CC BY
52
Хвойные бореальной зоны, XXXIII, № 5 - 6, 2015
УДК 561.284.579.61
ВЕЩЕСТВА ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА PLEUROTUS CITRINOPILEATUS
В.В. Тарнопольская, А.Е. Васок, Е.В. Алаудинова, П.В. Миронов
ФГБОУ ВО «Сибирский государственный технологический университет» 660049 Красноярск, пр. Мира, 82; е-mail: [email protected]
Исследован состав жирных кислот и стеринов липидов глубинного мицелия Pleurotus citrinopileatus. В составе липидов преобладают С16 и С18 ненасыщенные жирные кислоты, среди которых доминирует незаменимая линолевая кислота. Основную долю стеринов липидов глубинной культуры составляет эргостерол.
В результате исследования жирнокислотного состава липидов глубинной культуры P. citrinopileatus идентифицировано 23 индивидуальных соединения с числом атомов углерода от 10 до 24. Более 68 % жирных кислот являются ненасыщенными, при этом наибольший удельный вес в общем пуле ЖК имеет линолевая кислота - около 54 %, что характеризует глубинный мицелий P citrinopileatus как ценный источник незаменимых полиненасыщенных жирных кислот.
В составе липидов глубинной культуры P citrinopileatus присутствуют 24 соединения класса стеринов. Доминирующей группой являются эргостерол и его производные, их содержание составляет более 85 % от суммы стеринов.
Принимая во внимание ранее проведенные исследования, подтверждающие высокое содержание белка и углеводов при низком уровне нуклеиновых кислот, биомассу P atrinopileatus, культивируемую в глубинных условиях на растительных субстратах, можно рекомендовать к использованию в качестве комплексной кормовой добавки, обогащенной стеринами и незаменимыми жирными кислотами.
Ключевые слова: вешенка лимонная (Pleurotus atrinopileatus), базидиомицеты, биологически активные вещества, глубинный мицелий, липиды, жирные кислоты, стерины.
This paper presents results of fatty acids and sterins' identification in lipids of Pleurotus citrinopileatus in submerged culture. С16 and С18 unsaturated fatty acids are predominately found in lipids within which linoleic essential fatty acid prevails. Ergosterol comprises the major part of submerged mycelium lipids.
Total 23 individual fatty acids with number of carbon atoms ranging from 10 to 24 were identified as a result of P citrinopileatus lipids survey. More than 68 % of fatty acids were identified as unsaturated whereas limoleic acid represents 54 % of total amount of fatty acids; taking this into consideration submerged mycelium of P citrinopileatus could be reffered to as valuable source of unsaturated fatty acids.
Also 24 individual sterins were found in lipids of P. citrinopileatus submerged culture. Ergostrol and its derivatives dominate among sterins found and comprise more than 85 % of total amount of compounds of this group.
Taking into account previously reported results on high amounts of protein, carbohydrates and vitamins low contamination with nucleic acid residues, the biomass of P. citrinopileatus produced in submerged conditions on plant raw materials' substrates could be recommended for further utilization as complex nutritional supplement enriched with sterins and essential fatty acids.
Keywords: Pleurotus citrinopileatus, basidiomycetes, biologically active compounds, submerged mycelium, lipids, fatty acids, sterins.
ВВЕДЕНИЕ
В современном обществе неуклонно возрастает потребность в безопасных, экологически чистых и технологичных природных источниках биологически активных веществ (БАВ). В последние десятилетия базидальные грибы привлекают значительное внимание исследователей в качестве продуцентов белка, ферментов, ценных полисахаридов, витаминов и других БАВ. Показано, что базидиомицеты способны накапливать значительное количество БАВ липидной природы (Оценка возможности ... 2007). Общее содержание веществ липидной при-
роды (в дальнейшем называемых липидами) в плодовых телах существенно варьирует в зависимости от внешних условий и возраста (Беккер, 1988). Ценность липидов как биологически активной добавки обусловлена как составом жирных кислот (ЖК), входящих в их структуру, так и присутствием веществ класса стеринов, обладающих нейро- и онкопротек-торным действием и являющихся предшественниками витамина D2.
Одним из перспективных продуцентов соединений, обладающих широким спектром биологического действия, является РкитШ' аМпорПеаШ (Р. аМпорПеаШ, вешенка лимонная). Этот гриб, как
в природных условиях, так и в культуре, непатогенен, обладает высокой пищевой ценностью и способен утилизировать разнообразные растительные субстраты.
Известно, что в плодовых телах P. citrinopileatus содержатся БАВ, способные не только предупреждать, но и лечить широкий спектр заболеваний. Так, последние исследования свидетельствуют, что он обладает способностью снижать уровень глюкозы в крови человека, оказывает противоопухолевое действие, повышает иммунную устойчивость организма (Chen, 2009; Effect of Pleurotus citrinopileatus..., 2013; Zhang, L. 1994).
Сегодня показано, что культивируемый в глубинных условиях мицелий рода Pleurotus не уступает, а в ряде случаев превосходит их плодовые тела по содержанию белка, углеводов, липидов и других БАВ (Биологические особенности..., 2011). При этом глубинный мицелий имеет ряд преимуществ перед плодовым телом, из которых наиболее важные - чистота и стандартный стабильный химический состав. Технология же получения мицелия по сравнению с технологией выращивания плодовых тел более высокопроизводительна при сравнительно низких энерго - и трудозатратах. Однако до настоящего времени в научной литературе информация о химическом составе глубинной культуры большинства видов Pleurotus отсутствует, а имеющиеся данные зачастую носят фрагментарный и противоречивый характер (Биологические особенности..., 2011; Musieba, 2013; Соломко, 1978).
На кафедре химической технологии и биотехнологии СибГТУ ведутся комплексные исследования по разработке технологий глубинного культивирования ксилотрофных базидиомицетов на различных субстратах растительного происхождения, изучается химический состав получаемой биомассы глубинного мицелия. Представляемая работа является частью данного исследования и посвящена изучению состава веществ липидной природы глубинной культуры P. citrinopileatus, в частности идентификации жирных кислот и стеринов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Объектом настоящего исследования являлся штамм РС-1.2 ксилотрофного базидиомицета P citrinopileatus, чистая культура которого была выделена из коммерческих плодовых тел. Систематическое положение объекта исследования: царство Fungi; отдел Basidiomycota; класс Agaricomycetes; подкласс Agaricomycetidae; порядок Agaricales; семейство Pleurotaceae; род Pleurotus; вид Pleurotus dtrinopileatus (Жизнь растений.., 1976).
Глубинное культивирование проводили в стационарном лабораторном биореакторе «CeCa-Cx650, Великобритания» в течение 96 часов при температуре 26 0С, pH 5,0 и непрерывном перемешивании путем барботирования стерильным воздухом (расход воздуха 100 л/ч на 1 л среды). Среду предварительно стерилизовали в автоклаве в течение 30 минут при 0,5 кгс/см2. В качестве питательной среды использовали гидролизат растительного сырья с массовой долей редуцирующих веществ не менее 3 %.
Липиды из глубинного мицелия выделяли по методу Блайя и Дайера (Кейтс М., 1975). После щелочного гидролиза суммарных липидов жирные кислоты анализировали в виде их метиловых эфиров на хромато-масс-спектрометре Agilent Technologies фирмы «Хьюлетт-Паккард» с масс-селективным детектором, работающим в режиме электронного удара с регистрацией разделенных компонентов по полному ионному току. Колонка кварцевая капиллярная HP-FAAP длиной 30 м и диаметром 0,25 мм; начальная температура термостата колонки 100 0С, конечная 220 0С; газ-носитель - гелий. Компоненты идентифицировали по масс-спектрам (библиотека масс-спектров NIST 02.L), индексам удержания, сравнением со стандартами (фирмы Sigma, Serva); положение двойных связей уточняли по диметилдисульфидным и ок-созолиновым производным.
Анализ стеринов выполнен на том же приборе. Колонка капиллярная HP-5MS длиной 30 м и диаметром 0,25 мм; фаза неполярная; начальная температура термостата колонки 180 0С, конечная 320 0С; газ-носитель - гелий. Идентификацию стеринов проводили по масс-спектрам и по времени удерживания, используя в качестве стандартов холестерин, брасси-костерин, кампостерин и р-ситостерин.
Коэффициент (К) ненасыщенности жирных кислот определяли как отношение суммы ненасыщенных жирных кислот к сумме насыщенных жирных кислот. Индекс двойной связи (ИДС), характеризующий степень ненасыщенности липидов, вычисляли по методу (Lyons, 1964).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что суммарное содержание липидов в исследуемом глубинном мицелии составляет 2,89 % от а.с.м. мицелия. Следует отметить, что в глубинном мицелии близкородственного вида Pleurotus ostreatus (P. ostreatus), культивируемом по аналогичной технологии, содержится сопоставимое количестволипидов-2,78 %, в то время как мицелий Pleurotus djamor (P. djamor) в 2,5 раза богаче веществами, относящимися к этому классу (Fatty acids, 2015).
Состав жирных кислот липидов представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Состав жирных кислот липидов глубинного мицелия Р. скгторйеМш, в % от суммы жирных кислот
Наименование Содержание
1 2
Каприновая (С0) следы
Лауриновая (С120) следы
Тридекановая (С0) следы
Миристиновая (С140) 0,58±0,03
Миристоолеиновая (С ) следы
Пентадекановая (С150) 4,75±0,24
Пентадеценовая (С ) следы
Хвойные бореальной зоны, XXXIII, № 5 - 6, 2015
Окончание таблицы 1
1
2
Пальмитиновая (С16.0) 18,48±0,92 Дигидроксипальмитиновая (С16.0 2OH) 1,29±0,06
Пальмитолеиновая (С161) 2,08±0,10
Гексадекадиеновая (С162) следы
Маргариновая (С170) 1,23±0,06
Гептадеценовая (С171) 0,28±0,01
Гептадиеновая (С172) 0,17±0,01
Стеариновая (С18.0) 3,77±0,19
Олеиновая (С181) 11,12±0,56
Линолевая (С18.2) 54,27±2,71
Линоленовая (С18.3) 0,15±0,01
Арахиновая (С20.0) 0,15±0,01
Эйкозеновая (С201) 0,10±0,01
Бегеновая (С22.0) 0,68±0,03
Трикозановая (С23.0) 0,23±0,01
Лигноцериновая (С24.0) 0,67±0,03
S насыщенных ЖК 31,72
Z ненасыщннных ЖК 68,28
К 2,15
ИДС_123_
В результате исследования идентифицировано 23 индивидуальных ЖК. В составе присутствуют соединения, различающихся по числу атомов углерода в цепи и количеству двойных связей.
В составе ЖК с числом атомов углерода в цепи 20 и более у P. citrinopileatus идентифицированы 5 индивидуальных соединений: арахиновая, эйкозеновая, бегеновая, трикозановая и лигноцериновая кислоты, суммарное содержание которых около 2 %.
Основную долю ЖК составляют компоненты с 18 атомами углерода, их суммарное содержание достигает 69 %; в составе присутствуют стеариновая, олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты. Несмотря на то, что суммарное содержание кислот С18 в липидах P. citrinopileatus сопоставимо с таковым у других представителей рода Pleurotus, по содержанию незаменимой линолевой кислоты P. citrinopileatus превосходит P. djamor и P. ostreatus примерно в 1,5 - 2 раза (Fatty acids, 2015), доля линолевой кислоты в составе ЖК ряда С18 достигает 79 %.
Сумма кислот ряда С16: пальмитиновой, дигидрок-сипальмитиновой, пальмитолеиновой и гексадекадие-новой - около 22 %, при этом наибольшую долю составляет пальмитиновая - 84 % сумма кислот этой группы.
Низкомолекулярные компоненты с числом атомов углерода от 10 до 13 - каприновая, лауриновая, триде-кановая обнаружены в следовых количествах.
Обращает на себя внимание присутствие в ЖК значительного количества соединений с нечетным числом атомов углерода - 6,66 % от суммы ЖК, обнаружение которых связано с развитием аппаратурной базы исследований.
Анализируя жирнокислотный состав липидов P. citrinopileatus, необходимо отметить высокое со-
держание ненасыщенных соединений - 68,28 % от суммы ЖК, в составе которых доминируют полиненасыщенные (ПНЖК) - около 80 % от суммы ненасыщенных ЖК (рисунок 1).
70 60 50 40 30 20 10 0
Насыщенные Ненасыщенные ЖК ЖК
ПНЖК
Линолевая ЖК
Рисунок 1 - Содержание основных групп ЖК в глубинном мицелии P dtrinopileatus
Соответственно, К и ИДС у P. citrinopileatus почти вдвое превышают эти показатели у P. djamor и P. ostreatus (Fatty acids, 2015). Наиболее полное представление о степени ненасыщенности липидов даёт ИДС, учитывающий не только содержание ненасыщенных кислот, но и количество двойных связей в них.
В целом, состав ЖК липидов глубинного мицелия P citrinopileatus характеризуется высоким содержанием ненасыщенных ЖК с преобладанием незаменимой линолевой ПНЖК.
Состав стеринов глубинной культуры P. citri-nopileatus представлен в таблице 2.
Таблица 2 - Состав стеринов глубинного мицелия P. àtrinopileatus, в % от суммы стеринов
Наименование Содержание
Андростан 0,73±0,03
Сквален 2,56±0,12
Циклохолестирол 7,42±0,36
9(11)-дигидроэргостирил 0,30±0,01
Эргоста-5,7,9,14-тетраен 1,11±0,05
Эргоста-5,7,9,22-тетраен 0,50±0,02
Холест-5-ен-3-ол 0,76±0,03
Эргоста-4,6,22-триен-3а-ол 7,51±0,37
Эргоста-7,22-диен-3,6,6-триол 2,01±0,10
Эргостерол 51,62±2,58
7,22-эргостадиенол 3,66±0,18
Эргостенол 4,39±0,22
7,22-эргостадиенон следы
Эргоста-5,8-диен-3-ол 0,40±0,02
у-эргостенол 11,55±0,57
Холест-7-ен-3-ол 0,45±0,02
у-ситостерол 1,16±0,05
Ланостерол 0,69±0,03
Стигмаст-8(14)-ен-3Р-ол следы Эргоста-4,6,8(14),22-тетраен-3-он 2,26±0,11
Ланост-8-ен-3-ол 0,37±0,02
9,19-циклоланостан-3-ол следы
Стигмаст-4-ен-3-он следы
Ланост-8-ен-7,11-диенол 0,40±0,02
В общем пуле стеринов идентифицировано 24 индивидуальных вещества, относящихся к этому классу соединений. Для анализа данных стерины разделены на четыре группы: эргостерол и его производные, хо-лестерол и его производные, ланостерол и его производные, сквален (рисунок 2).
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Группа эргостерола
Группа холестерола
Группа сквалена
Группа ланостерола
Рисунок 2 - Содержание основных групп стеринов глубинного мицелия P citrinopileatus
Необходимо отметить, что все вышеназванные соединения биосинтетически связаны между собой, их одновременное нахождение в биомассе мицелия является признаком активного и диверсифицированного метаболизма глубинной культуры, что опосредованно подтверждается более высокими темпами роста и накопления биологически активных веществ при глубинном культивировании по сравнению с производством плодовых тел (Submerged fermentation..., 2012).
Сумма эргостерола и его производных является наибольшей и составляет 85,46 % от суммы стеринов. Эргостерол присутствует в клеточных мембранах грибов и отсутствует в клеточных мембранах животных, являясь биологическим предшественником (провитамином) витамина D2 При УФ-облучении эргостерол преобразуется в эргокальциферол, форму витамина D, также известную как витамин D2.
Сумма холестерола (холестерина) и его производных составляет 10,52 %. Холестерин метаболически связан с эргостеролом, таким образом участвуя в образовании витамина D. Также к его важным функциям в организме человека стоит отнести участие в выработке различных гормонов, активизацию деятельности синапсов головного мозга и иммунной системы, включающую защиту от онкологических заболеваний.
Сумма ланостерола и его производных, являющихся промежуточными соединениями при биосинтезе холестерина и производных от него стеринов и стероидов у позвоночных и грибов, в липидах глубинной биомассы мицелия P. citrinopileatus не высока - 1,46 %.
Сумма сквалена и его производных, идентифицированных в составе липидов глубинной культуры P. citrinopileatus, составила 2,56 %. Сквален является промежуточным соединением в биологическом синтезе стероидов, в том числе и холестерина (через ланостерол), и участвует в обмене веществ, с легко-
стью вступая в реакцию с водой, высвобождая кислород и насыщая им органы и ткани. Благодаря высокой реакционной способности, сквален обладает антиканцерогенным, антимикробным и фунгицид-ным действием, поскольку именно дефицит кислорода и окислительные повреждения клеток являются главными причинами старения организма, а также возникновения и развития опухолей.
ВЫВОДЫ
В результате исследования жирнокислотного состава липидов глубинной культуры P dtrinopileatus идентифицировано 23 индивидуальных соединения с числом атомов углерода от 10 до 24. Более 68 % жирных кислот являются ненасыщенными, при этом наибольший удельный вес в общем пуле ЖК имеет линолевая кислота - около 54 %, что характеризует глубинный мицелий P dtrinopileatus как ценный источник незаменимых полиненасыщенных жирных кислот.
В составе липидов глубинной культуры P dtrinopileatus присутствуют 24 соединения класса стеринов. Доминирующей группой являются эрго-стерол и его производные, их содержание составляет более 85 % от суммы стеринов.
Необходимо также отметить наличие широкого спектра метаболически связанных стеринов в составе всех анализируемых фракций, что позволяет сделать вывод о высокой интенсивности обменных и биосинтетических процессов в глубинной культуре P atrinopileatus. Особую ценность составу стеринов придает то, что все эти соединения являются биосинтетическими предшественниками витамина D.
Принимая во внимание ранее проведенные исследования (Химический состав ..., 2014), подтверждающие высокое содержание белка и углеводов при низком уровне нуклеиновых кислот, биомассу P. atrinopileatus, культивируемую в глубинных условиях на растительных субстратах, можно рекомендовать к использованию в качестве комплексной кормовой добавки, обогащенной стеринами и незаменимыми жирными кислотами.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Оценка возможности использования базидиальных грибов в качестве источников биоактивных липидных компонентов / Т. С. Гвоздкова [и др.] // Успехи медицинской микологии, 2007. - Т. IX. - С. 151-154. Беккер, З. Э. Физиология и биохимия грибов / З. Э. Беккер.
- М.: Изд-во МГУ, 1988. - 230 с. Chen, J. N. A glycoprotein extract from golden oyster mushroom Pleurotus citrinpileatus exhibiting growth inhibitory effect against U937 leukemia cells / J. N. Chen, Y. T. Wang, J. S. Wu // Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009. -Vol. 57. - № 15. - P. 6706-67011. Effect of Pleurotus citrinopileatus on blood glucose, insulin and catalase of strptozotocin-induced type 2 diabetes mellitus rats / S. Rashita [et al.] // The Journal of Animal & Plant Sciences, 2013. - Vol. 23. - № 6. - P. 1566-1571. Zhang, L. Antitumor polysaccharides from a Chinese mushroom, "Yuhuangmo," the fruiting body of Pleurotus
Хвойные бореальной зоны, XXXIII, № 5 - 6, 2015
citrinopileatus / L. Zhang, G. Wang, H. Li [et al.] // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1994. -Vol. 58. - № 7. - P. 1195-1201.
Биологические особенности лекарственных макромице-тов в культуре: Сборник научных трудов в двух томах. Т. 1 / Под ред. С. П. Вассера. - Киев: Альтерпрес, 2011. - 212 с.
Musieba, F. Proximate composition, amino acids and vitamins profile of Pleurotus citrinopileatus Singer: an indigenious mushroom in Kenya / F. Musieba, S. Okoth, R. Mibey [et al.] // American Journal of Food Technology, 2013. - P. 1-7.
Соломко, Э. Ф. Сравнительный химический состав и питательная ценность мицелия съедобных грибов, выращенных глубинным методом / Э. Ф. Соломко // Производство высших съедобных грибов в СССР. - Киев : Наук. думка, 1978. - С. 98-104.
Жизнь растений в шести томах. Т. 2. Грибы / Под ред. М.В. Горленко. - М. : Просвещение, 1976. - 479 с.
Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. - М. : Мир, 1975. - 322 с.
Lyons, J. M. Relationship between the physical nature of mitochondrial membranes and chilling sensitivity in plants / J. M. Lyons, T. A. Wheaton, H. R. Pratt // Plant Physiology, 1964. - Vol. 39. - № 2. - P. 262-268.
Fatty acids of xylotrophic basidiomycetes of the genus Pleurotus in submerged culture / V. V. Tarnopolskaya [et al.] // Chemistry of Natural Compounds, 2015. - Vol. 51. -№ 2. - Р. 328-329.
Submerged fermentation of the edible mushroom Pleurotus ostreatus in a batch stirred tank bioreactor as a promising alternative for effective production of bioactive metabolites / L. M. Papspyridi [et al.] // Molecules, 2012. - Vol. 17. -P. 2714-2724.
Химический состав глубинной культуры ксилотрофных ба-зидиомицетов рода Pleurotus / В.В. Тарнопольская [и др.] // Хвойные бореальной зоны, 2014. - № 1-2. - С. 79-81.
Поступила в редакцию 17.09.15 Принята к печати 28.12.2015
