональный иммобилизационный стресс сопровождается противоположными изменениями в содержании биогенных аминов (дофамина и серотонина) и их метаболизме в мозге [6]. Отличия в спектре фосфолипидов синаптосомальных мембран найдены у крысю высоким и низким порогами возбудимости нервной системы [4]; для линейных крыс с высоким уровнем тревожности характерна более низкая активность каспазы-3 в стволе мозга, чем для животных с низким уровнем тревожности [10]. Эти литературные данные подтверждают, что в основе отличий в поведенческих характеристиках животных разных генетических линий лежат особенности протекания в структурах мозга тех или иных метаболических процессов, прежде всего реакций, связанных с обменом нейромедиаторов.
Целью данной работы было сравнение эффектов введения амфетамина на активность ферментов нейромедиаторного обмена - двух форм моноаминооксидазы (МАО) и ацетилхо-линэстеразы (АХЭ), а также ферментов окислительного метаболизма (цитохромоксидазы и сукцинатоксидоредуктазы) в структурах головного мозга крыс линий Август (стресс-реактивные) и Вистар (стресс-устойчивые).
Материалы и методы. Эксперименты проведены на половозрелых крысах-самцах линий Вистар и Август массой 180-230 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Опытной группе животных внутрибрюшинно вводили амфетамин (Sigma) в дозе 2,5 мг на 1 кг массы тела; контрольным крысам вводили по 1,0 мл физиологи-
€> Д. А. Хрусталев, Е. J1. Доведова, Н. Д. Ещенко, 2004
ческого раствора. Через 30 мин животных использовали в опыте. Все процедуры проводились в соответствии с требованиями, предъявляемыми к работе с животными.
После декапитации крыс на холоде извлекали головной мозг и выделяли исследуемые структуры - кору больших полушарий и хвостатое ядро. В ряде экспериментов использовали также мозжечок. Фракцию митохондрий из указанных отделов мозга получали стандартным методом дифференциального центрифугирования из 10%-ного гомогената ткани, приготовленного на 0,25 М растворе сахарозы. В митохондриальной фракции определяли активность ферментов обмена нейромедиаторов и ферментов энергетического метаболизма спектрофотометрическими методами на спектрофотометре Gilford (Франция).
Активность моноаминооксидазы типа А (МАОа) определяли по методу Н. Попова и соавторов [19], используя в качестве субстрата серотонин-креатинин сернокислый (Sigma). В основе метода лежит реакция семикарбозида с продуктом окислительного дезаминирования серотонина, которая протекает с образованием 5-оксииндолацетальдегидсемикарбазона, имеющего максимум поглощения в УФ-области при длине волны 250 нм. Активность фермента выражали в ДЕ2зо в расчете на 1 мг белка за 60 мин.
Активность моноаминооксидазы типа Б (МАОБ) определяли по методу В. 3. Горкина и соавторов [7], используя в качестве субстрата паранитрофенилэтиламин, при окислительном дезаминировании которого образуется окрашенное соединение с максимумом поглощения при длине волны 450 нм. Активность фермента выражали в ДЕ450 в расчете на 1 мг белка за 60 мин.
Активность ацетилхолинэстеразы оценивали по методу С. Хестрина [14], субстратом служил ацетилхолин солянокислый. В основе определения лежит двухступенчатая реакция: вначале ацетилхолин реагирует с гидрокси-ламином при pH 7,8 с образованием холина и ацетилгидроксаминовой кислоты, которая затем образует с хлорным железом окрашенное комплексное соединение с максимумом поглощения при длине волны 540 нм. Количество образовавшегося комплексного соединения эквимолярно количеству прореагировавшего ацетилхолина. Об активности фермента судили по разнице оптической плотности между контрольной и опытной пробами и выражали в микромоль ацетилхолина (АХ) в расчете на 1 мг белка за 60 мин.
Активность цитохромоксидазы (ЦО) определяли по методу Б. Хесса и А. Поупа [13]. Принцип метода основан на окислении митохондриальным ферментом цитохрома с, предварительно восстановленного гидросульфитом натрия (Ыа^гОд). Восстановленная форма цитохрома с имеет максимум поглощения при длине волны 550 нм. Активность фермента пропорциональна падению оптической плотности пробы за время инкубации и выражалась в AHjso в расчете на 1 мг белка за 60 мин.
Активность сукцинат:цитохром с-оксидоредукТазы (СОР) определяли по методу В. Шнейдера и
В. Поттера [20]. В ходе окисления сукцината митохондриальным ферментом образуется восстановленная форма цитохрома с, накопление которой в пробе регистрируют при длине волны 550 нм. Цитохромоксидаза при этом инактивируется добавлением цианида калия. Активность фермента выражали в ДЕ550 в расчете на 1 мг белка за 60 мин. .
• Содержание белка в митохондриальной суспензии определяли общеизвестным методом Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Полученные результаты обработаны статистически по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Определение активности исследуемых ферментов ней-ромедиаторного и окислительного метаболизма позволило выявить ряд отличий по этим показателям в структурах мозга крыс двух генетически различных линий (таблица).
Активность ферментов метаболизма нейромедиаторов и окислительных ферментов в структурах мозга
крыс линий Вистар и Август (М ± т; п = 7)
Ферменты Кора больших полушарий Хвостатое ядро Мозжечок
Крысы линии Вистар
МАО а, Д Емо/мг белка за 60 мин 0,26 ±0,03 0,50 ±0,05 ч -
МАОб, Д Е450/МГ белка за 60 мин 0,38 ±0,05 0,42 ±0,07 -
АХЭ, мкмоль ацетилхолина/мг белка за 60 мин 4,10 ±0,10 14,6 ±0,18 -
ЦО, Д Е550/МГ белка за 60 мин 8,44 ±0,34 - 6,70 ±0,18
СОР, Д Е550/МГ белка за 60 мин 10,30 ±0,39 - 9,22 ±0,54
Крысы линии Август
МАОа, Д Егзо/мг белка за 60 мин 0,15 ±0,04 0,20 ± 0,06 -
МАОб, Д Е450/МГ белка за 60 мин 0,38 ± 0,02 0,40 ± 0,04 -
АХЭ, мкмоль ацетилхолина/мг белка за 60 мин 1,83 ±0,05 5,42 ±0,10 • -
ЦО, Д Е550/МГ белка за 60 мин 13,90 ±0,42 - • .14,70 ±0,39
СОР, Д Е55о/мг белка за 60 мин 12,90 + 0,34 - 17,90 ±0,38
Анализ активности фермента, окисляющего моноамины, показывает, что основные отличия в структурах мозга крыс линий Вистар и Август касаются лишь одной формы фермента, »а именно МАОа. Прежде всего следует отметить, что активность МАОа в обеих исследуемых структурах мозга крыс линии Вистар заметно выше, чем в тех же структурах у крыс линии Август. Так, активность МАОа в коре больших полушарий у крыс линии Вистар превышает таковую в коре мозга крыс линии Август в 1,75 раза, а в хвостатом ядре - в 2,5 раза. Более низкая активность МАОа в структурах мозга крыс линии Август свидетельствует о явной исходной «слабости» серотонинергической медиаторной системы у этих животных, что хорошо согласуется с физиологическими данными об их большей реактивности и стресс-чувствительности. Кроме того, у крыс линии Вистар отмечено заметное преобладание (почти в 2 раза) активности МАОа в хвостатом ядре над активностью этого фермента в коре, в то время как у крыс линии Август средние значения активности МАОа в хвостатом ядре были лишь на 30-33% выше, чем в коре (различия статистически недостоверны).
Что же касается другой формы фермента - МАОб, то ее активность в обеих структурах мозга, как у крыс линии Вистар, так и линии Август, была близкой по своим значениям.
А
МАОа МАОб АХЭ
I III I III
Влияние амфетамина in vivo на активность моноаминооксидаз: МАОа и МАОб, ацетилхо-линэстеразы (АХЭ) (А), цитохромоксидазы (ЦО) и сукцинат: цитохром с-оксидоредуктазы (СОР) (Б) во фракциях митохондрий структур мозга крыс линий Август и Вистар в процентах (контроль -100%).
1— сенсомоторная кора, II - хвостатое ядро, III - мозжечок. Темные столбики - действие амфетамина в структурах мозга крыс линии Август; светлые - действие амфетамина в структурах мозга крыс линии Вистар; * - статистически достоверные отклонения от контроля (р < 0,05).
Эти результаты позволяют полагать, что из моноаминергических систем большее значение в обеспечении повышенной чувствительности к стрессам у крыс линии Август играет серо-тонинергическая медиаторная система.
Активность АХЭ, как и активность МАОа, в мозге крыс линии Вистар была выше, чем у крыс линии Август: в коре больших полушарий - в 2,2 раза, в хвостатом ядре - в 2,5 фаза. Для обеих линий животных характерно преобладание активности АХЭ в хвостатом ядре над активностью фермента в коре мозга.
В отличие от ферментов медиаторного обмена активность окислительных ферментов (ЦО и СОР) в структурах мозга крыс линии Вистар была ниже, чем в этих же образованиях у крыс линии Август. Более выраженными эти отличия были в мозжечке, где активность ЦО у крыс линии Август в 2,2 раза, а активность СОР в 1,9 раза превышала таковую у крыс линии Вистар. Эти результаты служат косвенным свидетельством отличий в интенсивности энергетического метаболизма, обеспечивающего функциональную активность данной структуры мозга у крыс линий Вистар и Август. Поскольку, как известно, мозжечок относится к важнейшим компонентам моторных систем мозга, обнаруженные нами отличия в активности ферментов энергетического обмена могут (наряду с другими факторами) объяснять различия в двигательной активности крыс изучаемых генетических линий.
Введение экспериментальным животным непрямого адреномиметика амфетамина позволило обнаружить еще ряд дополнительных нейрохимических отличий в структурах мозга двух изучаемых линий крыс. Если в мозге контрольных животных (см. таблицу) при сравнении активностей МАО у крыс линий Вистар и Август различия относились главным образом к форме МАОа, то в опытах с амфетамином в большей степени они проявляются в изменениях активности формы МАОБ (рисунок). Установлено, что активность МАОБ в структурах мозга крыс линии Вистар после введения амфетамина возрастала (в коре больших полушарий - на 18%, в хвостатом ядре - на 30%), тогда как у крыс линии. Август статистически достоверных изменений активности этой формы фермента не обнаружено. В то же время характер изменений активности МАОд под влиянием амфетамина в мозге животных обеих генетических линий был аналогичным: в коре больших полушарий активность фермента как у крыс линии Вистар, так и у крыс линии Август снижалась на 20-22%, а в хвостатом ядре крыс обеих линий менялась незначительно, оставаясь близкой к контрольным значениям.
Активность АХЭ, исходно более низкая в обеих исследуемых структурах мозга контрольных крыс линии Август по сравнению с крысами линии Вистар, после введения амфетамина уменьшалась в среднем на 20%. Напротив, у крыс линии Вистар в коре больших полушарий активность АХЭ в опытах с амфетамином не изменялась, а в хвостатом ядре обнаружена лишь тенденция к снижению активности фермента.
Эксперименты с введением амфетамина указывают на существование тонких различий в функционировании нейромедиаторных систем в мозге устойчивых и неустойчивых к стрессу линий крыс. Подобные наблюдения сделаны и другими авторами. Так, установлено, что.животные, выращенные в условиях социальной изоляции, проявляют ббльшую чувствительность к амфетамину по сравнению с крысами, которых выращивали в группах [8].
Таким образом, результаты опытов с амфетамином позволили дополнить сведения о нейрохимических различиях в структурах мозга крыс линий Вистар и Август, существенно отличающихся по поведенческим характеристикам и устойчивости к стрессорным воздействиям.
Summary
Chrustalev D.A., Dovedova E.L., Eschenko N.D. The influence of amphetamine on neuromediatory metabolic enzymes in brain structures of Wistar and August rats.
In the work it was demonstrated some differences in the activities of enzymes which take part in neuromediatory and oxidative metabolism in brain structures (brain cortex, nuc. caudatum, cerebellum) of Wistar and August rats.
Литература
1. АрушанянЭ. Б. О нейролептическом паркинсонизме и поздней дискенезии и методах фармакологической коррекции этих патологических состояний // Журн. невропатол. и психиатр. 1985. Вып. 2. С. 269-277. 2. Башкатова В. Г., Крауз М., Праст Г., Ванин А. Ф. Внеклеточное содержание ацетилхолина и аденозина и генерация оксида азота в мозге крыс при действии амфетамина // Нейрохимия. 2003. Т. 20, №3. С. 201-205. 3. Воронцова О. Н., Бондаренко Н. А. Участие оксида азота в механизмах быстрого изменения состояния центральных дофаминовых рецепторов // Нейрохимия. 2003. Т. 20, № 3. С. 206-211.4. Герасимова И. А., Флеров М. А., Вайдо А. И., Ширяева Н. В. Фосфолипидный состав синаптосом коры головного мозга крыс, различающихся по порогу возбудимости нервной ткани // Нейрохимия. 2001. Т. 18, №4. С. 273-278. 5. Горбунова А. В. Биогенные амины в ЦНС у крыс линий Август и Вистар в условиях экспериментального эмоционального стресса // Нейрохимия. 1998. Т. 15, №3. С. 293-300. 6. Горбунова А. В. Моноамины мозга в условиях экспериментальных эмоциональных стрессов: действие физических и химических факторов // Нейрохимия. 1999. Т. 16, № 4. С. 273-286. 7. Горкин В. 3., Веревкина А. В., Гриднева Л. Я. и др. Методы исследования активности и специфического торможения моноаминооксидаз митохондрий // Современные методы в биохимии. М., 1968. Т. 2. С. 155-177. 8. Ноздрачев А.Д., Лебедев А. А., Шабанов П. Д. Организация подкрепляющих систем мозга // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2000. Вып. 4 (№ 27).
С. 61-75. 9. Судаков К. В. Системные механизмы эмоционального стресса. М., 1981. 10. Яковлев А. А., Перегуд Д. И., Егорова Л. К. и др. Активность каспазы-3 в отделах мозга крыс линий Fischer-344/N и WAG/G // Нейрохимия. 2003. Т. 20, №4. С. 265-268. 11. BraffD. L., Geyer М. A. Sensorimotor gating and schizophrenia: human and animal model studies //Arch. Gen. Psychiat. 1990. Vol. 41. P. 181-188. 12. BreierA., Su T. P., Saunders R. e. a Schizophrenia is associated with elevated amphetamine-induced synaptic dopamine concentrations: Evidence from a novel positron emission tomography method // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 2569-2574. 13. Hess B., Pope A. Ul-tramicrospectrophotometric determination of cytochromeoxidase for quantitative histochemistry // J. Biol. Chem. 1953. Vol. 204. P. 295-306. 14. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxyl-amine and its analytical application // J. Biol. Chem.* 1949. Vol. 180. P. 249-255. 15. Keys A. S., Mark G. P. Neurotransmitters and disorders of the basal ganglia // Neuroscience. 1998. Vol. 86. P. 521-531. 16. Laurelle М., Abi-DarghamA., van Dyck C.H. Single photon emission computerized tomography imaging of amphetamine-induced dopamine release in drug-free schizophrenic subjects // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 9235-9240. 17. Lipska В. K.. Jaskiw G. E., Weinberger D. R. Postpubertal emergence of hyperresponsiveness to stress and to amphetamine after'neonatal excitotoxic hippocampal damage: A potential animal model of schizophrenia // Neuropsychopharmacology. 1993.'Vol. 9. P. 67-75. 18. Meltzer H. Y., Deutch A. Y. Neurochemistry of schizophrenia// Basic Neurochemistry / Ed. by G.J. Siegel. New York, 1999-. P. 1052-1072. 19. Popov N., Rosier V., Thiemann V., Mathies H. Eine empfmdeiche Methode zur Bestimmung der monoaminoxydase Aktivitat // Acta Biol. Med. Germ. 1971. Bd. 26. S. 239-245. 20. Schneider W, Potter V. Assay of animal tissue for respiratory enzymes sucinic dehydrogenase and cytochrome oxydase // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 149. P. 217-226.
Статья поступила в редакцию 18 марта 2004 г.
