CC BY
76
УДК 632.3
Вирус мозаики турнепса передается семенами
И.А. ЗУБАРЕВА,
аспирант Центра «Биоинженерия» РАН
А.Н. ИГНАТОВ,
ведущий научный сотрудник
Т.Н. ГРИБОВА,
старший научный сотрудник
С.Г. МОНАХОС,
старший научный сотрудник
РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева
Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus - TuMV) заражает не менее 318 видов растений-хозяев из 156 родов 43 семейств, включая все возделываемые, декоративные, дикорастущие и сорные виды сем. Капустные. По распространенности и вредоносности TuMV находится на втором месте, уступая лишь вирусу мозаики огурца, а в некоторых странах, например Китае, он является самым опасным возбудителем заболеваний многих сельскохозяйственных культур, превосходя даже грибные и бактериальные патогены [8]. Из-за вызываемой вирусом деформации листьев снижается товарность продукции [4], а более тяжелые повреждения ведут к гибели
растения [9]. В центральной Азии, где выращиваются разновидности Brassica rapa, вирус мозаики турнепса приводит к большим потерям урожая и снижает его качество. В Европе, где широко возделывают растения вида B. oleracea (капуста кочанная, цветная, брюссельская и брокколи), TuMV является одной из главных проблем получения качественной продукции этих культур. Общие потери урожая от TuMV составляют от 3,5 до 100 % [1, 5, 7].
Поскольку восприимчивые к TuMV растения семейства Капустные редко дают жизнеспособные семена, и в то же время известны штаммы вируса, неспособные распространяться насекомыми-переносчиками, нами было сделано предположение о возможной передаче TuMV с семенами толерантных (бессимптомных, но накапливающих вирус в тканях) растений, которое было подтверждено экспериментально.
Коллекцию растений семейства Brassicaceae (64 образца) механически инокулировали в фазе 2-3 настоящих листьев штаммом TuMV I2
[3]. Симптомы заболевания сначала определяли визуально и оценивали по 9-балльным шкалам в течение 4 недель после инокуляции. Для подтверждения наличия вируса в растениях проводили иммунофермент-ный анализ методом двойного сэндвича ELISA (Double antibody sandwich (DAS)-ELISA) с использованием поликлональных антител к TuMV, входящих в состав тест-системы NEOGEN (Великобритания).
Слабовосприимчивые образцы ярового рапса (B. napus) - Cobra spring (1), Галакси (5), CrGC 5.1 (10), № 423 (24), № 8 (26), Aomory (30), Aomory 1 (39), Ратник (45); горчицы индийской (B. juncea) - Лада (3а); Florida Broad Leaf mustard 1 (8a) и толерантный к вирусу образец B. rapa STT (7) были доведены до цветения, самоопылены, и с них собраны семена.
Перед тестированием семян на наличие в них вирусной инфекции проводили поверхностное обеззараживание. Для установления механизма передачи вирусной инфекции из стерильных семян выделяли зародыши. Через 14 дней индивидуальные проростки из зародышей использовали для диагностики зараженности вирусом. Обнаружение TuMV в семенах, зародышах и взрослых растениях, выросших из семян,
Инфицированные TUMV растения B. napus (а, с) и B. rapa (b) на 30-й день после инокуляции
проводили при помощи реакции обратной транскрипции и ПЦР с использованием специфических пар праймеров для гена P1.
Диагностику TuMV в растениях методом инокуляции семядольных листьев проводили по методике Холмса [2]. В качестве индикаторных были использованы растения Cucurbito pepo (вид сем. Тыквенные), восприимчивые к данному вирусу.
Растения механически инокули-ровали в фазе появления первого настоящего листа. Повторность -10 растений C. pepo (20 семядольных листьев) на 1 исследуемый образец. Перед инокуляцией горшки с проростками помещали в темноту на 12-16 часов при температуре +10 °С. Через 5-7 дней после заражения инокулированные листья срезали и помещали на несколько секунд в кипящую воду, затем экстрагировали хлорофилл погружением на 2-3 часа в 96 % этанол при 40 °С. Обесцвеченные листья промывали дистиллированной водой и погружали на несколько секунд в раствор йода в йодистом калии. Ранее невидимые крахмальные паранекрозы в точках заражения после такой обработки проявлялись в виде мелких темно-синих пятен.
Из 64 образцов коллекции растений рода Brassica, инокулированных штаммом TuMV I2, 29 показали положительную реакцию на вирус по визуальной оценке (см. фото), включая хлоротичную пятнистость листьев (до 8 баллов), морщинистость листьев (до 4 баллов) и угнетение роста и развития растений. Результаты визуальной оценки были подтверждены ИФА с использованием поликлональных антител к TuMV, кроме того, было выявлено два толерантных растения, то есть несмотря на отсутствие внешних симптомов заражения в условиях эксперимента, вирус свободно реплицировался и распространялся в них.
Со всех толерантных и слабовосприимчивых образцов, достигших фазы цветения, после самоопыления были собраны семена. При условиях, благоприятных для накопле-
ния вирусной инфекции в растениях (+25 °С), через 20-25 дней у растений 6 образцов проявились симптомы. Со всех образцов был собран материал для проверки наличия вируса другими методами. ИФА, ОТ-ПЦР и метод инокуляции семядольных листьев С. реро по Холмсу показали наличие TuMV в 8 образцах (в том числе одном толерантном к TuMV I2) из 9.
Для изучения механизма передачи семенной инфекции отбирали пробы по 10 семян каждого из четырех образцов для индивидуального анализа зародышей семян на присутствие в них TuMV методом ИФА, ОТ-ПЦР и методикой Холмса. В зародышах семян образцов 45 и 3а реакция на вирус была положительной для всех используемых методов со средней частотой заражения соответственно 40 и 30 %.
Для молекулярной характеристики передаваемого семенами вируса с помощью ОТ-ПЦР с использованием специфических пар праймеров амплифицировали и секвенировали фрагменты кДНК генов Р1, NIb и СР.
Нуклеотидные последовательности участков трех генов вируса были идентичны исходному штамму I2, а сравнение их с последовательностями базы данных выявило наиболее близкий изолят TuMV UK1 (Великобритания) с идентичностью 99 %. Данный факт согласуется с информацией о первом появлении заболевания на Селекционной станции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева после испытания коллекции сортов B. rapa, завезенной в Россию из Великобритании (Г.Ф. Монахос, личное сообщение).
Таким образом, полученные в ходе эксперимента данные впервые показали присутствие вируса в зародыше семени и передачу TuMV с семенами растений рода Brassica.
С помощью ОТ-ПЦР вирус обнаруживается на всех стадиях развития растений (от семени и зародыша до взрослого растения). ИФА выявляет TuMV во взрослых растениях, а в зародышах и семенах - только при достижении высокой концентрации вирусных частиц.
Метод инокуляции семядольных растений С. реро по Холмсу дает результаты, сопоставимые по чувствительности и надежности с другими методиками, что позволяет рекомендовать его для применения в качестве метода экспресс-диагностики TuMV.
В литературе имеется лишь одно упоминание об обнаружении TuMV на семенах Raphanus raphanistrum с частотой 4 % [6], но факт заражения следующего поколения растений при этом показан не был.
Примерно 14 % известных вирусов растений передается через семена хотя бы одного из растений-хозяев. Группа Потивирусов включает в себя 179 видов, из которых менее 10 % передаются с семенами с частотой от 1 до 80 %.
Передача вируса с семенами имеет важные экономические последствия, так как обеспечивает наиболее опасный способ распространения и сохранения вирусной инфекции и создает очаги первичной инфекции при посеве/посадке растений в поле. Вирусы могут сохраняться в семени в течение длительного времени и распространяться на большие расстояния. Для сдерживания распространения TuMV на территории РФ необходимо проводить проверку зараженности этим вирусом семян овощных и масличных крестоцветных культур.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ГК № 16.518.11.7036.
ЛИТЕРАТУРА
1. AhlawatY.S., ChenuluV.V. Losses due to radish mosaic causes by a strain of Turnip mosaic virus and its control // Indian Phytopathology, 1982, vol. 35, № 2, р. 255-260.
2. Holmes F.O. Local lesions in tobacco mosaic // Bot. Gazette, 1929, vol. 87, p. 39-55.
3. Jenner C.E., Walsh J.A. Pathotypic variation in turnip mosaic virus with special reference to European isolates // Plant Pathol., 1996, vol. 45, p. 848-856.
4. Shattuck V.I. The Biology, Epidemiology, and Control of Turnip Mosaic
Virus // Plant Breed Rev., 1992, vol. 14, p. 199-238.
5. Tomlinson J.A. Epidemiology and control of virus diseases of vegetables // Ann. Appl. Biol., 1987, vol. 110, p. 661-681.
6. Tomlinson J.A., Walker V.M. Further studies on seed transmission in the ecology of some aphid-transmitted viruses // Ann. appl. Biol., 1973, vol. 73, p. 293-298.
7. WalkeyD.G.A., PinkD.A.C. Reactions of white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) to four different strains of Turnip mosaic virus // Ann. Appl. Biol., 1988, vol. 112, p. 273-284.
8. Walsh J.A., Jenner C.E. Resistance to Turnip mosaic virus in the Brassicaceae. In: Natural Resistance Mechanisms of Plants to Viruses. - 2006, p. 415-430.
9. Walsh J.A., Tomlinson J.A. Viruses infecting winter oilseed rape (Brassica napus ssp. oleifera) // Annals of Applied Biology, 1985, vol. 107, p. 485-495.
Аннотация. Для определения возможности передачи вируса мозаики турнепса (TuMV) семенами с инфицированных вирусом восприимчивых и толерантных к TuMV образцов рода Brassica были собраны семена. Полученные из них растения диагностировали на зараженность TuMV визуально, методом ИФА, ОТ-ПЦР и с использованием растений-индикаторов по методике Холмса с модификациями. Все методы диагностики показали наличие вируса в растениях с частотой передачи до 40 %. С помощью выделения и индивидуальной диагностики зародышей семян была доказана передача вируса через заражение зародыша. Впервые установлена зависимость передачи штамма I2 TuMV с семенами от генотипа растения.
Ключевые слова. Turnip mosaic virus, Brassica, ОТ-ПЦР, ИФА, секвенирование.
Abstract. Seeds were collected from infected by Turnip mosaic virus (TuMV) susceptible and tolerant Brassica plants to determine transmission of the virus with seeds. Presence of TuMV was diagnosed visually, ELISA, RT-PCR and indicator plants reaction (Holmes' method). All diagnostic methods showed that up to 40 % of the seeds contained TuMV. Individual embryos contained virus infection as well that shows the possibility of transmission through inner seed contamination. For the first time, we found plant-genotype depended transmission of TuMV strain I2 with the seeds of brassicas.
Keywords. Turnip mosaic virus, Brassica, RT-PCR, DAS-ELISA, sequencing.
На книжную полку_
«Развитие отечественной гербо-логии на современном этапе», авторы Ю.Я. Спиридонов и В.Г. Шеста-ков. М.: «ПЕЧАТНЫЙ ГОРОД», 2012, 360 с.
В монографии на основании большого фактического материала, включающего результаты многолетних исследований коллектива отдела гербологии ВНИИФ, представлена единая концептуальная система создания новых гербицидов, отвечающих современным требованиям к их эффективности и экологической безопасности при использовании в практическом растениеводстве или для контроля нежелательной растительности на землях несельскохозяйственного пользования.
Авторами подробно рассматриваются все этапы практической реализации этой важной научно-исследовательской задачи, как в интересах сельского хозяйства, так и в коммунально-рекреационных целях или на промышленных объектах, включая транспортные магистрали, линии электропередач, нефте- и газопроводы, различного типа полигоны и т.п. Большое внимание уделено мониторингу засоренности посевов сельскохозяйственных культур в зависимости от технологии их выращивания и погодно-климатических условий вегетационных сезонов 2006—2010 гг., что важно для определения стратегии поиска и отбора гербицидов нового поколения. В результате всесторонних исследований авторов по оптимизации препаративных форм фито-токсикантов ассортимент гербицидов обогатился запатентованными препаратами отечественной разработки.
В работе отражены сведения об экологической безопасности одного из альтернативных путей эффективной борьбы с сорняками в посевах
ряда сельскохозяйственных культур, которым приданы гербицидрезис-тентные свойства (генетически модифицированные растения), способствующие возможности применения повышенных доз гербицидов с высокой биологической (технической) эффективностью без существенных отрицательных последствий для аг-роценоза. Значительный интерес представляют экспериментально доказанные характеристики динамики естественной детоксикации герби-цидных препаратов и пути повышения детоксикационного процесса ре-медиации загрязненных их остатками почв путем применения искусственных сорбентов-детоксикантов на основе активных углей.
Изложенные в монографии материалы показывают, что наиболее оптимальной технологией обработки посевов гербицидами является УМО опрыскивание посевов с нормой расхода рабочей жидкости 5—10 л/га при дисперсности капель 150 мкм в диаметре. Для этой цели предлагаются разработанные во ВНИИФ опрыскиватели как для лабораторных исследований, так и для проведения полевых опытов.
Авторами разработаны и рекомендованы для практического растениеводства интегрированные системы комплексной защиты посевов зерновых культур от сорняков, болезней и насекомых-вредителей с помощью оптимизированных схем применения пестицидов с высокой биологической и хозяйственной эффективностью.
Монография представляет интерес для специалистов, работающих в области разработки новых гербицид-ных препаратов и технологий их практического применения, а также для студентов учебных заведений сельскохозяйственного и биологического профиля.
Справки и заказ книг по тел./факс: (495) 789-9359, 979-9359, 971-2997 или по r-mail:[email protected]
