CC BY
28
fir
Pp:
У*-
)
Д» mm a j
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Влияние ß-адреноблокаторов на рост кардиомиоцитов в культуре ткани сердцу
В.А. Цырлин2, Е.В. Лопатина2, В.А. Пеннияйнен. 1
2ФГУ НИИ кардиологии им. В.А.Алмазова., Санкт-Петербург. 'Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург.
Резюме
С помощью метода органотипической культуры ткани исследовали действие атенолола и метопролола на рост эксплантатов ткани сердца 10-12 - дневных куриных эмбрионов. При введении в питательную среду атенолола в концентрации 10"'° M наблюдается незначительное (на 20%) угнетение роста эксплантатов ткани сердца. Атенолол в концентрации 108 M угнетает рост клеток ткани сердца на 15%. В то же время атенолол в концентрациях 10~6 M и 10~4М стимулирует рост эксплантатов ткани сердца на 23% и 40% соответственно. Метопролол угнетает рост эксплантатов во всех исследованных концентрациях (от 10"'2 M до 104 М).
В концентрации 10~12 M норадреналин усиливает рост эксплантатов ткани сердца. В то же время как атенолол, так и метопролол во всех используемых концентрациях препятствуют способности норадреналина усиливать рост эксплантатов ткани сердца. Проведенный анализ позволил предположить, что влияние норадреналина на рост эксплантатов ткани сердца обусловлено активацией В;-адренорецепторов.
Ключевые слова: эксплантаты ткани сердца, куриные эмбрионы, ßj-адреноблокаторы, атенолол, метопролол , норадреналин, культура ткани. ( ^
\
Effects of ß-adrenergic blokers on the growth of explantat of cardiac tissue V. A. Tsyrlin2, E.V. Lopatina2, V.A.Penniyaynen.'
2V.A. Almazov Research Institute of Cardiology.
'Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences.
Resume *
The method of organotypical cell culture was used. The long-term cell culture of cardiac embryonic tissue of 10-12-days old chicken was investigated. The effects of B(-adrenergic blockers (atenolol, metoprolol) and noradrenaline on the growth of explantat cardiac tissue were measured quantitatively. It was found that Bj-adrenergic bloker atenolol in 106 M and 10"4 M concentration stimulated growth of cardiac tissue on 23% and 40% correspondently. Atenolol in 108 M concentration, contrary, depressed growth of explantat. Metoprolol (10"'2 - 104 M) inhibited the growth of explantat cardiac tissue.
Noradrenaline (10 12 M) stimulated growth of explantat cardiac tissue. However the joint action of noradrenaline (10 12 M) and metoprolol or atenolol did not influence on growth explantat cardiac tissue. These results suggest that cardiac tissue stimulating effect of noradrenaline mediated through activation of B(-adrenergic receptors.
Key words: explantat of cardiac tissue, noradrenaline, atenolol, metoprolol, B(-adrenergic receptors, cell culture.
«г
м Н
и
и
к
<
£
ш Хорошо известно, что реализация эффектов медиа-
й торов симпатической нервной системы норадренали-
к на и адреналина осуществляется через а и В-адреноре-
^ цепторы. Локализация и количественное распределе-
^ ние адренорецепторов определяют реакцию тканей на
н адреномиметические вещества [4, 5]. В сосудах кожи,
с почек и кишечника, сфинктерах желудочно-кишечно-
к го тракта, трабекулах селезенки преобладают а-адре-
^ порецепторы. В сердце, мышцах бронхов, сосудах ске-
о летных мышц в основном локализованы 6-адреноре-
5 цепторы, которые разделяются на Вги В2-адренорецеп-
§ торы. Во многих тканях а- и 6-адренорецепторы сосу-
м ществуют. В сердце человека и некоторых животных
и наряду с В (-адренорецепторами экспрессируются 62-ад-репорецепторы [5, 7].
Норадреналин (НА) и адреналин обладают способностью не только сужать сосуды, усиливать работу сердца, по и активировать аэробный гликолиз и трофические процессы в миокарде и сосудах [6] и, в частности, вызывать гипертрофию кардиомиоцитов. Однако механизм реализации трофотропного эффекта катехолами-нов в отношении сердечной мышцы не установлен.
В клинической практике широкое распространение находят препараты, избирательно блокирующие В(-ад-ренорецепторы, в частности атенолол и метопролол. Одной из характерных особенностей этих соединений является отсутствие у них симпатомиметических свойств [2, 3]. В-адреноблокаторы без симпатомиметической активности способны влиять не только на частоту и силу сердечных сокращений, но и вызывать регрессию гипер-
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
трофии миокарда. Однако причины этих свойств 6-ад-реноблокаторов не установлены.
Необходимо отметить, что одним из способов изучения механизма трофотропного эффекта лекарственных веществ является исследование их действия в культуре ткани. Поэтому целыо настоящей работы был анализ действия кардиоселективных 13 адреноблокаторов ате-нолола и метопролола на рост эксплантатов ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов в органотипичес-кой культуре.
Методика
В работе применяли метод органотипичсской культуры ткани. В экспериментах было использовано 900 эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов, культивируемых в течение 3 суток на подложках из коллагена в чашках Петри при 36,5°С в СО, инкубаторе (Sanyo) [ 1 ]. Питательная среда содержала 45% раствора Хенкса, 40% среды Игла с добавлением инсулина (0.5 ед./мл), глюкозы (0.6%), гл юта мина (2мМ), гентомииина, 5% куриного эмбрионального экстракта и 10% фетальной сыворотки коровы. В части экспериментов осуществляли окрашивание препаратов гематоксилин-эозином, в этом случае культивирование эксплантатов осуществляли на покровных стеклах с подложками из коллагена, помещенных в чашки Петри.
Селективные В(-адреноблокаторы атенолол и метоп-ролол вводили в питательную среду в диапазоне концентраций от 10 1 М до Ю"10 М и ot10"s М до 10 12 N4, соответственно. НА добавляли в культуральную среду в концентрации 10 - М. В качестве контроля, использовали эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды. В работе использовали атенолол, и НА фирмы "Sigma" (США), метопролол фирмы «Leiras Hassle» (Швеция). Рост эксплантатов в культуре ткани контролировали на витальных препаратах с помощью фазово-контрастного микроскопа, а также на фиксированных препаратах. Для визуального контроля использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Количественную оценку роста эксплантатов осуществляли с помощью пакета программ PhotoМ 1.2. Интенсивность роста эксплантатов оценивали по величине индекса площади (ИП), который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к исходной площади фрагмента ткани (т.е. площади центральной зоны). За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5 х 10 равнялась 150 мкм). Достоверность различий индекса площади контрольных и экспериментальных эксплантатов оценивали с помощью t- критерия С-тъюдента. Значения выражали в процентах, контрольное значение индекса площади принимали за 100%.
АТ
Рис.1. Микрофотография эксплантата ткани сердца 10-дневного куриного эмбриона 3-й сутки культивирования (ув. х 100). Окраска гематоксилин-эозином.
А
Рис. 2. Влияние атенолола на рост эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов (3-е суток культивирования). По оси абсцисс - концентрация, М; По осп ординат -индекс площади эксплантатов (ИП, %). Звездочка -достоверные различия относительно контрольных экспланта тов, р<0.05.
ил%
160 -
А
10'° 10-*
□ коетроль 0 атенолол
ю-
Рис.3. Микрофотография зоны роста эксплантата ткани сердца после 3-х суток культивирования в присутствии атенолола (10 4 М) (ув. х 200). Окраска гематоксилин-эозином.
1
Результаты исследования
На рис.1 представлена микрофотография эксплантата ткани сердца 10-дневного куриного эмбриона. Через трое суток культивирования эксплантатов ткани сердца отчетливо выделяется две зоны - центральная и периферическая. Центральная зона образована плотно расположенными немигрирующими кардномиоцнтами
о
А
артериальная п-шертензня том 12 № 3 2006
249
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Рис. 4 . Влияние норадреналина (10 12 М) и блока-тора 6(-адренорецепторов атенолола (10 4 М) на рост эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов. Звездочка - достоверные различия относительно контрольных эксплантатов, р<0.05.
И11%
160 -
140
120
100 -80 60
40 20 0
□ контроль □ атенолол SHA Патенолол+НА
Рис. 5. Изменение индекса площади эксплантатов ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов при добавлении в питательную среду метопролола. По оси абсцисс - концентрация, М; По оси ординат - индекс площади эксплантатов (ИП, %). Звездочка - достоверные различия относительно контрольных эксплантатов, р<0.05.
ип-/.
100 -
ю"
НИ
ю*
с-□
10* Моль
<
S м н и к
и «
< I
03 О.
W
1 «
<
W и ы
К
н <
с
2 5 и
« «
W
W
и
□ контроль □ метопролол
Рис. 6. Влияние норадреналина (10 12 М) на фоне метопролола (10"12 М) на рост эксплантатов ткани сердца 10-12- дневных куриных эмбрионов.
ип%
140 -
120
100
80
60
40
20 0
□ контроль □ метопролол El НА ЕЭ метопролол+НА
и фибробластами, периферическая зона (зона роста) представлена мигрирующими и пролиферирующими кардиомиоцитами, а также некоторым количеством фибробластов. В целом, зона роста на 96% представлена кардиомиоцитами, представляющими собой многоядерные полиплоидные клетки веретенообразной формы с поперечной исчерченностью. Между собой клетки образуют плотные контакты. В части экспериментов регистрировалась их спонтанная сократительная активность.
При введении в питательную среду атенолола в концентрации 10"10 М наблюдали незначительное угнетение роста эксплантатов ткаии сердца (рис.2), ИП составил 80% от контрольного значения. Атенолол в концентрации 10 8 М угнетал рост клеток ткани сердца на 15%. Обнаружено, что в концентрациях 106 М и 104 М атенолол достоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов на 23% и 40% соответственно. Зона роста была представлена кардиомиоцитами и небольшим количеством фибробластов (рис.3).
Влияние НА на рост эксплантатов ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов исследовано нами ранее [1]. НА в концентрации 10 12 М достоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сердца на 25%.
При культивировании эксплантатов ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов в питательной среде, содержащей атенолол (10''М) и НА (10"12 М), стимулирующие эффекты обоих веществ отсутствовали. Данные экспериментов не отличались от контрольных (рис. 4).
При введении в питательную среду метопролола в концентрациях 10"4, 106 и 108 М обнаружено полное угнетение процесса пролиферации клеток эксплантатов ткани сердца. При введении в культуральную среду метопролола в концентрации 10 10 М наблюдали достоверное ингибирование роста эксплантатов ткани сердца. ИП в этом случае составил всего 40% от контрольного значения. Метопролол в концентрации 10"12 М также достоверно угнетал рост эксплантатов ткани сердца, ИП был ниже контрольного значения на 30% (рис.5).
Исследование совместного действия НА (1012 М) и метопролола (10"12 М) (рис. 6) позволило обнаружить, что даже в этой дозе метопролол полностью устранял стимулирующее действие НА по отношению к клеткам ткани сердца. Величина ИП экспериментальных эксплантатов пе отличалась от его значения, рассчитанного в экспериментах с исследованием действия одного метопролола в концентрации 1012 М.
Обсуждение
Известно, что атенолол и метопролол, являясь селективными В(-адреноблокаторами, имеют определенные отличия. Селективность атенолола уменьшается с повышением дозы и препарат относится к гидрофильным соединениям. В то же время метопролол относится к липофильным соединениям. Фактор липофильности определяет их проникновение через тканевые барьеры.
В экспериментах с использованием метода органо-типической культуры ткани обнаружено, что атенолол в достаточно высокой концентрации (104 М), подобно НА, стимулирует рост эксплантатов ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов. Необходимо отметить,
что эта концентрация атенолола в 3 раза выше, чем концентрация НА, необходимая для усиления трофических процессов в аналогичных экспериментальных условиях [1J. Трофические и нейротрофические свойства НА реализуются благодаря активации адренорецепторов [6]. По литературным данным Вг-адренорецепторы посредством регуляторных Gs-белков связаны с аденилатцик-лазой, локализованной в мембране эффекторных клеток. Этот фермент обеспечивает синтез циклического 3',5'-аденозинмонофосфата (цАМФ). цАМФ, в свою очередь, активирует протеинкиназы. При вовлеченности в реакцию Gi- белков (при активации а2 адренорецепторов) наблюдается ингибирование синтеза цАМФ, при участии Gs-белков, напротив, происходит стимуляция синтетических процессов.
Обнаруженное нами стимулирующее влияние атенолола в высоких концентрациях на рост ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов, по-видимому, обусловлено его непосредственным действием на Bj-адреноре-цепторы, связанные с Gs-белками и увеличением уровня цАМФ клеток сердечной мышцы.
Проведенные исследования позволили выявить, что метопролол обладает выраженной способностью к угнетению процесса пролиферации клеток сердечной ткани 10-12 дневных куриных эмбрионов во всех исследуемых концентрациях от 10"12 М до 10"4 М. Эти результаты также подтвердили наше предположение о том, что трофическое действие НА по отношению к клеткам сердечной ткани реализуется через активацию адренорецепторов [1].
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 04-04-49859 и «Фонда содействия отечественной науке».
Литература
1. Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка А.А. Исследования участия Na+, К+-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органотипической культуре. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2005; 140 (8): 150-153.
2. Darmansjah I., Wong Е., Setiawati A. et al., Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of controlled release (CR/ZOK) metoprolol in healthy Oriental subjects: a comparison with conventional formulations of metoprolol and atenolol. J. Clin. Pharmacol., 1990; 30: 39-45.
3. Haria M, Plosker G.L., Markham A. Felodipine/ metoprolol: a review of the fixed dose controlled release formulation in the management of essential hypertension. Drugs, 2000; 59 (1): 141-157.
4. Schaefers R.F., Nuernberger J., Herrmann B. et al. Adrenoceptors mediating the cardiovascular and metabolic effects of alpha-methylnoradrenaline in man. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999; (289): 918-925.
5. Schaefers R.F., Nuernberger J., Wenzel R.R., Philipp T. Characterization of adrenoreceptors mediating cardiovascular and in vivo effects of a-methyl-noradrenaline (AMN) in humans. Naunun-Schmiedel-berg's Arch Pharmacol., 1997; (356); 52.
6. Wallin B.G., Sundlof G„ Stromgren E., Aberg H. Sympathetic outflow to muscles during treatment of hypertension with metoprolol. Hypertension, 1984; (6): 557-562.
7. Weber F„ Brodde O.E., Anlauf M., Bock K.D. Sub-classification of human beta-adrenergic receptors mediating renin-release. Clin. Exp.Hypertens., 1983; (5): 225-238.
