CC BY
82
УДК 616.932:575
Г.А.Ерошенко
МВНО СИОЬЕВДЕ 0139: ГЕНЕТИКА И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ НЕ О1 СЕРОГРУППЫ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
В обзоре обсуждены наиболее вероятные генетические механизмы, которые могут лежать в основе образования новых патогенных штаммов V. ско1егае с высоким эпидемическим потенциалом.
Ключевые слова: возбудитель холеры, молекулярные механизмы образования новых патогенных штаммов.
В настоящее время известно 206 серогрупп холерных вибрионов, отличающихся между собой по структуре соматического О-антигена. Некоторые из них способны вызывать различные диарейные заболевания у человека, но до недавнего времени считалось, что эпидемии холеры могут быть вызваны только токсигенными холерными вибрионами О1 се-рогруппы. Однако в 1992-1993 гг. в Юго-Восточной Азии появился «новый» возбудитель холеры 0139 серогруппы, который явился причиной больших эпидемий с высоким уровнем летальности среди населения и который впоследствии был признан вторым этиологическим холерным агентом. На протяжении более чем десяти лет своего существования V. ско!егае 0139 вызывал вспышки холеры различной интенсивности, которые и по сей день часто регистрируются в южной части Индийского полуострова [12, 22]. Появление V. ско1егае 0139 заставило по-иному взглянуть на эпидемическую опасность вибрионов не О1 серогруппы и указало на возможность появления и других «эпидемических» серогрупп холерных вибрионов. Однако молекулярногенетические механизмы, которые могут привести к их образованию, и те генетические события, которые послужили причиной появления возбудителя О139 серогруппы, остаются практически не изученными.
Цель этого обзора заключается в том, чтобы обсудить возможные генетические механизмы, которые могут лежать в основе образования новых патогенных штаммов V. ско!егае с высоким эпидемическим потенциалом. Значительное внимание будет уделено данным, полученным отечественными исследователями.
Изучение штаммов V. ско!егае 0139, выделенных в 1992-1993 гг., показало, что они близки патогенным штаммам О1 серогруппы биовара эльтор -этиологическим агентам текущей седьмой пандемии холеры, и что первый О139 штамм мог произойти от токсигенного предшественника О1 серогруппы био-вара эльтор в результате замены в его хромосоме генов биосинтеза О-антигена [14]. Анализ кластера генов ^Ъ/, ответственных за биосинтез 0139 антигена у V. ско!ете 0139, показал, что в нем отсутствует фрагмент ДНК размером 22 т.п.н., характерный для генов О1 антигена - кластера м>Ъе, но содержится новый уникальный фрагмент, имеющий размер 35 т.п.н. [13, 25]. Генетическое окружение генов био-
синтеза О-антигена у V. ско!егае 0139 и у V. ско!ете 01 одинаково, с правой стороны (37 конец) к ним примыкает ген rjg, а с левой (57 конец) - гены gmhD и ог/2 [24, 25]. Участки ДНК, лежащие между этими фланкирующими генами, отличаются у обеих серо-групп, за исключением того, что они оба содержат инсерционную последовательность 751358.
Холерные вибрионы других серогрупп имеют такую же организацию хромосомной области, кодирующей биосинтез О-антигена, что и вибрионы О1 и 0139 серогруппы. У них гены О-антигена собраны в кластер wЪ*, который также фланкирован генами rjg и gmhD, ог/2 [24]. Поскольку кластер wЪ* у холерных вибрионов различных серогрупп имеет универсальную структуру, наиболее вероятным генетическим механизмом, который приводит к замене генов биосинтеза О-антигена одной серогруппы на другую, является рекомбинация по гомологичным сайтам - генам rjg и gmhD, ог/2.
Проведенное нами изучение организации wЪ* кластера у штаммов V. с^1ете не 01, выделенных в различных регионах Российской Федерации и других стран СНГ, в частности, у штаммов 02, 022, 041, 042, 056 и 0139 серогрупп, полученных в 1968-2004 гг. в Астраханской, Ростовской, Московской областях, в Узбекистане и Туркмении, показало, что в хромосоме этих штаммов также содержатся гены rjg, gmhD и ог/2. Следовательно, гены, кодирующие биосинтез антигенов у этих вибрионов, могут также изменяться за счет гомологической рекомбинации [5].
Таким образом, конкретным генетическим механизмом, который может приводить к замене генов одной серогруппы на другую, является, скорее всего, рекомбинация по гомологичным сайтам. Однако до сих пор остается не установленным другой механизм - механизм горизонтального переноса генетической информации, посредством которого фрагмент чужеродной ДНК с генами биосинтеза нового антигена, переносится между штаммами V. с^1ете. Предполагается, что этот перенос может быть осуществлен бактериофагом, обладающим трансдуци-рующими свойствами, или конъюгативной плазмидой [19]. К настоящему моменту описано несколько умеренных холерных бактериофагов (СР-Т1, 132), которые могут переносить фрагменты хромосомной ДНК между штаммами V. с^1ете, а также между
ними и штаммами близкородственных видов вибрионов [2, 20]. Особого внимания заслуживает умеренный холерный бактериофаг, обозначаемый как 139, K139 или 139ф [21, 23]. Этот бактериофаг выявлен у штаммов V. cholerae 0139, выделенных в 1992-1993 гг., а впоследствии было установлено, что он широко распространен и в других вирулентных штаммах О139 серогруппы, а также часто встречается у вибрионов О1 серогруппы биовара эльтор [8, 21]. Изучены генетические и иммунологические характеристики фага 139, а недавно его геном был секвенирован [18]. Н.И. Смирновой с со-авт. [7] показано, что геном профага 139 локализуется в хромосоме V. cholerae O139 в непосредствен -ной близости от генов биосинтеза О-антигена и полисахаридной капсулы - отличительных признаков, характерных для V. cholerae O139. Бактериофаг 139 способен осуществлять перенос близлежащих к нему хромосомных генов по механизму специфической трансдукции [9] Эти свойства бактериофага 139 позволяют высказать предположение о том, что он действительно может участвовать в процессе образования новых патогенных штаммов с измененными свойствами.
Недавно было установлено, что в основе появления новых патогенных штаммов может лежать и другой генетический механизм передачи генов -конъюгация [7]. С помощью сконструированных Hfr доноров был осуществлен перенос хромосомных генов между различными штаммами V. cholerae O139. В экспериментальных условиях гены биосинтеза 0139 антигена и капсулы были переданы в изо-генные 0139 штаммы, дефектные по этим признакам. Переданные гены эффективно экспрессировались в клетках реципиентного штамма. Таким образом, была показана принципиальная возможность передачи генов, кодирующих биосинтез О-антигена, между штаммами холерных вибрионов методом конъюгации. Возможно, что аналогичный механизм конъюгационного переноса лежит в основе образования штаммов с измененными генами биосинтеза О-антигена и в природе.
До сих пор остается не установленным микроорганизм, послуживший донором специфичного для О139 антигена фрагмента ДНК. Сравнительный биохимический анализ О-антигенов различных се-рогрупп показал, что наибольшую близость к О139 антигену имеет соматический антиген холерных вибрионов О22 серогруппы [15]. Липополисахари-ды обеих серогрупп имеют близкий состав сахаров и кодируются генами, которые также имеют большое сходство. В блот-гибридизации по Саузерну фрагменты генов О139 антигена, использованные в качестве зонда при анализе хромосомной ДНК штаммов 193 серогрупп, специфически гибридизо-вались со штаммами О22 серогруппы, что свидетельствует о наличии протяженных гомологичных участков ДНК в хромосомной области биосинтеза О-антигена у штаммов 0139 и О22 серогрупп [26]. Однако между ними имеются и некоторые отличия. Методом амплификации протяженного фрагмента ДНК в ПЦР показано, что у вибрионов О22 серо-группы наблюдается частичное замещение генов О-антигена по сравнению с вибрионами 0139 серо-
группы, что свидетельствует об отсутствии полной гомологии между wb* кластерами этих двух серогрупп [26]. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для выяснения того, действительно ли штамм 022 серогруппы был донором специфичных для V. cholerae 0139. Прямым доказательством могло бы стать, например, получение в экспериментальных условиях штамма, экпрессирующего 0139 антиген, из вибриона 01 серогруппы в результате переноса хромосомных генов биосинтеза 022 антигена с помощью сконструированного на основе вибриона 022 серогруппы Hfr донорного штамма.
Молекулярный анализ штаммов, выделенных за все время существования V. cholerae O139, указал на генетическую неоднородность вибрионов этой серогруппы. Наряду с токсигенными штаммами 0139 серогруппы, полученными от больных людей, выявлены и нетоксигенные штаммы этой серогруп-пы. Сначала такие штаммы были получены за рубежом, в Аргентине и других странах [25], а впоследствии они обнаружены и в пробах из водоемов, расположенных на территории Российской Федерации - в Иркутской, Московской, Ростовской областей и в Калмыкии [1, 6]. Возникло предположение о том, что токсигенные V. cholerae 0139 могли произойти от атоксигенных 0139 вибрионов в результате передачи им факторов вирулентности от высокопатогенных штаммов 01 серогруппы. Однако сравнительный анализ генетических свойств неток-сигенных V. cholerae 0139, выделенных за рубежом и в различных регионах РФ [4, 25], выявил существование принципиальных отличий в организации генома токсигенных и нетоксигенных вибрионов 0139 серогруппы. У токсигенных V. cholerae O139 в состав основной или коренной части хромосомы, содержащей гены жизнедеятельности клеток, включены острова патогенности (VPI, VPI-2) и умерен -ные холерные фаги CTXj и RS1j, которые несут гены основных факторов вирулентности - холерного токсина, токсинов Zot и Ace, токсинкорегули-руемых пилей адгезии, а также гены, регулирующие экспрессию факторов вирулентности. В геноме не-токсигенных 0139 вибрионов отсутствуют гены холерного токсина ctxAB, гены zot и ace, локализованные в геноме CTXj [4]. У них также отсутствует последовательность нитчатого фага RS1, который является сателлитом фага CTXj, и сайт интеграции фага CTXj - attRS. Как правило, геном «водных» вибрионов не содержит гена tcpA, кодирующего структурную субъединицу токсинкорегулируемых пилей - основного фактора колонизации возбудителя холеры, и регуляторного гена toxT, которые входят в остров патогенности VPI. Эти данные свидетельствуют о том, что «водные» вибрионы 0139 серогруппы, лишенные основных факторов патогенности, не являются непосредственными предшественниками патогенных штаммов V. cholerae 0139, вызвавших эпидемии холеры в Юго-Восточной Азии в1992-1993 гг.
Ген gmhD, который фланкирует у всех изученных до сих пор серогрупп V. cholerae гены биосинтеза О-антигена слева, обнаружен и у «водных» вибрионов 0139 серогруппы, однако продукт амплификации этого гена в ПЦР у нетоксигенных
0139 штаммов имеет меньший размер по сравнению с токсигенными штаммами. Он точно соответствует фрагментам, получаемым у вибрионов не 01 / не 0139 серогруппы, выделяемых из внешней среды. По мнению S.M.Faruque et al. [17] это означает, что нетоксигенные штаммы 0139 серогруппы, скорее всего, ведут свое происхождение от вибрионов не 01 серогруппы, обитающих во внешней среде, и что ген gmhD, вероятно, получен ими от штамма-предшественника не 01 серогруппы.
Проведенное нами изучение участков хромосомы, фланкирующих кластер wbf у «водных» 0139 вибрионов, выделенных в России, показало, что они так же как и другие холерные вибрионы, содержат ген gmhD, при амплификации которого в ПЦР наблюдается образование специфических фрагментов ДНК. Однако полученные фрагменты по размеру отличаются как от фрагментов токсиген-ных 0139 штаммов, так и от продуктов амплификации нетоксигенных штаммов не 01 серогруппы [11]. По-видимому, имеются некоторые отличия в нуклеотидной последовательности гена gmhD у «водных» вибрионов 0139 серогруппы, циркулирующих на территории Российской Федерации, и зарубежных штаммов, на основании чего можно предположить, что штамм-предшественник неток-сигенных российских 0139 штаммов отличается от штаммов-предшественников нетоксигенных вибрионов 0139 серогруппы, описанных зарубежными исследователями [17].
Таким образом, авирулентные штаммы 0139 серогруппы, выделенные в России, имеют существенные отличия от вирулентных V. cholerae 0139 в организации генома, поскольку они не содержат островов патогенности и профагов, кодирующих биосинтез основных факторов вирулентности. 0ни также значительно отличаются от вирулентных штаммов по данным молекулярного типирования [3]. По-видимому, водные и вирулентные 0139 вибрионы представляют собой различные филогенетические линии эволюции холерных вибрионов.
Е.Ю.Щелкановой с соавт. [10] была показана принципиальная возможность переноса хромосомных генов с помощью сконструированных Hfr доноров от вирулентных штаммов V. cholerae O139 в клетки авирулентных 0139 вибрионов, однако передать гены, связанные с вирулентностью, не удалось. Таким образом, хотя и существует возможность приобретения «водными» штаммами 0139 серогруппы отдельных факторов вирулентности за счет механизма конъюгации, все же факт одновременного приобретения этими штаммами целого ряда генов, ассоциированных с вирулентностью V. cholerae, представляется маловероятным. Полученные данные свидетельствуют о том, что авирулентные вибрионы 0139 серогруппы, выделяемые из водоемов на территории Российской Федерации, в настоящее время не представляют эпидемической опасности, и, в случае их выделения, не требуется проведения комплекса защитных мер, применяемых при обнаружении вирулентных штаммов V. cholerae.
Выводы, сделанные в отношении российских штаммов 0139 серогруппы, не следует экстраполировать на штаммы, циркулирующие на эндемичных
по холере территориях. В связи с большой концентрацией вирулентных штаммов в водоемах в периоды эпидемий и с благоприятными климатическими условиями в этих регионах интенсивность генетического обмена между вирулентными и авирулент-ными штаммами может многократно возрастать. Так, S.M.Faruque et al. [16] показал, что под действием солнечного света наблюдается индукция профага CTX, которая приводит к повышению его титра в 10000 раз. В эксперименте эта группа авторов наблюдала образование токсигенного штамма, вирулентного для лабораторных животных, в результате фаговой конверсии нетоксигенного О139 вибриона, который, однако, содержал остров патогенности VPI и образовывал токсинкорегулируе-мые пили адгезии. Таким образом, существует вероятность того, что авирулентные вибрионы не О1 серогруппы в условиях интенсивного генетического обмена, который происходит между штаммами холерных вибрионов в водоемах на эндемичных территориях, могут постепенно наращивать свой вирулентный потенциал за счет приобретения отдельных генов или групп генов, ассоциированных с вирулентностью.
Подводя итоги вышесказанному, следует заключить, что наиболее вероятным генетическим механизмом, который мог привести к образованию возбудителя холеры 0139 серогруппы, а также в дальнейшем может привести к образованию возбудителей холеры других серогрупп, является горизонтальный перенос генетической информации (генов биосинтеза О-антигена) с помощью механизма трансдукции (например, бактериофаг 139) или конъюгации (Hfr доноры или SXT коньюгативный элемент) с их последующей интеграцией за счет рекомбинации по гомологичным сайтам в хромосому высоковирулентного штамма V. cholerae 01. Возможен и другой путь образования патогенных штаммов не 01 серогруппы - из слабопатогенных холерных вибрионов, обитающих во внешней среде, за счет приобретения факторов вирулентности, расположенных у возбудителя холеры на островах патогенности и умеренных холерных бактериофагов. Этот путь является более долгим по сравнению с вышеуказанным механизмом, однако, его все же следует учитывать, принимая во внимание благоприятные климатические и социальные условия в эндемичных по холере регионах. В настоящее время на этих территориях сложилось устойчивое равновесие штаммов 01 и 0139 серогруппы, борьба меж -ду которыми способствует, в конечном итоге, дальнейшей эволюции возбудителя холеры в сторону увеличения его патогенных и, возможно, «пандемических» свойств.
Работа поддержана грантом РФФИ № 05-0448727.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ганин В.С., Урбанович Л.Я., Марамович А.С. с соавт. // Матер. науч. конф., посв. 100-летию образования противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 1. -С. 30. - 2. Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. // Пробл. особо опасных инф. - 1993. - Вып. 3 (73). - С. 202-205. - 3. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Смирнова Н.И. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2002. - С. 80-85. - 4. Ерошенко
Г. А., Осин А.В., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 2004. - № 2. - С. 11-16. -5. Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю. // Пробл. особо опасных. инф. - 2005. - Вып. 2 (90). - С. 43-46. - 6. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Покровский В.И. и др. Актуальные проблемы холеры / Под ред. Покровского В.И. - М., 2000. -384 с. - 7. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Чеховская Г. В. с соавт. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1996. -№ 2. - C. 14-18. - 8. Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Щелканова Е.Ю. и др. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1999. - № 1. - С. 17-22. - 9. Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А., Осин А.В. и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Д, 2000. - Вып. 13. - С. 61-63. -10. Щелканова Е.Ю., Осин А.В., Ерошенко Г.А., Смирнова Н. И. // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Д, 2002. - Вып. 15. - С. 75-76. - 11. Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А. // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Д, 2005. - Вып. 18. - С. 75-76. -12. Alam M., Hasan N.A., Sadique A. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72 (6). - P. 4096-104. - 13. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouwn R.D. // EMBO. - 1995. -Vol. 14, N 2. - P. 209-216. - 14. Calia K.E., Murtagh M., Ferraro M.J., Calderwood S.B. // Infect. Immun. - 1994. -Vol. 62. - P. 1504-1506. - 15. Dumontier S., Berche P. // FEMS Microbiol. Lett. - 1998. - Vol. 164. - P. 91-98. -16. Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M. et al. // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68. - P. 4795-4801. - 17. Faruque S.M., Sack D.A., Sack R.B. et al. // PNAS. - 2003. -Vol. 100, N 3. - P. 1304-1309. - 18. Kaphammer D., Dlass J., Evens S., Reidl J. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184. -P. 6592-6601. - 19. Mooi F.R., Bik E.M. // Trends Micro-
biol. - 1997. - Vol. 5, N 4. - P. 161-165. - 20. O' Shea Y.A., Boyd E.F. // FEMS Microbiol. Lett. - 2002. - Vol. 214. - P. 153157. - 21. Reidl J., Mekalanos J.J. // Mol. Microbiol. -1995. - Vol. 18. - P. 685-701. - 22. Sinha S., Chakraborty R., De K. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, N 7. -P. 2635-2637. - 23. Smirnova N.I., Chekovskaya G.V., Davidova N.T. et al. // FEMS Mirobiol. Lett. - 1996. -Vol. 136. - P. 175-180. - 24. Sozhamannan S., Deng Y.K., Li M. et al. // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67. - P. 5033-5040. -25. Stroeher U.H., Parasivam G., Dredge B.K. et al. // J. Bacteriol. - 1997. - Vol. 179. - P. 2740-2747. - 26. Yamasaki S., Shimizu T., Hoshino K. et al. // Gene. - 1999. -Vol. 237. - P. 321-332.
G.A.Y eroshenko
Vibrio cholerae O139: Genetics and Molecular Mechanisms of Origination of the Non-O1 Serogroup Cholera Pathogen
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe ", Saratov
Discussed in the review are the most likely genetic mechanisms, that might underlie the formation of new pathogenic V. cholerae strains manifesting high epidemic potential.
Key words: cholera pathogen, molecular mechanisms of formation of new pathogenic strains.
nocTynHHa 21.07.06.
УДК 616.91/98:615/371
В.В.Кутырев1, З.Л.Девдариани1, Л.В.Саяпина2
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
2Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича, Москва
Представлен обзор литературы по состоянию научных исследований в области вакцинопрофилактики особо опасных бактериальных инфекций за последние 5-10 лет. Дана характеристика нескольких поколений вакцинных препаратов, определены тенденции развития науки в этой области медицины. Уделено внимание исследованиям по разработке препаратов для экстренной вакцинопрофилактики особо опасных инфекций в случае эпидемических осложнений, связанных с биотерроризмом, природными катаклизмами, авариями техногенного характера.
Ключевые слова: вакцина, вакцинопрофилактика, особо опасные бактериальные инфекции.
Иммунопрофилактика особо опасных бактериальных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва, туляремия, холера), возбудители которых относятся к микроорганизмам 1-11 групп патогенности [2], проводится в рамках Российского национального календаря прививок по эпидемическим показаниям [22]. Что касается сапа и мелиоидоза, то эти экзотические болезни не зарегистрированы в Российской Федерации. Однако территориальная близость эндемичных очагов указанных инфекций в сопредельных странах (Турция, Иран, Ирак, Афганистан, Китай, Монголия), активные международные и экономические связи создают реальную угрозу возможного заноса их в Россию со всеми вытекающими из этого последствиями [32].
Особую актуальность приобретают исследова-
ния в области совершенствования вакцинопрофи-лактики особо опасных бактериальных инфекций, возбудители которых входят в I-II группу возможных биологических агентов [3], в связи с возросшей вероятностью совершения биотеррористических актов группами диверсантов или отдельными странами после известных «почтовых» террактов в США в 2001 г., когда после вскрытия поступивших писем со спорами Bacillus anthracis пострадало более 20 чел., из них 5 - погибли от легочной формы сибиреязвенной инфекции [42].
Для специфической профилактики особо опасных бактериальных инфекций применяется ряд отечественных и зарубежных лицензированных вакцин (таблица). Необходимо отметить, что страны, разрабатывающие и производящие вакцины против ин-
