CC BY
8
УДК 577.352.315:612.33+591.132.5;619:616.33
Масюк Д.М., кандидат вет. наук, доцент © ([email protected]) Днтропетровський державный аграрный утверситет
ВИДОСПЕЦИФШШСТЬ Fc-Y-РЕЦЕПТОР№ ЕНТЕРОЦИТ1В ПОРОЖНЬО1 КИШКИ ПЛОД1В ВЕЛИКО1 РОГАТО1 ХУДОБИ
Досл1джували видоспециф1чтсть Ее-у-рецептор1в кишкових клтин порожньог кишки у плодовий перюд великог рогатог худоби за полтептидним складом. Виявили полтептидт зони, як1 специф1чно зв 'язували ^О на аткальному та базолатеральному доменах та ¡дентифжувати гх за молекулярною масою. Встановили, що бток з Мг 43 кДа вгдноситься до класу ЕеуКН, з Мг 72 кДа до ЕеуШ, а з Мг 87 до ЕеуКШ вгдповгдно. Найбшьш ¡нтенсивно експресованими е класи Ее-рецептор1в - ЕеуКШ та ЕеуКН
Ключовi слова: Ее-у-рецептори, аткальна мембрана, базолатеральна мембрана, ентероцити, порожня кишка, плоди
Вступ. Особливу роль у забезпеченш iмунних функцш i життездатност новонароджених ввдграють молекулярш мехашзми, яю формуються у плодовий перюд онтогенезу та контролюють розвиток iмунокомпетентних кл^ин, синтез i транспорт iмуноглобулiнiв. Одними з найбшьш важливих регуляторiв i транспортерiв одночасно розглядаються iмунорецепторнi бiлки, якi здатнi специфiчно розтзнавати Fc-фрагменти iмуноглобулiнiв класу G - Fc-у-рецептори.
Функцiонування Fc-y-рецепторiв розглядаеться як один iз критичних показниюв, що бере участь у становленш та активаци iмунних механiзмiв впродовж усього перюду онтогенезу. Fc-y-рецептори кишкових кл^ин забезпечують постачання iмунних комплекав компетентним лiмфоlдним клiтинам, якi у вщповщь формують специфiчнi клони i стимулюють розвиток iмунноl системи [1].
На сьогодшшнш день вiдомо, що Fc-y-рецептори представленi у багатьох епiтелiях ссавцiв, зокрема жовтковому мiшку, плацентарному синцтотрофобласи, травному каналi, капiлярному ендотелш, гепатоцитах, ниркових проксимальних канальцях, дихальному ештелп та епiтелiю молочно! залози [2]. Склад Fc-y-рецепторiв кишкових кл^ин достатньо повно вивчений на лабораторних тваринах i людинi [3], вщомост про !х видоспецифiчнiсть на окремих дшянках плазмолеми у продуктивних зршонароджуючих тварин е на сьогоднiшнiй день фрагментарними та нечисельними [4], а даш щодо визначення iмунофункцiональноl гетерогенност полiпептидних комплексiв апiкальних i базолатеральних мембран ентероцитiв велико1 рогато1 худоби у плодовий перюд онтогенезу вщсутш.
© Науковий консультант Масюк Д.М., 2008
- доктор бюл. наук, професор, академж УААН Цвшховський М.1. 299
Метою дано! роботи е визначення видоспецифiчностi Fc-y-pe^nTOpiB (рецептор у ланцюга IgG) за полшептидним складом у апiкальних i базолатеральних мембранах кишкових епiтелiальних кл^инах з посмугованою облямiвкою порожньо! кишки велико! рогато! худоби у плодовий перiод онтогенезу.
Матер1ал i методи. Дослiдження проведенi на базi проблемно! науково-дослiдно!' лабораторi!' фiзiологi!' та функцюнально! морфологi!' продуктивних тварин Дшпропетровського державного аграрного унiверситету. Об'ектом дослщжень були 48 плодiв вiком вщ 3-ох до 9-ти мiсяцiв, отриманих вiд клiнiчне здорових корiв тсля забою в умовах м'ясопереробного тдприемства "Ювшейний" Днiпропетровсько! областi.
Пiсля негайно! декапiтацi! плодiв (пiд нембуталовим наркозом), розтинали черевну порожнину, видiляли порожню кишку. Визначали довжину та середину кишки, яку використовували для одержання клiтин. За основу отримання iзольованих епiтелiоцитiв тонко! кишки бика свшського був обраний хiмiчний (цитрат/ ЕДТО) метод змивання клiтин у авторськш модифiкацi!.
Фракцi! апiкальних i базолатеральних мембран отримували iз суспензi! iзольованих ентероцитiв порожньо! кишки методом диференщального центрифугування [5]. Ефективнiсть отримання аткально! фракцi! здiйснювали по виходу мембранного матерiалу за кiлькiстю бiлка за методом Lowri О. у модифжаци Miller G.
Електрофорез проводили у пластин ПААГ вiдповiдно з методикою, описаною Laemmli U. У гелi для роздiлення бiлкiв формували градiент акриламiду Т=7-18%.
Виявлення комплексiв IgG - Fc-y-рецептор проводили за допомогою iмуноблотинга як описано ранiше [6].
Обробку одержаних даних проводили методами математично! статистики для малих виборок [7]. Вщносний вмiст Fc-у-рецепторiв виражали у виглядi середньо! величини ±, що е стандартною похибкою середньо!, достовiрну рiзницю мiж групами оцiнювали iз застосуванням t-критерiя Ст'юдента (Р<0,05) пiсля перевiрки гiпотез про нормальнiсть розподiлення та рiзницю мiж генеральними дисперсiями.
Результати дослщження.
Результати iмуноблотингу показали загальну збiжнiсть складу Fc-y-рецепторiв (FcyR) екстрагованих, як iз апiкального, так i базолатерального домену ентероцитiв порожньо! кишки протягом усього плодового перюду велико! рогато! худоби. Бiлки, яю зв'язували IgG за умов iнкубацi! нiтроцелюлози, переносили екстрагованi з мембран фракци роздiленими у ПААГ. Антигени, що представляли мембраннi бiлки аткально! та базолатерально! мембран з молекулярною масою (Mr) полiпептидних зон 87, 72 i 43 кДа, специфiчно зв'язували IgG, оскшьки розведення 1:1500 та присутшсть неiонного детергенту тритон X 100 попереджуе неспецифiчну сорбцш (рисунок 1.).
Вiдповiдно сучасних уявлень - на поверхш плазматичних кл^ин ссавцiв присутнi чотири групи Fc-рецепторiв IgG: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII
300
(CD16) та FcyRIV [2, 8]. Вони представляють собою молекули, що специфiчно зв'язуються з активними молекулярними сайтами у Fc-областях iмуноглобулiнiв. Fc-рецептори iснують у виглядi зв'язаних на зовнiшнiй поверхш плазмолеми клiтин. Цi представники гетерогенного амейства рецепторних молекул здатнi зв'язувати IgG окремих пiдкласiв. У бшьшосп випадкiв FcyR е гетеродiмерами, яю не ковалентно пов'язанi з р2-мiкроглобулiном. У свою чергу, р2-мжроглобулш асоцiйований з а-ланцюгами молекул комплексу першого класу гiстосумiсностi. Цей факт вказуе на ушверсальшсть FcyR комплекав. До того ж, ген а-ланцюга FcyR був незалежно виявлений вперше у щурiв, потiм у людини, мишi, велико! рогато! худоби, овець, свиней [9].
■■8 3
87 кДа 72 кДа
43 кДа
А Б А Б А Б А Б 3 5 7 9
Рисунок 1. 1муноблотинг Рс-у-рецептор1в до ^С аткальних (А) 1 базолатеральних (Б) мембран ентероцитiв порожиьоУ кишки плодiв велико? рогатоУ худоби рiзиого вiку: 3 мiс., 5 мк., 7 мiс. i 9 мк.
Подiбна специфiчнiсть, як i на кров'яних клiтинах, проявляеться i на плазмолемi кишкових клiтин порожньо! кишки плодiв. Виявленi нами полшептидш зони, якi специфiчно зв'язували IgG на апiкальному та базолатеральному доменах, можливо iдентифiкувати за молекулярною вагою [10]. Так, бшок з Мг 43 кДа вiдноситься до класу FcyRII, з Мг 72 кДа до FcyRI, а з Мг 87 до FcyRШ вiдповiдно.
Протягом усього плодового перюду на аткальних i базолатеральних мембранах епiтелiальних кишкових кл^инах велико! рогато! худоби найбшьш iнтенсивно експресованими е класи Fc-рецепторiв - FcyRШ та FcyRII. FcyRШ е мажорною зоною протягом усього плодового перюду з домiнуючим вмютом на базолатеральнiй поверхнi ентероцитiв (плоди 3-х мшячного вiку) iз подальшим перерозподiлом iнтенсивностi експресi! на аткальний полюс. FcyRII мае зворотну залежшсть (у порiвняннi з FcyRШ) та характеризуеться аткальною приналежнiстю у раннш плодовий перiод велико! рогато! худоби.
Висиовки. ¡дентифкована видова специфiчнiсть Fc-y-рецепторiв ентероципв порожньо! кишки плодiв велико! рогато! худоби за молекулярною масою бипав, яка
301
вщповщае для полшептвдв з Мг 43 кДа - FcyRII, з Мг 72 кДа - FcyRI та з Мг 87 - FcyRIII вщповщно. Визначеш змши експреси окремих клаав Fc-y-рецепторiв в апкальних i базолатеральних макродоменах ентероци™ у плодовий перюд, що свщчить про певнi особливосп розвитку та формування iмунних механiзмiв плода починаючи з 3 мкяця пренатального онтогенезу.
Л1тература
1. Maltais LJ, Lovering RC, Taranin AV, at al. New nomenclature for Fc receptor-like molecules// Nature Immunology. - 2006. - 7, № 5. P. 431-442.
2. Roopenian D., Akilesh S. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age // Nature Reviews Immunology. - 2007. - 7. P. 715-725.
3. Dickinson B., Badizadegan K., Wu Z. at al. Bidirectional FcRn-dependent IgG transport in a polarized human intestinal epithelial cell line // The Journal of Clinical Investigation. 1999. - 104. P. 903-911.
4. Мельничук Д.О., Усатюк П.В., ЦвЫховський M.I. Роль бшкових структур плазматично! мембрани кишкового ештелш у формуваннi колострального iмунiтету новонароджених телят // Вшник Нацiонального аграрного унiверситету. - Ки!в, 1998. - № 6. - С. 13-20.
5. Масюк Д.М. Особливосп фракцюнування плазматичних мембран iзольованих ентероцитiв тонкого кишечника плодiв велико! рогато! худоби// Вкник Нацiонального аграр. унiверситету. - Ки!в, 2004. - № 78. - С. 148-152.
6. Масюк Д.М., Недзвецький В.С., Цвшховський М.Г, Неруш П.О. Динамша експреси та полiпептидний склад Fc-y- рецепторiв ентероцитiв тонко! кишки плодiв бика// Фiзiологiчний журнал. - Ки!в, 2008. - Т. 54 №1. - С. 27-34.
7. Кокунин В.А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Укра!нський бiохiмiчний журнал. - 1975. - Т. 47, № 6. - С. 776-790.
8. Mostov K., Verges M.,Altschuler Y. Membrane traffic in polarized epithelial cells // Current Opinion in Cell Biology. 2000. - 12. P. 483-490.
9. Nimmerjahn F, Ravetch J. Fcgamma receptors: old friends and new family members // J. Immunity - 2006. - 24, № 1. P.19-28.
10. Kacskovics I., Wu Z., Simister N. Cloning and characterization of the bovine MHC class I-like Fc receptor // The Journal of Immunology. 2000. - 164. P. 1889-1897.
Summary D.M. Masyuk
SPECIFICITY COMPOSITION OF Fc-y-RECEPTORS OF BOVINE ENTEROCYTE'S FETAL PERIOD
The polypeptide composition and expression of Fc-y-receptors of enterocytes from bovine intestine of fetal developing was investigated. The results of immunobloting show common similar composition of Fc-y-receptors extracted from macrodomen during while early fetal period. Fc-y-receptors polypeptide composition in this period is represented molecular weight 87 (FcyRIII), 72 (FcyRI) and 43 (FcyRIII) kDa. Maximal expression of Fc-y-receptors - FcyRIII and FcyRII.
Key words: Fc- y-receptors, apical and basolateral membrane, small intestine, enterocytes, fetus.
Стаття надшшла до редакцИ 20.09.2008
302
