CC BY
81
ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА КОЛЛАГЕН-ЗАВИСИМУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-ГО ТИПА И АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
О.А. Трубачева1, А.В. Ситожевский1, И.В. Петров2, Т.Е. Суслова1, А.М. Гусакова1, И.В. Кологривова1, О.А. Кошельская1
1НИИ кардиологии СО РАМН, Томск 2ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Томск
E-mail: [email protected]
EFFECT OF REACTIVE OXYGEN ON COLLAGEN-DEPENDENT PLATELET AGGREGATION IN PATIENTS WITH DIABETES MELLITUS TYPE 2 AND HYPERTENSION
O.A. Trubacheva1, A.V. Sitozhevsky1, I.V. Petrov2, T.E. Suslova1, A.M. Gusakova1, I.V. Kologrivova1, O.A. Koshelskaya1
Institute of Cardiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk 2Siberian State Medical University, Tomsk
В настоящем исследовании было изучено влияние активных форм кислорода (АФК), продуцируемых внеклеточной системой ксантин-ксантиноксидаза, на коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Установлено разнонаправленное влияние АФК на параметры агрегации изолированных тромбоцитов пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и артериальной гипертензией.
Ключевые слова: тромбоцит, агрегация, активные формы кислорода.
In this study we investigated the effect of reactive oxygen species produced by the system of extracellular xanthine -xanthine oxidase on collagen-induced platelet aggregation. Multidirectional influence on the parameters of the AFC aggregation of platelets isolated patients with heart failure and metabolic disorders and healthy volunteers is revealed.
Key words: platelet, aggregation, reactive oxygen species.
Введение
К настоящему времени накоплен огромный объем сведений об участии активных форм кислорода (АФК) в жизнедеятельности клетки. Хорошо изучено повреждающее действие АФК на клеточные мембраны. Однако в последнее время все чаще появляются работы, в которых АФК рассматриваются в качестве регуляторов внутриклеточных процессов. Активные формы кислорода либо выступают в роли вторичных посредников, либо модулируют действие известных регуляторных каскадов клетки [3]. Тромбоциты, как известно, играют ключевую роль в обеспечении гемостатических реакций организма. Основной характеристикой функциональной активности тромбоцитов является их способность к агрегации. Метаболические нарушения, в том числе сахарный диабет 2-го типа, сопровождаются активацией коагуляционного и тромбоцитарного гемостаза, что способствует раз-
витию сердечно-сосудистых осложнений. Установлено, что риск тромбообразования тесно коррелирует с изменением плазматического окислительно-восстановительного статуса [4, 5]. Роль активированных кислородных метаболитов в регуляции агрегационной активности тромбоцитов недостаточно изучена, в связи с чем проведение настоящего исследования представляется весьма актуальным.
Цель: изучить роль активных форм кислорода, продуцируемых внеклеточным источником, на агрегацион-ную способность тромбоцитов больных с сахарным диабетом 2-го типа и артериальной гипертензией (АГ) и здоровых доноров.
Материал и методы
В работе использовалась кровь больных с сахарным диабетом (СД) 2-го типа и АГ (42 чел.) и практически здо-
ровых добровольцев (32 чел.). Клинический диагноз верифицировали при помощи клинико-лабораторных методов исследования на базе отделения атеросклероза и хронической ишемической болезни сердца НИИ кардиологии СО РАМН (руководитель - академик РАМН Р.С. Карпов). Группы исследуемых соответствовали по полу и возрасту.
Для выделения тромбоцитов использовали периферическую венозную кровь, забранную из локтевой вены утром натощак в пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянт (цитрат натрия 3,8%) в соотношении 1 часть антикоагулянта на 9 частей крови. Кровь тщательно перемешивали с антикоагулянтом путем плавного покачивания. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы забранную кровь подвергали центрифугированию при 1500 об/мин в течение 7 мин. Отбирали на-досадочный слой - богатую тромбоцитами плазму. В полученную плазму добавляли простагландин Е1 и гепарин в конечной концентрации (1 цМ) и (6,4 ЕД/мл) соответственно, плазму инкубировали 15 мин при 37 °С, затем центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Надосадок сливали, суспензию тромбоцитов отмывали в растворе Хенкса, содержащем 1М простагландина Е1, 6,4 ЕД/мл гепарина и 0,5 ЕД/мл апиразы, рН=7,4, затем клетки еще раз отмывали в растворе Хенкса, но не содержащим простагландин Е1, гепарин и апиразу. Количество тромбоцитов в суспенз1ии подсчитывали на гематологическом анализаторе Micros, США. Конечная концентрация тромбоцитов в суспензии, использованной для изучения агрегации, составляла 440-106 клеток в 1 мл буфера. Агре-гационную активность изолированных тромбоцитов исследовали с помощью метода Г Борна (1962) в модификации З.А Габбасова (1989) на двухканальном лазерном анализаторе (220 LA “НПФ Биола”, Россия).
В качестве продуцента активных форм кислорода использовалась система, включающая ксантин (10-4 М) и ксантиноксидазу (10 и 20 ми/ мл) (Sigma). Инкубацию изолированных тромбоцитов с этими агентами проводили в течение 30 мин.
Для индукции агрегации использовали коллаген в конечной концентрации 2 мг/мл. Оценивали следующие параметры агрегации: степень и скорость агрегации по кривой светопропускания и по кривой среднего размера агрегатов.
Продукцию супероксид-аниона системой ксантин-ксантиноксидаза оценивали спектрофотометрически в бесклеточной среде. В одну кювету объемом 1 мл, содержащую буфер, добавляли соответствующие концентрации ксантина, ксантиноксидазы и 5-10-5 М цитохрома с. Измерения проводились против кюветы, содержащей раствор Хенкса и цитохром с. Продукцию супероксид-аниона оценивали по степени восстановления цитохрома с при 550 нм. Были выбраны два соотношения ксантина и ксантиноксидазы:
1) 10-4 М ксантина и 10 мИ/мл ксантиноксидазы;
2) 10-4 М ксантина и 20 мИ/мл ксантиноксидазы. В первом случае выделялось 15,5 мкМ супероксид-аниона.
во втором - 120 мкМ.
Для разделения эффектов супероксид-аниона и перекиси водорода - основных продуктов ксантиноксидаз-
ной реакции к среде инкубации клеток, содержащей ксантин и ксантиноксидазу, добавляли супероксиддисмутазу (СОД) (200 И/ мл) или каталазу (250 И/ мл).
Анализ данных проводили при помощи программы STATISTICA 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде “среднее+ошибка среднего” (X±m). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы непараметрические критерии. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался И-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney И-test). Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test) [1]. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Одним из наиболее значимых АФК является супероксид-анион (О2-), продукция которого существенно увеличена при ряде патологических состояний: ишемии, гипоксиях, стрессовых ситуациях, эндокринопатиях, опухолевом процессе, различных бактериальных инфекциях и интоксикациях [2, 6, 7]. Известно, что О2- образуется в эндотелии сосудов благодаря ксантиноксидазе, обладающей высокой удельной активностью в этих клетках.
Для изучения влияния супероксид-аниона на агрегацию тромбоцитов был применен подход, описанный A.R. Jones, где авторами в качестве источника О2- использовалась ксантиноксидазная реакция.
Показатели коллаген-индуцированной агрегации изолированных тромбоцитов больных с СД 2-го типа и АГ и здоровых добровольцев достоверно не различались, однако в присутствии источника АФК исследуемые параметры существенно изменялись.
В первой серии экспериментов среда инкубации тромбоцитов содержала 10-4 М ксантина и 10 мИ/мл ксанти-ноксидазы, что, как показали спектрофотометрические измерения, приводило к образованию 15,5 мкМ супероксид-аниона. В этих условиях параметры агрегации изолированных тромбоцитов больных не изменялись, тогда как у здоровых доноров наблюдалось снижение степени коллаген-индуцированной агрегации по кривой светоп-ропускания.
Инкубация тромбоцитов с 10-4 М ксантина и 20 мИ/мл ксантиноксидазы, что, согласно спектрофотометрическим исследованиям, приводило к образованию 120 мкМ супероксид-аниона, вызвала увеличение степени и скорости агрегации тромбоцитов больных, но снижала эти параметры у здоровых доноров (табл.).
В ксантиноксидазной реакции наряду с супероксид-анионом образуется перекись водорода. Для разделения эффектов этих АФК во второй серии экспериментов в среду инкубации тромбоцитов наряду с ксантином и ксан-тиноксидазой добавлялись супероксиддисмутаза или ка-талаза.
Добавление в среду инкубации тромбоцитов больных 10-4 М ксантина, 20 мИ/мл ксантиноксидазы и 200 И/мл
О.А. Трубачева и соавт.
ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА...
Таблица
Влияние продуктов системы ксантин-ксантиноксидаза на параметры коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов больных с сахарным диабетом 2-го типа и артериальной гипертензией и здоровых доноров
I степень агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед. II степень агрегации по кривой светопропускания, % III - скорость агрегации по кривой среднего размера агрегатов, отн. ед./мин IV - скорость агрегации по кривой светопропускания, % мин
Больные Здоровые Больные Здоровые Больные Здоровые Больные Здоровые
Коллаген (2 нг/мл) 3,33+1,21 2,033+0,46 23,38+9,45 20,337+8,45 2,36+0,24 1,323+0,44 29,74+5,63 24,8+7,52
Коллаген + ксантин 104М, + ксантин-оксидаза (10 ми/мл) 2,807+1,05 1,85+0,43 25,217+5,23 17,303+7,99* 2,896+1,78 1,618+1,50 23,971+5,06 27,405+7,11
Коллаген + ксантин 104М, + ксантин-оксидаза (20 ми/мл) 3,99+1,11 1,508+0,01* 34,519+5,03* 11,764+1,02* 3,66+0,01 1,139+0,01 33,789+0,16* 21,175+0,24*
Коллаген + ксантин 104М, + ксантин-оксидаза (20 ми/мл) + супероксид-дисмутаза (200 и/мл) 2,39+1,09 1,236+0,12* 29,288+2,12# 8,911+0,81* 1,5+0,91* 0,9+0,24 18,422+3,41*# 23,871+1,74*#
Коллаген + ксантин 104М, + ксантин-оксидаза (20 ми/мл) + каталаза (250 U/мл) 2+0,11*# 1,626+1,21# 18,383+0,82*# 11,909+9,45* 1,503+0,14# 3,443+3,24 23,933+1,71* 19,3+8,63*
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцированной агрегации; # - р<0,05 по сравнению со значениями коллаген-индуцирован-ной агрегации в присутствии ксантина и ксантиноксидазы.
СОД приводило к достоверному снижению степени и скорости агрегации по кривой светопропускания относительно значений, полученных в отсутствие СОД. В то же время эти параметры оставались достоверно выше полученных в отсутствие ксантина, ксантиноксидазы и СОД (табл.).
Коллаген-индуцированная агрегация изолированных тромбоцитов здоровых добровольцев в присутствии ксантина, ксантиноксидазы и СОД характеризовалась достоверным снижением параметров I, II и IV (табл.). Однако они достоверно не отличались от параметров, измеренных в отсутствие СОД.
Добавление каталазы (250 и/мл) к изолированным тромбоцитам в присутствии 10-4 М ксантина и 20 мИ/мл ксантиноксидазы приводило к достоверному снижению всех четырех измеренных параметров агрегации у больных относительно значений, полученных в отсутствие каталазы. Кроме того, следует отметить, что в этих условиях наблюдалось восстановление параметров до нормальных значений (табл.).
Внесение в среду инкубации тромбоцитов здоровых доноров каталазы совместно с ксантином и ксантанок-сидазой не приводило к достоверным изменениям параметров относительно значений, полученных в отсутствие каталазы.
Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что активные формы кислорода, продуцируемые внеклеточной системой ксантин-ксантиноксидаза, оказывают разнонаправленное действие на коллаген-инду-цированную агрегацию изолированных тромбоцитов пациентов с СД 2-го типа и АГ и здоровых добровольцев: повышают агрегационную активность тромбоцитов у больных и снижают ее у здоровых добровольцев. Внесение в среду инкубации тромбоцитов здоровых доноров супероксиддисмутазы и каталазы не приводило к значимым изменениям агрегационной активности клеток, что предполагает способность тромбоцитов в норме адаптироваться к содержанию АФК У пациентов с СД 2-го типа и АГ наблюдается значительное восстановление параметров агрегации тромбоцитов вследствие добавления в среду инкубации каталазы, но не супероксиддисмутазы. Это позволяет предположить, что более неблагоприятным фактором для тромбоцитов больных является перекись водорода, а не супероксид-анион, что, по всей видимости, связано со способностью перекиси водорода проникать внутрь клеток, тогда как супероксид-анион лишен такой возможности.
Статья подготовлена по материалам исследований, финансируемых Министерством образования и
науки в рамках ФЦП"Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы” (ГК№ 02.527-11.0007) и гранта 7-йрамочной
программы ЕС (№241558).
Литература
1. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистика. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. - М., 1998.
- 591 с.
2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Бифизика. - 1991. - Т. 29. - С. 1-249.
3. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в клетке // Нейрохимия. - 1996. - № 13. - С. 47-54.
4. Луста И.В., Ситожевский А.В., Груздева О.В. и др. Интегральный показатель антиоксидантной защиты и его компоненты в сыворотке крови больных инсулиннезависимым са-
харным диабетом // Бюл. Экспер. Биол. - 1999. - Т. 127, прил. 1 - С. 27-28.
5. Суслова Т.Е., Груздева О.В., Кошельская О.А. и др. Реактивные кислородные метаболиты и окислительная резистентность липопротеинов у больных с сочетанием артериальной гипертензии, сахарного диабета 2-го типа и атеросклероза // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2005.
- № 2. - С. 74-78.
6. Карли Ф. Метаболический ответ на острый стресс // Актуальные проблемы анестезиологии-реаниматологии / под ред. проф. Э.В. Недашковского. - Архангельск, 1997. -С. 31-34.
7. Чеснокова Н.П., Афанасьева Г.А., Понукалина Е.В. и др. Ли-попероксидация и антиоксидантная система крови в динамике интоксикации // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2001. - № 3. - С. 17-18.
8. Jones A.R. Enzymic mechanisms of superoxide production // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - Vol. 1057. - P. 281-298.
Поступила 15.09.2011
