CC BY
51
А. А. Петропавловский, В. Н. Никитина
ВИДОВОЙ СОСТАВ ТЕРМОФИЛЬНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ НЕКОТОРЫХ ИСТОЧНИКОВ ПАУЖЕТСКОГО ГЕОТЕРМАЛЬНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ (П-ОВ КАМЧАТКА)
И ОСОБЕННОСТИ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
В природных гидротермальных биотопах цианобактерии являются во многих случаях доминантной группой оксигенных фототрофных микроорганизмов [6, 7]. Цианобактерии устойчивы к воздействию высокой температуры, избыточных концентраций химических веществ и развиваются на разнообразных субстратах в водных и вневодных местообитаниях [1]. Во многих случаях распределение видов цианобактерий в биотопе диктуется рН воды, температурой и содержанием сероводорода [1, 8], однако, несмотря на довольно полные сведения о распространении цианобактерий в гидротермах Земного шара [2, 3, 9, 10], существует недостаточно данных о конкретных факторах, влияющих на видовой состав термофильных цианобактериальных сообществ. Для того, чтобы понять принципы формирования термальных сообществ цианобактерий, необходимо изучение закономерностей распределения видов по градиентам экологических факторов в естественных условиях обитания и изучение экофизиологических особенностей различных видов [1]. Источники Паужетского геотермального месторождения представляют собой удачный объект для изучения механизмов образования цианобактериальных сообществ, поскольку в данном регионе имеются крупные выходы термальных вод с разными физико-химическими параметрами.
Цель настоящей работы — изучить изменение видового состава цианобактерий различных сообществ по ходу термального потока и выяснить некоторые экофизиологи-ческие особенности цианобактерий в накопительных культурах, полученных из этих сообществ, в частности — влияние кислородного режима культивирования и минерального состава среды на рост и видовой состав цианобактерий.
Материалы и методы исследования
Воды Паужетского геотермального месторождения в районе исследования относятся к гидрокарбонатно-сульфатным/аммониевым по своему составу, с большим содержанием сульфатов (до 600 мг/л), кремния (до 200 мг/л) в виде Щ8Ю4 (раств.) и общей минерализацией до 3000 мг/л.
Отбор образцов цианобактерий осуществлялся летом 2008 г. из геотермального потока скважины И120. Часть проб фиксировалась в 4%-ном растворе формалина, другая часть, предназначенная для посева культур, оставалась нефиксированной. Пробы отбирались по ходу потока воды, начиная от места очевидного роста фототрофных сообществ (приблизительно 70 м от места сброса термальной воды, или зумфа). Пробы просматривали под микроскопом МИКМЕД-5 при увеличении х400 и х1000. Выращивание в накопительных культурах проводили в стандартных пробирках при температуре 42—46° С на минеральных средах различного состава, в частности среде Громова № 6 (г/л): KNOз — 1,0; K2HPO4•3H2O — 0,2; MgSO4•7H2O — 0,2; CaCl2•2H2O — 0,15;
© А. А. Петропавловский, В. Н. Никитина, 2010
NaHCO3 — 0,2; где микроэлементы добавлялись в виде смеси A5 + Co (г/л): H3BO3 — 2,86; MnCl24H2O —1,81; ZnSO4-7^O — 0,222; Na2MoO4-2^O — 0,390; CuSO4-5^O — 0,079; Co(NO3)2-6H2O — 0,049, железо — 1 мл раствора FeCl3-6H2O (2 г/л), или на минеральной среде, условно обозначенной нами R, следующего состава (г/л): (NH4^HPO4 — 1,0; MgSO4-7H2O — 0,2; CaCl2-2H2O — 0,1; KCl — 0,1, микроэлементы A5 + Co, железо — 1 мл раствора FeCl3-6H2O (2 г/л). В отдельных случаях, для создания микроаэрофиль-ных условий минеральную среду кипятили, разливали в пробирки и заливали вазелиновым маслом, после чего производили засев.
Для освещения использовали шесть стандартных люминесцентных ламп по 20 Вт каждая. Измерение интенсивности света измеряли люксметром.
В качестве критерия физиологического состояния водорослей была принята интенсивность окраски трихом.
Для установления видовой принадлежности цианобактерий использовали «Определитель пресноводных водорослей СССР» [4] и определитель «Süsswasserflora von Mitteleuropa» [11].
Результаты исследования
Описание видового состава цианобактерий природных образцов и накопительных культур дано в табл. 1.
В природных образцах 120-6 и 120-8 (субстрат — гейзерит) были обнаружены вид M. laminosus f. pseudoanabaenoides, который по классификации Иржи Комарека и Константина Анагностидиса [11] отнесен к виду Komvophoron jovis (Copeland) Anagnostidis et Komarek и вид Ph. angustissimum, при этом доминантным видом, скорее, являлся Ph. angustissimum, если судить по количеству трихом, и возможно, функционально главной частью сообщества. В других пробах данный вид в отличие от M. laminosus f.
Таблица 1. Физико-химические параметры воды в точках отбора, видовой состав природных образцов и морфология сообществ потока К120
Номер образца Расстояние от зумфа, м Температура воды в точке отбора пробы, °С pH Eh (мВ) Внешний вид сообщества в точке отбора Видовой состав природных образцов
120-4 75 59,5 8,6 0 Нити темно-зеленого цветя Виды рода Phormidium
120-5 81 39,0 8,4 36 Темно-зеленые, почти черные образования в виде матов, покрывающих участки субстрата в потоке воды Oscillatoria limosa Ag. (монокультура)
120-6 ИЗ 41,6 8,4 40 Пластинчатые наслоения на гейзерите желто-зеленого цветя Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides Fremy, Phormidium angustissimum W.et G.S. West
120-7 191 41,5 8,4 20 Темно-зеленые нитевидные скопления по всей поверхности потока Виды рода Phormidium
120-8 348 43,4 8,4 51 Пластинчатые наслоения на гейзерите желто-зеленого цвета Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides Fremy, Phormidium angustissimum W. et G.S. West
pseudoanabaenoides обнаружен не был. В ходе культивирования во всех остальных пробах, кроме образца 120-5, также был обнаружен M. laminosus f. pseudoanabaenoides, который стал доминантным в процессе роста на минеральной среде. Таким образом, можно предположить, что в образцах он присутствовал в качестве минорного компонента, а затем оказался более конкурентоспособным при росте на минеральной среде в искусственных условиях.
Для получения накопительных культур были опробованы минеральные среды различного состава, кроме того, были испытаны разные световые условия культивирования, а также аэробный и микроаэрофильный режимы выращивания.
При росте на искусственных средах в накопительных культурах соответствующих образцов были обнаружены следующие виды (табл. 2).
Обсуждение результатов исследования
В природных образцах обнаружилось доминирование одного-двух видов цианобактерий, что является типичным для термальных условий обитания [1]. В данном случае мы наблюдаем, что при приблизительно одинаковых значениях температуры и рН воды состав сообществ разный, что, вероятно, может объясняться разным Eh воды [12] или другими локальными факторами, например, конкуренцией с другими видами водорослей [13], характером субстрата, структурой сообщества и др.
При культивировании в искусственных условиях отмечен активный рост вида M. laminosus f. pseudoanabaenoides на средах различного минерального состава, особенно на среде Громова № 6. В противоположность этому трихомы O. limosa обесцвечивались при выращивании на жидкой минеральной среде любого состава в тех же условиях, что и M. laminosus, при этом в затемненных условиях (в пробирках, полностью либо частично завернутых в фольгу, а также при затемнении четырьмя слоями фильтровальной бумаги) темно-зеленая окраска трихомов сохранялась. Трихомы, высеянные на агаризованную минеральную среду также обесцвечивались, даже если чашка была закрыта одним слоем фильтровальной бумаги. Таким образом, был сделан предварительный вывод о чувствительности данного вида или точнее его термофильной расы (штамма) к освещенности. Реакция на изменение освещенности является одной из важных физиологических характеристик цианобактерий [14], и чувствительность O. limosa к свету, возможно, косвенно свидетельствует о содержании кислорода в сообществе 120-5. На жидкой минеральной среде и при снижении интенсивности света на два порядка с помощью четырех слоев фильтровальной бумаги (по показаниям люксметра) окраска трихомов сохранялась.
Получить какие-либо накопительные цианобактериальные культуры из образцов 120-7 и 120-4 (кроме M. laminosus и Schizotrix sp.) до настоящего времени не удалось.
M. laminosus f. pseudoanabaenoides интенсивно рос как на жидкой, так и на агаризо-ванной (1,5%) минеральной среде любого опробованного состава в отличие от O. limosa. Кроме того, этот вид, по-видимому, присутствовал в качестве минорного компонента во всех образцах, кроме 120-5, так как он обнаружился в накопительных культурах через некоторое время. Известно, что этот реликтовый вид демонстрирует широкую метаболическую приспособляемость и обнаружен в природе в широком диапазоне температуры и других условиях среды [5]. M. laminosus считается единственным видом цианобактерий, который встречается только в гидротермах, и возможно, его распространение более широко, чем оказывается при прямом микроскопическом исследовании природных образцов, где данный вид, предположительно присутствовавший в качестве минорного компонента, мог быть не замечен.
Таблица 2. Видовой состав цианобактерий в природных образцах, в накопительных культурах, полученных из соответствующих образов, и оценка физиологического состояния цианобактерий в накопительных культурах
Номер образца Цианобактерии в природном образце Варианты жидкой минеральной среды, условия культивирования Физиологическое состояние цианобактерий после посева материала из природного образца Цианобактерии, полученные в накопительной культуре
120-4 Phormidium sp. Среда Громова № 6 Быстрое (в течение нескольких часов) обесцвечивание трихомов Рост отсутствует
Среда II Обесцвечивание трихомов происходило медленнее
Среда И, + СВ (10 мл/л), под слоем вазелинового масла Обесцвечивание трихомов происходило в течение суток — полутора
120-5 Oscillatoria limosa Среда Громова № 6 Обесцвечивание образца, гибель трихомов »
Среда Громова № 6, нижняя часть пробирки оборачивалась алюминиевой фольгой Окраска трихомов сохранялась на протяжении недели — полутора »
Среда И, + ТС, под слоем вазелинового масла Медленное обесцвечивание образца Calothrix sp. (медленный рост)
Среда И, + СВ (10 мл/л), под слоем вазелинового масла, нижняя часть пробирки оборачивалась алюминиевой фольгой Окраска трихомов сохранялась на протяжении нескольких недель Рост отсутствует
120-6 Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides, Phormidium angustissimum Среда Громова № 6 Окраска сохранялась, рост Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides, Phormidium angustissimum
И, (или И, + СВ) (10 мл/л) Обесцвечивание образца в течение трех суток Рост отсутствует
120-7 Phormidium sp. Среда Громова № 6 Быстрое обесцвечивание трихомов (в течение часа) Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides
Среда II Обесцвечивание трихомов Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides
Среда И,, под слоем вазелинового масла Обесцвечивание трихомов через 2 недели Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides (Schizothrix sp. — минорный компонент)
Среда И, + СВ (10 мл/л), под слоем вазелинового масла Обесцвечивания трихомов не происходило, но роста не наблюдалось Рост отсутствует
120-8 Mastigocladus. laminosus f. pseudoanabaenoides, Phormidium angustissimum Среда Громова № 6 Окраска сохранялась, рост Ph. angustissimum, M. laminosus f. pseudoanabaenoides (Gloeocapsa sp., Syne-chocystis sp. — минорные компоненты)
Примечание. ТС—добавка нескольких кристалликов тиосульфата натрия непосредственно в пробирку с образцом. СВ — раствор, содержащий, г/л: Ка28*9Н20 — 10; Ка2СОз —8; pH— 12,6.
Одна из экологических функций цианобактерий в термофильных сообществах, как правило, сводится к накоплению органических веществ на свету и выделению либо гли-колата в процессе фотодыхания, либо продуктов брожения в темноте [15, 16, 17]. Кроме того, цианобактерии считаются ответственными за насыщение среды кислородом на свету [18, 19], однако значение этих процессов в биотопах различного типа изучено недостаточно.
Цианобактерии обитают в воде с широким диапазоном физико-химических параметров. Например, по данным К. Като и соавторов [12], цианобактерии присутствовали при значения Eh воды от -112 до +173 мВ, при этом содержание кислорода в воде составляло от 0,25 до 5,25 мг/л. Таким образом, можно предположить, что виды, занимающие разные экологические ниши могут обладать разными экофизиологическими свойствами, в частности, способностью к росту в микроаэрофильных или анаэробных условиях и при низкой интенсивности света. Устойчивость некоторых цианобактерий к анаэробным условиям известна [20], однако в целом значение анаэробных условий для цианобактерий в разных местообитаниях до сих пор исследовано мало.
В настоящей работе для уменьшения поступления кислорода в накопительные культуры было использовано вазелиновое масло, которым заливалась предварительно прокипяченная среда. В таком варианте обесцвечивание проб 120-4 и 120-7 происходило медленнее, однако в конечном итоге культура гибла, так как герметизация с помощью вазелинового масла недостаточна, и оно лишь способно замедлить поступление кислорода в среду [21].
Наблюдаемая чувствительность термофильного штамма вида O. limosa к свету говорит, вероятно, о том, что роль данного вида в сообществе может быть иной, чем насыщение окружающей среды кислородом. Исходя из наших данных, обычная роль, которую часто приписывают цианобактериям, а именно выделение кислорода в окружающую среду, оказывается под вопросом в случае некоторых термофильных сообществ. Не исключено, что некоторые штаммы видов цианобактерий, обитающих в горячей воде, адаптировались к низкому содержанию кислорода, и их метаболизм может отличаться от «классической» оксигенной фотоавтотрофии. Например, описано, что Osciüatoria terebriformis Ag. ex Gom. передвигается в ночное время в анаэробные слои цианобактериального мата, а в аэробных условиях при наличии углеводов в среде происходит гибель трихомов, при этом местообитание O. terebriformis характеризуется высоким содержанием сероводорода [20]. Также описан гетеротрофный рост Nostoc sp. в темноте в анаэробных условиях [22], однако описанный штамм не являлся термофильным. Необходимо отметить, что местообитание данного штамма Nostoc sp. — корни Macrozamia communis L. A. S. Johnson на глубине в 30 см., т. е. достаточно специфичное и требующее, вероятно, от данного штамма метаболической приспособляемости к отсутствию света и кислорода, в данном случае, анаэробной гетеротрофии. Судя по всему, многие термофильные штаммы цианобактерий предпочитают более восстановленные условия обитания [20, 23] и, вероятно, анаэробный метаболизм может быть особенно характерен в тех сообществах, в которых накопление кислорода маловероятно (например, в потоке горячей воды), либо в других условиях, где кислород активно поглощается. Учитывая, что кислородный режим в термофильных биотопах изучен недостаточно, можно предположить, что приспособляемость к анаэробным нишам имеется у достаточного числа видов термофильных цианобактерий, и на разных участках термального потока могут существовать цианобактериальные сообщества с отличными друг от друга экофизиологическими свойствами.
Выводы
Таксономический состав изученных сообществ термофильных цианобактерий характеризовался небольшим количеством видов. Наиболее массовыми в природных образцах были O. limosa, Ph. angustissimum, Phormidium sp. В накопительных культурах массовое развитие получил M. laminosus (кроме образца 120-5), а также Ph. angustissimum. В большинстве случаев происходило обесцвечивание цианобактерий, которые были идентифицированы при микрокопировании природных образцов, и их роста не наблюдалось. Можно предположить, что многие виды термофильных цианобактерий предъявляют особые требования либо к минеральному составу среды, либо к условиям культивирования.
Исходя из результатов культивирования (см. табл. 2) можно сделать заключение, что наиболее эврибионтным из изученных видов является M. laminosus f. pseudoanabaenoides, который способен расти на минеральных средах разного состава и с разным содержанием кислорода. Единственным образцом, из которого получить цианобактерии данного вида не удалось, был образец 120-5. В этом образце был обнаружен только один вид цианобактерий — O. limosa.
Крайняя чувствительность к освещенности трихомов O. limosa может свидетельствовать о том, что экологическое значение данного вида состоит не в насыщении среды кислородом, а в каких-либо других функциях. Другая возможность состоит в том, что кислород, выделяемый при фотосинтезе сразу же поглощается микроорганизмами, и его накопления в окружающей среде не происходит.
Таким образом, в ходе настоящего исследования была подтверждена возможность существования у различных видов термофильных цианобактерий разной чувствительности к освещенности и кислороду.
Литература
1. Никитина В. Н. Сине-зеленые водоросли (цианобактерии) природных термальных биотопов // Труды С.-Петербургского Общества Естествоиспытателей. 2005. Сер. 3. Т. 80. 109 с.
2. Никитина В. Н. Ассоциации сине-зеленых водорослей некоторых термальных источников Ставропольского и Краснодарского краев и Грузинской АССР // Вестн. Ленингр. ун-та. 1975. №3. С. 54-59.
3. Никитина В. Н. Сине-зеленые водоросли минеральных и термальных источников Кро-ноцкого заповедника // Вестн. Ленингр. ун-та. 1983. №15. Вып. 3. С. 25-29.
4. Голлербах М. М., Косинская Е. К., Полянский В. И. Сине-зеленые водоросли. Определитель пресноводных водорослей СССР. Вып. 2. М.: Советская Наука, 1953. 651 с.
5. Никитина В. Н. Новая форма Mastigocladus laminosus Cohn (Cyanophyta) в горячих источниках Камчатки // Нов. сист. низш. раст. 1984. Т. 21. С. 38-41.
6. Brock T. D. Life at high temperatures // Science. 1967. Vol. 158. P. 1012-1019.
7. Castenholz R. W. Ecology of blue-green algae in hot springs / Ed. by N. G. Carr and
B. A. Whitton // The Biology of Blue-green Algae. Blackwell Scientific Publications, 1973. P. 379-414.
8. Skirnisdottir S., Hreggvidsson G. G., Hjorleifsdottir S. et al. Influence of sulfide and temperature on species composition and community structure of hot spring microbial mats // Appl. Env. Microbiol. 2000. Vol. 66, N 7. P. 2835-2841.
9. Castenholz R. W. Thermophilic blue-green algae and the thermal environment // Bacteriol. Rev. 1969. Vol. 33, N 4. P. 476-504.
10. Schwabe G. H. Beobachtungen uber thermalische Schichtungen in Thermalgewassern auf Island // Arch. Hydrobiol. 1933. Bd 26. S. 187-196.
11. Komarek J., Anagnostidis K. Cyanoprokaryota. Teil 2. Oscillatoriales // Büdel B., Gartner G., Krienitz L., Schagerl M. Süsswasserflora von Mitteleuropa. Elsevier. Vol. 19/2. 2005. 759 S.
12. Kato K., Kobayashi T., Yamamoto H. et al. Microbial mat boundaries between chemolithotrophs and phototrophs in geothermal hot spring effluents // Geomicriol. J. 2004. Vol. 21. P. 91-98.
13. Stockner J. G. Observation of thermophilic algal communities in Mount Ranier and Yellowstone National Park // Limn. Ocean. 1967. Vol. 1. P. 13-17.
14. Stainer R. Y., Kunisawa R., Mandel M. Purification and properties of uni-cellular blue-green
algae (order Chroococcales) // Bacteriol. Rev. 1971. Vol. 35. P. 171-205.
15. Anderson K. L., Tayne T. A. and Ward D. M. Formation and fate of fermentation products in hot spring cyanobacterial mats // Appl. Env. Microbiol. 1987. Vol. 53, N 10. P. 2343-2352.
16. Bateson M. M., Ward D. M. Photoexcretion and fate of glycolate in a hot spring cyanobacterial mat // Appl. Env. Microbiol. 1988. Vol. 54, N 7. P. 1738-1743.
17. Nold S. C., Ward D. M. Photosynthate partitioning and fermentation in hot spring microbial mat communities // Appl. Env. Microbiol. 1996. Vol. 62, N 12. P. 4598-4607.
18. J0rgensen B. B, Revsbech N.P., Blackburn T.H., Cohen Y. Diurnal cycle of oxygen and sulfide microgradients and microbial photosynthesis in a cyanobacterial mat sediment // Appl. Env. Microbiol. 1979. Vol. 38, N 1. P. 46-58.
19. Post A. F., Loogman J. G., Mur L. R. Regulation of growth and photosynthesis by Oscillato-ria agardhii grown with a light/dark cycle // FEMS Microbiol. Lett. 2006. Vol. 31, N 2. P. 97-102.
20. Richardson L.L., Castenholz R. W. Enhanced survival of the cyanobacterium Oscillatoria terebriformis in darkness under anaerobic conditions // Appl. Env. Microbiol. 1987. Vol. 53, N 9. P. 2151-2158.
21. Gates F. L., Olitsky P. K. Factors influencing anaerobiosis, with special reference to the use of fresh tissue // The J. Exp Med. 1921. Vol 33. P. 51-68.
22. Hoare D. S., Ingram L. O., Thurston E. L., Walkup R. Dark heterotrophic growth of an
endophytic blue-green algae // Arch. Microbiol. 1971. Vol. 78. P. 310-321.
23. Donald W., Doemel W., Brock T. D. Requirement of low oxidation-reduction potential for photosynthesis in a blue-green algae (Phormidium sp.) // Arch. Microbiol. 1975. Vol. 104. P. 7-15.
Статья поступила в редакцию 15 октября 2009 г.
