ВЭЖХ частично ферментативных сортов чая Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

134 Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2007. №2(52)

УДК 545.8

ВЭЖХ ЧАСТИЧНО ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СОРТОВ ЧАЯ

© 2007 Р.В. Шафигулин, А.В. Буланова1

В работе были исследованы частично ферментативные сорта чая методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Идентифицированы катехины, содержащиеся в чайных экстрактах и определено их количественное содержание.

1. Введение

Разнообразные фенольные соединения чрезвычайно широко распространены в растениях. Способность к их образованию и накоплению является характерной чертой растительных организмов. Они присутствуют во всех высших и в большинстве низших растениях. Большое количество полифенолов содержится в чайном листе и эта группа составляет наиболее ценную часть зеленого чайного листа и представлена в основном катехинами ( флавонол - 3 - олами) и их галловыми эфирами [1]. Чайный лист содержит 7 кристаллических катехинов: 4 простых—(±)катехин и (-)эпикатехин, (±)галлокатехин, (-)эпигаллокатехин; 3 сложных галлированных катехина: (-)эпикатехингаллат, (-)эпигаллокатехингаллат и (±)галлокатехингаллат. Во всех частях молодого чайного побега по количеству преобладают эпика-техингаллат и эпигаллокатехингаллат. В зависимости от степении ферментативной обработки содержание катехинов уменьшается при одновременном резком снижении количества эпикатехингаллата и эпигаллокатехингаллата [2]. Катехины чая нейтрализуют действие свободных радикалов и тем самым защищают организм от заболеваний. Самым активным из катехинов является эпигаллокатехингаллат (EGCG). Его антиоксидантные свойства во много раз сильнее, чем у витаминов Е и С. Комплекс катехинов и природного витамина С является мощным антиоксидантом, который вступает в реакции почти со всеми свободными радикалами, вызывающими онкологические заболевания, и защищает от них генетический аппарат клеток [3, 4]. Целью настоящей работы было определение качественного и количественного состава чая с частичной ферментацией на содержания в них катехинов.

1 Шафигулин Роман Владимирович ([email protected]), Буланова Анжела Владимировна, кафедра общей химии и хроматографии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

2. Экспериментальная часть

Объектами исследования явились частично ферментативные китайские чаи, произведенные в городе Яньцзы: оолонг (улун), красный,

лунзцин, тегуанинь. Провели качественный и количественный хроматографический анализ образцов чая на содержание в них следующих ка-техинов: (-)эпигаллокатехингаллат (EGCG), (-)эпигаллокатехин (EGC), (-)эпикатехин (EC), (+)катехин ((+)С), (-)эпикатехингаллат (ECG). Стандартные образцы катехинов произведены фирмами Janssen Chimica и Sigma (USA) с чистотой 99%. Использовали ацетонитрил (ACN), уксусную кислоту, хлороформ, этилацетат квалификации ч.д.а., и бидистиллированную и предварительно ионизированную воду. Структуры молекул используемых стандартных катехинов приведены на рис. 1.

EGCG

ECG

Рис. 1. Структура катехинов, содержащихся в чае

Экстракты чая готовили следующим образом: Навеску чая (2 г.) заливали дистиллированной водой и настаивали при 50 ± 5°С в течении 4 часов при постоянном перемешивании. Полученный экстракт фильтровали с помощью бумажного фильтра для удаления чайной флеши. Фильтрат упаривали на вакуумном испарителе до 10 мл, затем смешивали его с 10 мл хлороформа и проводили жидкостно-жидкостную экстракцию. Хлороформную фракцию удаляли. Водный экстракт смешивали с 10 мл этилацетата и проводили жидкостно-жидкостную экстракцию. Водную фракцию удаляли. Этилацетатную фракцию использовали для дальнейшего хроматогра-

фического анализа. Эксперимент осуществляли на жидкостном хроматографе Waters (USA) с УФ детектором, при длине волны 280 нм. Применяли колонку Optimapark OP С18 (250x4,6мм, диаметр частиц 5 мкм), объем вводимых проб 1 мкл. Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Элюирование проводили в градиентном режиме. В качестве органического модификатора подвижной фазы использовали ацетонитрил; pH элюента поддерживали постоянным, добавляя в него 0,1мл уксусной кислоты. Создавали следующий градиентный режим: в течение 30 минут концентрация ацетонитрила линейно увеличивалась с 10% до 30%. Идентификацию компонентов проводили путем сравнения с аутентичными образцами веществ. Времена удерживания стандартных катехинов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Времена удерживания катехинов

Вещества EGC (+)С ЕС EGCG ECG

Время удерживания,мин 11.05 13.59 17.55 18.09 25.19

Для количественного хроматографического анализа был использован метод абсолютной градуировки. При построении градуировочных зависимостей готовили растворы стандартов с концентрацией 500 ppm и вводили в хроматограф различные их объемы — 5, 10, 15, 20 мкл.. Строили зависимости площади пика от абсолютной массы стандарта катехина в объеме вводимой пробы. На рис.2 представлены градуировочные графики для стандартов исследуемых катехинов. В таблице 2 представлены уравнения, описывающие эти зависимости и коэффициенты корреляции. Из таблицы видно, что коэффициенты корреляции для калибровочных кривых достаточно высоки, что позволяет провести корректный количественный анализ. На рис. 3 представлены хроматограммы чайных экстрактов. Из рисунка видно, что разделение катехинов в данных условиях происходит удовлетворительно. Результаты количественного анализа представлены в табл. 3.

Таблица 2

Результаты математической обработки градуировочных

зависимостей

Компоненты Уравнения регрессии Коэффициент корреляции, R

EGC Y=297716X-67058 0.999

(+)С Y=854825Х-166504 0.999

ЕС Y=580132X-44593 0.999

EGCG Y=1174200X+111063 0.998

ECG Y=1154090X-314950 0.998

Примечание. Y — площадь пика; X — абсолютная масса.

Результаты математической обработки градуировочных зависимостей Из результатов хроматографического анализа видно, что содержание ка-техинов в исследуемых сортах чая невелико, по сравнению с зеленым чаем.

юоооооо -

се

W

Я

С 8000000 -

■ 1

о 2

д 3

V 4

О 5

& 6000000 -о

Масса, (мкг)

Рис. 2. Калибровочные зависимости стандартов исследуемых веществ. Принятые обозначения: 1-EGC, 2-(+)С, 3-ЕС, 4-EGCG, 5-ECG

Таблица 3

Содержание катехинов в различных сортах чая

Сорт чая Сухой остаток, мг/г Общее количество катехинов, %

EG С EGCG (+)С ЕС ECG

Оолонг (улун) 1,91 ±0,04 7,33 ± 1,56 1,58 ±0,07 1,06 ±0,01 3,25 ±0,001 1,5

Лунзцин 0,79 ±0,01 18,85 ± 1,07 3,92 ±0,01 1,68 ±0,01 8,46 ±0,69 3,4

Красный 0,81 ±0,01 0,62 ±0,01 2,11 ±0,02 0,48 ±0,01 1,29 ±0,01 0,5

Тегуанинь 1,80 ±0,14 6,25 ±0,10 1,77 ±0,01 0,85 ±0,01 2,77 ±0,01 1,3

Очевидно, это связано с тем, что исследуемые чаи подвергаются ферментативной обработке с различной степенью ферментации. Красный чай является чаем с более высокой степенью ферментации, чем оолонг (улун), лунзцин и тегуанинь и в нем содержится меньше определяемых катехи-нов. В большей степени ферментативные процессы влияют на содержание двух биологически важных катехинов - эпигаллокатехингаллата и эпика-техингаллата. Из рис.3 видно, что оолонг, лунзцин и тегуанинь содержат большое количество эпигаллокатехингаллата и эпикатехингаллата, в отличии от красного чая в котором содержание данных компонентов значительно меньше. Таким образом можно сделать вывод, что во время фабричной переработки зеленых чайных листьев резко снижается общее содержание катехинов в чайном листе.

О 5 10 15 20 25 30 35

Время, МИН

§ О.И

Тегу ан инь

О 5 10 15 20 25 30 35

Время, МИН

Время, мин

Время, мин

Рис. 3. Хроматограммы чайных экстрактов. Принятые обозначения: 1—EGC, 2 (+)С, 3 — ЕС, 4-EGCG, 5-ECG

20-

18-

16-

14-

12-

10-

Оолонг Тегуанинь

Сорт чая

Лунзцин Оолонг Тегуанинь Красный

Сорт чая

Рис. 4. Содержание эпигаллокатехингаллата и эпикатехингаллата в исследуемых образцах чая

Литература

[1] Блажей, А. Фенольные соединения растительного происхождения /

А. Блажей, Л. Шутый. - М.:Мир, 1977. - 240 с.

[2] Татарченко, И.И. Химия субтропических и пищевкусовых продуктов /

И.И. Татарченко, И.Г. Мохначев, Г.И. Касьянов. - Москва: Академия,

2003. - 256 с.

[3] Запрометов, М.Н. Биохимия катехинов / М.Н. Запрометов. - М.: Наука, 1964. - 294 с.

[4] Middleton, E. / E. Middleton, С. Kandaswami, T. Theoharides // Pharmacological Rev. - 2000. - 52. - P. 673-751.

Поступила в редакцию 26/ VIII/2006; в окончательном варианте — 26/VIII/2006.

PLC OF SEMI-FERMENTATED GRADES OF TEA

© 2007 R.V. Shafigulin, A.V. Bulanova2

An reverse-phase HPLC method with gradient elution for the quantification of catechins in semi-fermentated grades of tea is developed.

Paper received 26/VIII/2006. Paper accepted 26/VIII/2006.

2Shafigulin Roman Vladimirovich ([email protected]), Bulanova Anzhela Vladimirovna, Dept. of Organic Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.