CC BY
910. Мещерякова А.К., Костинов М.П., Магаршак О.О., Гусева Т.С., Паршина О.В. Влияние препарата рекомбинантного интерферона а-2Ь в форме геля на течение ОРИ и состояние мукозального иммунитета у женщин в периоде гестации от 14 недель. Вестник оториноларингологии. 2014, 6: 50-53.
11. Севостьянова О.Ю., Теплова С.Н., Радзинский В.Е. Иммунный гомеостаз в динамике неосложненной беременности. Вестник РУДН, сер. Медицина. Акушерство и гинекология. 2005, 4 (32): 39-42.
12. Смирнова Т.Л., ПортноваЕ.В., СергееваВ.Е. Иммунитет и беременность. Вестник Чувашского университета. 2009, 2:79-85.
13. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беременности. М., МИА, 2010.
14. Феликсова JI., Шебекова В., Целипанова Е. и др. Гриппферон у детей, больных ОРВИ. Врач. 2001, 1:40-41.
15. Шумилов В.И., Шевцов В.А., Лобов С.П. Грипп и ОРВИ: неспецифическая профилактика с использованием генно-инженерного-а 2 интерферона и его новых форм. Лечащий врач. 2000, 9: 20-21.
16. Kneyber М.С., Moll H.A., de Groot R. Treatment and prevention of respiratory virus infection. Eur. J. Pediatr. 2000, 159 (6): 399-411.
17. Romero R., ChaiworapongsaT., GotschE etal. The diagnosis and management of preterm labor with intact membranes. Clin. Maternal. Fetal. Med. Online. 2012, 29. http://clini-calmaternalfetalmedicineonline.com/.
Поступила 19.09.16
Контактная информация: Костинов Михаил Петрович, д.м.н., проф.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-41-49
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
АА.Ртищев, Р.Р.Минтаев, В.Ю.Кост, И.Б.Коптяева, И.И.Акопова, К.В.Лисовская, С.Г.Маркушин
ВКЛЮЧЕНИЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В КОНСЕРВАТИВНЫЕ УЧАСТКИ РА-ГЕНА ПРИВОДИТ К АТТЕНУАЦИИ ВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А/\У81Ч/33
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Исследование возможности получения аттенуированных вариантов вируса гриппа с помощью включения специально подобранных сайт-специфических мутаций в консервативную последовательность РА-гена (концевую часть СООН-домена РА-гена) вирулентного штамма. Материалы и методы. В работе был использован вирулентный штамм вируса гриппа А/ЛУБЫ/ЗЗ. Включение сайт-специфических мутаций в РА-ген вирулентного штамма А/\УБМ/33 проводили с помощью двуступенчатой мутационной ПЦР. Клонирование осуществляли, используя СоШепСа1е реакцию. Использовали 8-плазмидную трансфекционную систему на основе вектора рН\У2000. Трансформацию проводили на рубидиевых компетентных бактериальных клетках штамма Е)Н5а. Трансфекцию делали при помощи реагента Lipofectamine 1ТХ (1пукго-gen) в кокультуре клеток 293Т и МОСК. Результаты. Показано, что трансфекганты, содержащие замену Б658А в СООН-домене РА-гена, приобрели 15-фенотип и резко снизили способность к размножению в легких мышей. Включение замены Р658А в СООН-домен РА-гена в комбинации с включением в геном вирулентного штамма 15-мутаций из генов ХА штаммов вируса гриппа приводило к получению трансфек-тантов, обладающих фенотипическими характеристиками, типичными для кандидатов в живые гриппозные вакцины. Заключение. Показана возможность получения аттенуированных вариантов вируса гриппа путем включения специально подобранных сайт-специфических мутаций в консервативную последовательность РА-гена.
Журн. микробиол., 2017, № 2, С. 45—53
Ключевые слова: вирус гриппа, сайт-специфические мутации, трансфектанты, атге-нуация, РА-ген
AA.Rtischev, R.R.Mintaev, V.Yu.Kost, I.B.Koptyaeva, I.LAkopova, K.V.Lisovskaya, S.G.Markushin
INCLUSION OF SITE-SPECIFIC MUTATIONS INTO CONSERVATIVE SEGMENTS OF PA-GENE RESULTS IN ATTENUATION OF VIRULENT INFLUENZA VIRUS STRAIN A/WSN/33
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia
Aim. Study the possibility of obtaining attenuated variants of influenza virus by including specially selected site-specific mutations into a conservative sequence of PA-gene (terminal segment of COOH-domain of the PA-gene) of a virulent strain. Materials and methods. А/ WSN/33 — a virulent strain of influenza virus was used in the study. Inclusion of site-specific mutations into PA-gene of the A/WSN/33 virulent strain was carried out using a two-step mutation PCR. Cloning was carried out using GoldenGate reaction. 8-plasmid transfection system based on pHW2000 vector was used. Transformation was carried out in rubidium competent bacterial cells of DH5a strain. Transfection was done using Lipofectamine LTX (Invitrogen) reagent in a 293Tand MDCKcells' co-culture. Results. Transfectants with F658A substitution in the COOH-domain of the PA-gene were shown to acquire ts-phenotype and sharply reduce the ability to reproduce in mice lungs. Introduction of F658A substitution into COOH-domain of the PA-gene in combination with introduction of ts-mutations from ca influenza virus strains into the genome of the virulent strain resulted in obtaining transfectants that have phenotypic characteristics typical for live influenza vaccine candidates. Conclusion. The ability to obtain attenuated variants of influenza viruses by introducing specially selected site-specific mutations into conservative sequence of the PA-gene is shown.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 2, P. 45-53
Key words: influenza virus, site-specific mutations, transfectants, attenuation, PA-gene
ВВЕДЕНИЕ
Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптиро-ванной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает наибольшей эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей [1,2]. Использование генно-инженерных технологий может поднять на новый уровень разработку живых гриппозных вакцин как в медицине, так и в ветеринарии. В последнее время большой интерес среди исследователей вызывает генно-инженерный подход, предполагающий прямое включение аттенуирующих мутаций в геном вирулентного штамма вируса гриппа [3,4,6—13]. Данные литературы за последний период свидетельствуют о том, что подавляющее большинство исследователей при этом использует стандартный набор ts-мутаций из ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (PBl-ген: К391Е, E581G, А661Т; РВ2-ген: N265S; NP-ген: D34G). Вместе с тем, по данным литературы использование данного набора не позволяет полностью атгенуировать не только пандемический штамм, но даже и некоторые вирулентные сезонные варианты вируса гриппа [13]. С целью решения данной проблемы в представленной работе предлагается еще один 46
методический подход — включение специально подобранных сайт-специфических мутаций в консервативные участки PA-гена вирулентного штамма вируса гриппа, а также использование этих мутаций в комбинации с сайт-специфическими мутациями из других генов, кодирующих белки по-лимеразного комплекса ХА штаммов—доноров: А/Краснодар/101/35/35/59 (H2N2); А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); А/Энн Арбор/6/60 (H2N2). Структурно-функциональные особенности РА-субъединицы полимеразного комплекса до настоящего времени изучены довольно поверхностно. Известно, что она содержит 2 больших домена: эндонуклеазный домен (аминокислотные остатки 1 — 197) и большой С-терминальный домен (аминокислотные остатки 257 — 716), который контактирует с первыми 15 аминокислотными остатками РВ1-субъединицы. Оба домена связаны линкером, состоящим из 60 аминокислотных остатков (197 — 257), образующих 3 спиральных сегмента. Линкерная область РА-субъединицы лежит на поверхности РВ1-субъединицы и является критической для сборки гетеродимера РВ1-РА и его импорта в клеточное ядро. Недавно было обнаружено, что линкерная область PA-белка является подходящим местом для включения сайт-специфических мутаций с целью конструирования новых живых гриппозных вакцин [3]. Мы со своей стороны попытались с той же целью использовать другую консервативную область РА-белка — концевую часть СООН-домена, где у ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 была обнаружена мутация F707L. С этой целью были сделаны аминокислотные замены в позициях 706 (W-A), 707 (F-L), 658 (F-A). В данной работе мы исследовали влияние этих мутаций на фенотипические маркеры вирулентного штамма A/WSN/33 при их включении в геном данного штамма одних или в комбинации с ts-мутациями, взятыми из генов, кодирующих белки полимеразного комплекса ХА штаммов вируса гриппа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе был использован вирулентный штамм вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1), полученный путем трансфекции из плазмид pHW2000, содержащих отдельные гены данного штамма. Восьми-плазмидная трансфекционная система на основе вектора pHW2000 была любезно предоставлена доктором Вебстером (Мемфис, США).
Все использованные в работе вирусы и сайт-специфические мутанты поддерживали путем пассажей в 10 — 11-дневных куриных эмбрионах (КЭ). Активность репродукции вирусов гриппа при разной температуре инкубации оценивали по результатам титрования в КЭ, инкубированным при 34°С, 37°С, 38°С, 39°С и выражали в RCT (reproductive capacity at different temperatures). RCT39=(lg ЭИД50/0,2 мл при 34°C - lg ЭИД5о/0,2 мл при 39°С). Вирусы считались температурочувствительными (ts-фенотип), если RCT39 был более 5.0 lg ЭИД5о/0,2 мл.
В опытах по трансфекции использовали культуру клеток Т293 и линию клеток MDCK, полученную из Института Пастера (Франция). Все клетки выращивались при 37°С в СОг-инкубаторе. Клеточные культуры пассировались на среде MEM (ПанЭко, Москва), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки и гентамицин в количестве 1 мг на 450 мл среды.
Для генно-инженерных работ со штаммом A/WSN/33 (Н1N1) вируса гриппа использовалась 8-плазмидная трансфекционная система на основе вектора pHW2000 [5]. Каждая из 8 плазмид содержала соответствующий ген вируса гриппа, фланкированный необходимыми регулирующими элементами для
сборки вируса в клеточной культуре при трансфекции. Для накопления плаз-мид использовали штамм Escherichia coli DH5alpha.
Вирусы накапливали в куриных эмбрионах по стандартной методике. Для последующего выделения РНК вирусы концентрировали центрифугированием. Вначале аллантоисную жидкость осаждали в центрифуге Beckman J2-21 (ротор JA-14) при 6000 об/мин в течение 30 мин для осаждения клеточного дебриса. Вирус осаждали из надосадочной жидкости на высокоскоростной центрифуге Beckman J2-21 с использованием ротора JA-14 (14000 об/мин, 2,5 часа). Осадок вирионов ресуспендировали в буфере STE (ЮшМ Tris-HCL, 100 mM NaCL, ImM EDTA, рН 7.4) в гомогенизаторе Даунса.
Для последующей постановки ПЦР выделяли вирусную РНК при помощи набора для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови (Лаборатория Изоген, Москва).
Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР при помощи реверта-зы M-MuLV (СибЭнзим, Новосибирск). ПЦР ставили с высокоточной по-лимеразой Tersus (Евроген, Москва). Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой агарозы осуществляли при помощи набора фирмы Fermentas (Thermo Fisher Scientific, США).
Мутагенез РА-гена проводился с помощью двуступенчатой мутационной ПЦР. Для очистки ПЦР продукта использовали Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit (кат. № 0702). Клонирование проводили с помощью так называемой GoldenGate реакции (http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone. 0003647). Использовались рестриктаза Esp3 (BsmBl) (Fermentas/Thermo-Scientific, кат. № ER0451), буфер 10х Fermentas Tango, T4 ДНК лигаза (Сибэнзим, кат. № ЕЗ19). Реакция проводилась в амплификаторе с программой 15 циклов по 5 минут при 37°С и 5 минут при 17°С. Трансформацию проводили на рубидиевых компетентных бактериальных клетках штамма DH5a. Скрининг клонов проводили при помощи ПЦР с последующим электрофо-ретическим анализом.
Секвенирование вставок в полученных плазмидах проводилось фирмой «Евроген» на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500.
Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen) либо в кокультуре клеток 293Т и MDCK, либо в однодневном монослое клеток 293Т.
Изучение att-фенотипа проводили по следующей методике: группы мышей весом 10 — 12 г (самки, по пять голов на группу) инфицировали интраназаль-но под легким эфирным наркозом анализируемыми вирусами (в дозе 50 мкл на мышь). Через 72 часа мышей усыпляли и извлекали легочную ткань, из которой готовили 10% суспензию в ступках с тертым стеклом. Инфекционный титр вируса в 10% суспензии легких определяли в куриных эмбрионах и выражали в lg ЭИД5о/0,2 мл. Все реассортанты были исследованы в трех независимых опытах.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием среднего квадратичного отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе работы нами был исследован ts-фенотип у вариантов штамма A/WSN/ 33, имеющих сайт-специфические мутации в РА-гене. Как видно из табл. 1, включение мутаций в концевую часть СООН-домена РА-гена «позиции 706 и 707 незначительно влияло на уровень размножения штамма A/wSN/ЗЗ в куриных эмбрионах при повышенной температуре. Однако ва-
риант штамма A/WSN/33 с сайт-специфической мутацией F658A в РА-гене снизил активность размножения в куриных эмбрионах при 38°С на 2.0 lg и больше, чем на 3.0 lg при 39°С. На следующем этапе работы был исследован ts-фенотип вариантов штамма A/WSN/33, имеющих ts-мутацию F658A в РА-гене в комбинации с сайт-специфическими мутациями в геноме из РВ1-гена различных штаммов вируса гриппа. Как видно из табл. 1, трансфектант №5 , имеющий в геноме единичную мутацию 1147Т из PBl-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59, полностью потерял способность к размножению при 39°С. Трансфектант №4, имеющий в геноме ts-мутации из PBl-гена ХА штамма А/Энн Арбор/ 6/60, характеризовался значительным снижением
Таблица 1. Изучение 15- и аМ-фенотипа вариантов штамма вируса гриппа А/\У81Ч/33, имеющих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса
Титр вируссодержащей жидкости Титр вируса
Исходный штамм и в куриных эмбрионах (ЭИДя/ОД мл) в легких мышей (lg ЭЙД»/ 0,2 мл)
полученные трансфектанты (Тр.) 34'С же 39'С
A/WSN/33 6.5±0,32 6.5±0,25 6,25±0,4 5,0±0,4
Тр. №1 PA* A/WSN/33** 5.5±0.4 5.5±0,2 н.д. 5.0+0.35
(W706A)"*
Тр. №2 PA A/WSN/33 6.0±0,25 н.д. 4.0± 0,5 4.0±0,2
(F707L)
Тр. №3 PAA/WSN/33 6.0±0,5 4.0±1.0 3.0±0,4 2.0±0,5
(F658A)
Тр. №4 РВ1 А/АА (K391E, 6.0±0.5 4.0±1.0 2.0±0,2 2.0±0.7
E581G, E457D)
PAA/WSN/33 (F658A)
Тр. №5 РВ1 А/Крз5 (I147T) 6.0±1.0 4.0±0.8 <1.0 <1.0
PAA/WSN/33 (F658A)
Тр. №6 PB1 А/Лен i? 6.0±0.4 4.0±0.5 4.0±0.4 2.5±0.35
(V591I)
PAA/WSN/33 (F658 А)
Тр. №7 РВ1 А/Лен,, 6.5+0.5 5.0±1.0 3.0+0.5 2.5±1.2
(V591I)
РВ2 А/Крз5 (V290L)
PAA/WSN/33 (F658A)
Тр№8 РВ1 А/АА(К391Е, 5.5± 0.35 3.5± 1.0 <1.0 <1.0
E581G, E457D)
РВ2 А/Крз5 (V290L)
PAA/WSN/33 (F658A)
Примечание.* Полимеразный ген; ** название штамма: А/ \\51М/33, А/АА - А/Энн Арбор/6/60, А/Ленп - А/Ленинград/134/ 17/57, А/Крз5- А/Краснодар/101/35/59; ""Локализация мутации, н.д. — не делали.
способности к размножению при 39°С. Далее мы исследовали ts-фенотип трансфектанта №6, унаследовавшего в геноме мутацию V591I из PBl-гена штамма А/Ленинград/134/17/57 в сочетании с мутацией F658A в РА-гене. Как видно из табл. 1, данный трансфектант характеризовался незначительным изменением уровня репродукции при 39°С. Принимая во внимание тот факт, что большинство полученных трансфектантов, имеющих в РА-гене мутацию F658A, характеризовались недостаточной атгенуацией, мы включили в геном штамма А/ WSN/33 дополнительную ts-мутацию, взятую из РВ2-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59. Полученные трансфектанты №7 и №8, имеющие в геноме сайт-специфические мутации из всех 3 генов, кодирующих белки полимеразного комплекса, обладали различным набором мутаций только в РВ1 -гене. Трансфектант №7 унаследовал одну ts-мутацию (V5911) в РВ 1 -гене из генома ХА штамма А/Ленинград/134/17/57. Трансфектант №8 приобрел 3 мутации из PBl-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (К391Е, E581G, E457D). Как видно из табл. 1, трансфектант №7 показал незначительное изменение ts-фенотипа, в то время как трансфектант №8 полностью утратил способность к размножению при непермиссивных условиях.
При изучении весовых характеристик мышей, инфицированных интрана-зально вариантами штамма A/WSN/33, содержащими сайт-специфические мутации в генах, кодирующие белки полимеразного комплекса РВ1, РВ2 и РА, было установлено, что мыши, инфицированные исходным вирулентным
штаммом А/\¥81Ч/33, характеризовались быстрой и значительной потерей веса после интраназального заражения в дозе 1050 ЭИД5о/0,05 мл. На 8 — 9 сутки после инфицирования часть мышей погибла. Мыши, инфицированные трансфектантами №4, №5, №6, показывали различные, но менее выраженные темпы падения веса (рис.). Наибольшую потерю веса обнаружили мыши, инфицированные трансфектантом №6, имеющем в РВ1-гене мутацию У5911, унаследованную из РВ1-генаХА штамма А/Ленинград/17/134/57. Мыши, инфицированные трансфектантами №7 и №8, показывали меньшую потерю веса на протяжении всего срока наблюдения. Можно было сделать вывод, что мутация У5911 в РВ1-гене незначительно влияла на снижение вирулентности трансфектанта №6.
Далее изучали ай-фенотип полученных сайт-специфических мутантов штамма А/\\^Ы/33. Исследованные трансфектанты значительно различались по степени размножения в легочной ткани мышей. Как видно из табл. 1, среди трансфектантов, имеющих единичные замены в концевой области СООН-домена РА-гена, только трансфектант с мутацией Б658Арезко снизил уровень вирусного размножения в легочной ткани мышей. Трансфектанты, унаследовавшие мутации \V706A и Б707Ь в РА-гене, практически не отличались по вирулентности для мышей от исходного штамма А/\У5М/33. Среди трансфектантов, имеющих 15-мутации в РВ1-гене и РА-гене, полной потерей размножения в легких мышей характеризовался только трансфектант №5, имеющий в РВ1-гене мутацию 1147Т от ХА штамма А/Краснодар/101/35/59. Два другие трансфектанта демонстрировали сниженное, но заметное размножение вируса в легочной ткани мышей. В заключительной части этого раздела работы мы исследовали аМ-фенотип трансфектантов, имеющих 1з-мутации в генах, кодирующих все три субъединицы полимеразного комплекса вируса гриппа. Как видно из табл. 1, трансфектанты №7 и №8 имели значительные различия по данному маркеру. Если трансфектант №8 потерял способность размножаться в легких мышей, то трансфектант №7 размножался в легких достаточно активно.
На следующем этапе работы нами был проведен сравнительный анализ
иммуногенности трансфектантов, имеющих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса. Необходимо было выяснить, могут ли эти варианты со сниженной способностью к размножению в легких мышей индуцировать достаточно высокий гуморальный иммунитет у мышей в ответ на интраназаль-ное заражение. Наличие значительного титра антител в крови мышей, иммунизированных трансфектантами, дало бы возможность рассматривать их в качестве перспективных кандидатов в живые гриппозные вакцины. Трансфектанты №4, №5, №6, взятые для исследования,
Потеря веса мышей, инфицированных вариантами вируса гриппа, имеющими сайт-специфические мутации в генах полимеразного комплекса.
По оси абсцисс — время (сут), прошедшее с момента инфицирования мышей сайт-специфическими мутантами штамма А/\У8М/33 вируса гриппа; по оси ординат — потеря веса мышей, инфицированных сайт-специфическими мутантами (%); 1 - Тр. № 4, 2 — Тр. №5,3-Тр. № 6.
имели общую мутацию F658A в PA-гене, однако различные мутации в РВ1 - гене. Как видно из табл. 2, трансфектанты №4, №5 и №6, имеющие соответственно три мутации (К391Е, E581G, E457D) из РВ1гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60, одну мутацию из PBl-гена (I147T) штамма А/Краснодар/101/35/59 и ts-мутацию (V591I) из PBl-гена А/Ленинград/134/17/ 57, индуцировали умеренный уровень гуморального иммунитета у мышей. Мыши, иммунизированные транс-фектантом №8, имеющим сайт-специфические мутации в 3 генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, также характеризовались умеренным уровнем гуморального иммунитета.
В опытах на мышах нами была исследована защитная эффективность трансфектантов №4, №5, №6, №8. Мышей вакцинировали дважды интрана-зально исследуемыми вирусами в дозе 105 0 ЭИД50. /0,05мл с последующим инфицированием вирулентным штаммом A/WSN/33 в дозе 102 0 ЭИД50 /0,05 мл. Титр вирулентного штамма легких при заражении невакцинированных мышей составлял 103 5 ЭИД5о/0,2 мл. В легких мышей, вакцинированных трансфектантами №4, №5, №6, №8, не наблюдалось вирусного размножения. Интересно отметить, что трансфектанты, индуцирующие умеренный уровень гуморальных антител (1:160 — 1:320), обеспечивали полную защитную эффективность при иммунизации, что, по-видимому, можно объяснить значительной активизацией в данном случае клеточного иммунитета.
ОБСУЖДЕНИЕ
Введение в практику получения гриппозных живых вакцин генно-инженерных подходов может значительно оптимизировать отдельные этапы этого процесса. В последнее время большой интерес вызывает генно-инженерный подход, предполагающий получение вакцинных вариантов путем прямого включения в геном вирулентных штаммов вируса гриппа заранее известных и изученных ts-мутаций, взятых из генома ХА штаммов — доноров атгенуации. Вместе с тем, не менее перспективным подходом в этом направлении может быть включение атгенуирующих мутаций в функционально важные сайты консервативных последовательностей генома вирулентного штамма. Примером может служить обнаружение в линкерной области РА-гена вирулентного штамма А/WSN/33 функционально важных сайтов, включение в которые мутационных замен приводило к появлению вакцинных вариантов [3]. Используя этот методический подход, мы включили мутационную замену F658A в другой функционально важный сайт PA-гена штамма A/WSN/33 — концевую область СООН-домена этого гена, что также привело к аттенуации этого штамма.
Как показали наши исследования, более глубокая аттенуация вирулент-
Таблица 2. Изучение иммуногенности вариантов штамма вируса гриппа А/\У5ГЧ/33 с сайт-специфическими 1$-мутациями в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса
Титр сывороточных антител в РЗГА
при взаимодействии вирусов с антисыворотками*
Сыворотка Антигены
Тр. №4 Тр. №5 Тр. №6 Тр. №8
Тр. №4 1:160-1:320
Тр. №5 1:160
Тр.Маб 1:160-1:320
Тр. №8 1:320
Неим. сыв. <:10 <1:10 <1:10 <1:10
Примечание. * Реакцию задержки (торможения) гемагтлютинации (РЗГА) с вирусами гриппа проводили согласно МУ 3.3.2. 1758-03. За титр сыворотки принимали предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагтлютинации. Тр. — трансфектант.
ного штамма A/WSN/33 может быть достигнута путем комбинированного включения в его РА-ген аттенуирующей замены F658A и ts-мутаций из генов, кодирующих белки полимеразного комплекса ХА штаммов вируса гриппа. Трансфектанты №5 и №8, содержащие замену F658A в РА-гене в сочетании с ts-мутациями из генов, кодирующих белки полимеразного комплекса ХА штаммов, имели удовлетворительные фенотипические характеристики. Они не размножались в куриных эмбрионах при непермиссивных условиях, полностью потеряли вирулентность для мышей при интраназальном заражении и обладали защитной эффективностью при заражении мышей вирулентным штаммом. Таким образом, использованный нами подход оказался весьма перспективным. Интересно отметить, что трансфектанты №5 и №8, индуцирующие у иммунизированных мышей умеренный уровень гуморальных антител, тем не менее, обладали удовлетворительной защитной эффективностью. В этой связи, можно предположить, что при интраназальной иммунизации полученными трансфектантами наблюдается значительная активация клеточного иммунитета.
По данным некоторых исследователей [6,12] феномен констелляции генов значительно ограничивает включение мутаций в несколько различных генов вирулентного штамма с целью модификации его генома, что значительно усложняет использование данного генетического подхода для получения ат-тенуированных вариантов вируса гриппа А. Тем не менее, в данной работе показана возможность создания мутационных замен различного происхождения в 3 генах, кодирующих белки полимеразного комплекса вирулентного штамма. Исследование генетической стабильности полученных трансфектан-тов с оптимальными фенотипическими характеристиками даст возможность оценить их в качестве возможных кандидатов в живые гриппозные вакцины.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексадрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. Санкт-Петербург, Наука, 1994.
2. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М. и др. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопросы вирусологии. 2013, 1:11-17.
3. Da Costa В., Sausset A., Munier S. et al. Temperature-sensitive mutants in the influenza Avirus RNA polymerase: alterations in the PA linker reduce nuclear targeting of the PB1-PA dimer and result in viral attenuation. J. Virol. 2015, 89 (12): 6376- 6390.
4. Hickman D., Hossain J., Song H. et al. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines. J. Gen. Virol. 2008,89:26822690.
5. Hoffmann E., Neumann G., Hobom G. et al. Ambisense approach for the generation of influenza Avirus: vRNA and mRNA synthesis from one template. Virology. 2000,267 (2): 310-317.
6. Jin H., Zhou H., Lu B. et al. Imparting temperature sensitivity and attenuation in ferrets to A/Puerto Rico/8/34 influenza virus by transferring the genetic signature for temperature sensitivity from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. J. Virol. 2004, 78 (2): 995-998.
7. Parkin N., Chiu P., Coelingh K. Genetically engineering live attenuated influenza A virus vaccine candidates. J. Virol. 1997,71 (4): 2772-2778.
8. Pena L., Vincent A., Ye J. et al. Modifications in the polymerase genes of a swine-like triple-reassortant influenza virus to generate live attenuated vaccines against 2009 pandemic H1N1 viruses. J. Virol. 2011,85 (1): 456-469.
9. Solorzano A.,Li Yo., Perez D.R. Alternative live — attenuated influenza vaccines based on modification in the polymerase genes protect against epidemic and pandemic flu. J. Virol. 2010, 84 (9): 4587-4596.
10. Song H., Nieto G., Perez D. A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates. J. Virol. 2007,81 (17): 9238-9248.
11. Subbarao E.K., Kawaoka Y.,Murphy B.R. Rescue of an influenza A virus wild-type 7227PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature — sensitive and attenuating mutation. J. Virol. 1993, 67 (12): 7223- 7227.
12. Subbarao K., Park E., Lawson C. et al. Sequential addition temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and attenuation and permits the rational design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine. J. Virol. 1995, 69 (10): 5969-5977.
13. Zhou В., Li Yo., Speer S. et al. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses. "Vaccine. 2012, 30 (24): 3691-3702.
Поступила 26.09.16
Контактная информация: Ртищев Артем Андреевич,
115088, Москва, 1 Дубровская ул., 15, р.т. (495)674-02-47
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
А.В.Шиповалов1, А.Г.Дурыманов', О.В.Петрова1, Е.В.Иванова2,
A.В.Епанчинцева', С.В.Святченко1, С.В.Мальцев', В.Ю.Марченко1,
B.Н.Михеев1, А.Б.Рыжиков1, Т.Н.Ильичева1
АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИОННОГО ИММУНИТЕТА К ГРИППУ НАКАНУНЕ ЭПИДЕМИЧЕСКИХ СЕЗОНОВ В 2014 Г. И 2015 Г.
'Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», пос. Кольцово, Новосибирская область, 2Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области, Новосибирск
Цель. Контроль за коллективным иммунитетом населения к сезонным вирусам гриппа, а также надзор за появлением в сыворотках крови людей антител к вирусам гриппа с пандемическим потенциалом. Материалы и методы. Реакция торможения гемагглютинации с вакцинными и эпидемическими штаммами вируса гриппа, а также с высокопатогенными вирусами гриппа птиц А/гоок/СЬапу/32/2015 (Н5М1) (сШе 2.3.2.1с.) и А/Ап11ш/01/2013 (Н7Ш). Результаты. Среди всех образцов сыворотки, собранных осенью 2014 г. и осенью 2015 г., ни один не реагировал в РТГА с антигенами А(Н5Ш) и А(Н7Ы9) даже в разведении 1:10. Из образцов, собранных осенью 2014 года, 41 % были позитивными к вирусу А/СаНАэгта/07/09(Н 1N1 рс!т09), 36% позитивны к А/Теха5!/50/2012 (НЗЫ2), 40% положительны к В/Вп5Ьапе/60/2008 (УкМт.) и 47% взаимодействовали в РТГА со штаммом В/Ма55ас1ш5еи5/2/2012 (Уат.Нп.). 22% всех образцов имели титр ниже 40 со всеми антигенами, и только 10% имели в РТГА титр 40 и более со всеми вакцинными штаммами. Среди образцов, собранных осенью 2015 года, количество серопозитивных к штамму А/СаНРогта/07/09(Н11Я^т09) колебалось от 31 % в Уральском ФО до 46% в Южном ФО. Количество серопозитивных к штамму A/Switzerland/9715293/13 (НЗЫ2) было на уровне 4 — 13% во всех ФО, кроме Уральского, в котором этот показатель был немного выше 30%. Количество серо-позитивных к вакцинным штаммам вируса гриппа В колебалось от 23 до 76%. Титр в РТГА равный или выше 40 со всеми вакцинными штаммами имели только 2% сывороток, серонегативными оказались 29% всех образцов. Заключение. Популяционный иммунитет населения России к вирусу гриппа А(НЗЫ2) находится на очень низком уровне, поэтому социально значимые последствия от эпидемии гриппа во многом будут зависеть от кампании по вакцинации осенью 2016 года.
Журн. микробиол., 2017, № 2, С. 53-60
