CC BY
67
УДК / UDC 636.5:612.111:311.14
ВАРИАНТ МЕТОДИКИ УЧЁТА ЯДЕРНЫХ АНОМАЛИЙ В ЭРИТРОЦИТАХ ПТИЦ
OPTION OF METHOD FOR ACCOUNTING NUCLEAR ANOMALIES IN BIRDS ERYTHROCYTES
Крюков В.И., доктор биологических наук, профессор Kryukov V.I., Doctor of Biological Sciences, Professor ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет имени Н.В.
Парахина», Орел, Россия
Federal State Budgetary Educational Establishment of Higher Education «Orel State Agrarian University named after N.V. Parakhin», Orel, Russia
E-mail: [email protected]
Анализ частоты возникновения клеток с микроядрами и иными ядерными аномалиями является широко используемым методом онкоскрининга и оценки генетической опасности средовых факторов. Этот метод широко используется для изучения частот цитогенетических аномалий в эритроцитах периферической крови птиц. Вместе с тем, критерии выявления ядерных аномалий, используемые разными исследователями, довольно размыты и для обозначения одних и тех же аномалий используют разные названия и наоборот, разные аномалии обозначают одним термином. Такая ситуация затрудняет оценку мутагенной активности факторов, действующих на птиц в экспериментальных условиях, препятствует сравнительному анализу фоновых частот ядерных аномалий у птиц из природных популяций и сельскохозяйственных птиц разных видов, пород и кроссов. В данной публикации предпринята попытка систематизировать для практического анализа существующее разнообразие наименований и описаний наиболее часто встречающихся ядерных аномалий в эритроцитах птиц. При подготовке публикации был использован личный опыт тестирования ядерных аномалий в эритроцитах птиц, амфибий и рыб, а также учтены ранее опубликованные методические рекомендации по микроядерному тестированию клеток животных и человека. Представленный вариант методики учёта микроядер и других ядерных аномалий в эритроцитах птиц, предлагает дифференцировать ядерные аномалии по пяти размерным классам (>0,1; 0,1-0,2; 0,21-0,33, 0,34-0,5, 0,51-1,0) и одновременно определять индивидуальные и суммарные частоты хроматиновых фрагментов, полностью отделившихся от основного ядра, примыкающих к ядру, связанных с основным ядром хроматиновыми мостами, а также морфологических структур, хроматин которых не отделён от хроматина основного ядра. Методика может быть использована для учёта ядерных аномалий у других животных, эритроциты которых содержат ядра -рыб, амфибий и пресмыкающихся.
Ключевые слова: птицы, кровь, эритроциты, микроядра, ядерные аномалии, мутагенез, генетический мониторинг, птицеводство.
Analysis of the frequency of cells with micronucleus and other nuclear anomalies is a widely used method of oncological screening and assessment of the genetic hazard of environmental factors. This method is widely used to study the frequencies of cytogenetic anomalies in red blood cells of the peripheral blood of birds. At the same time, the criteria for detecting nuclear anomalies used by different researchers are rather vague. They use different names to denote the same anomalies and vice versa, different anomalies denote the same term. This situation makes it difficult to assess the mutagenic activity of factors, acting on birds in experimental conditions. It prevents a comparative analysis of the background frequencies of the nuclear anomalies in birds from natural populations and farm birds of different species, breeds and crosses. In this publication, the author made an attempt to systematize for the practical analysis the existing variety of names and descriptions of the nuclear anomalies in the bird erythrocytes. To prepare the publication, the author used personal experience in testing
nuclear anomalies in the erythrocytes of birds, amphibians, and fishes. The guidelines for micronuclear testing of the animal and human cells, published earlier, were also taken into account. The presented version of the method for calculating the frequencies of micronucleus and other nuclear anomalies in bird erythrocytes suggests differentiating nuclear anomalies by five dimensional classes (> 0.1; 0.1-0.2; 0.21-0.33, 0.34-0, 5, 0.51-1.0) relative to the size of a normal cell nucleus. In addition, it is proposed to determinate the individual and total frequencies of the chromatin fragments that are completely separated from the main nucleus, adjacent to the nucleus, connected to the main nucleus by chromatin bridges, as well as morphological structures which chromatin is not separated from the chromatin of the main nucleus. This protocol can be used to calculate the nuclear anomalies in other animals whose erythrocytes contain the nucleus - fish, amphibians and reptiles.
Key words: birds, blood, erythrocytes, micronuclei, nuclear anomalies, mutagenesis, genetic monitoring, poultry farming.
Введение. Современная генетика располагает большим количеством методов оценки генетической опасности средовых факторов. Одним из них является цитогенетический метод анализа частоты возникновения клеток с микроядрами и иными ядерными аномалиями. В настоящее время микроядерный тест включён во многие протоколы тестирования пищевых, фармакологических, косметических, промышленных и сельскохозяйственных химикатов. Этот тест хорошо разработан для анализа клеток человека и млекопитающих in vivo и in vitro [1]. Он широко используется для исследования цитогенетических аномалий в эритроцитах периферической крови рыб, амфибий, пресмыкающихся и птиц. Вместе с тем, анализ литературы по микроядерному тестированию животных указанных четырёх классов свидетельствует, что критерии выявления ядерных аномалий в эритроцитах этих животных, используемые разными исследователями, довольно размыты и авторы используют разные названия для обозначения одних и тех же аномалий. Особенно заметны такие различия в публикациях, посвящённых микроядерному тестированию у птиц. Это является существенным препятствием для сравнительного анализа фоновых частот ядерных аномалий у птиц из природных популяций, а также сельскохозяйственных птиц разных видов, пород и кроссов. Различия в названиях и критериях для выявления ядерных аномалий, используемых разными авторами, затрудняют оценку мутагенной активности факторов, действующих на птиц в экспериментальных условиях. В данной работе предпринята попытка систематизировать для практического анализа существующее разнообразие наименований и описаний наиболее часто встречающихся аномалий в эритроцитах периферической крови птиц. При этом был использован личный опыт тестирования ядерных аномалий в эритроцитах птиц, амфибий и рыб, а также учтены ранее опубликованные методические рекомендации по микроядерному тестированию эритроцитов птиц и клеток буккального эпителия человека, как наиболее детально разработанного специалистами [2-7].
Морфология нормальных ядер и ядерных аномалий в эритроцитах птиц
1. Морфология нормальных эритроцитов. Эритроциты птиц в норме имеют овальную форму с ядром, расположенным в центре клетки (рис., 1). После умеренного окрашивания мазков крови интенсивность окраски хроматина в гетеро- и эухроматиновых зонах ядра может несколько различаться. При продолжительном интенсивном окрашивании нормальное интерфазное ядро обычно окрашивается равномерно по всей площади.
Рисунок - Схематическое изображение эритроцитов: нормальный эритроцит птицы (1);
эритроциты с микроядрами - изолированным (2), примыкающим (3), соединённым мостом (4); двуядерные клетки с изолированными ядрами (5), примыкающими ядрами (6), соединённые мостами гантелеобразные (7) и в виде восьмёрки (8); двулопастное ядро (9) и лопастные ядра - с примыкающей лопастью (10) и соединённой мостом лопастью (11); эритроциты с почкующимся ядром (12) и пузырящимся ядром (13); эритроциты с хвостатыми ядрами - нитевидным (14) и клювовидным (15); эритроцит с зазубренным (16) ядром и с ядром со впадиной (17); эритроцит с почковидным ядром (18); эритроциты с вакуолизированным ядром (19) и перинуклеарной вакуолью (20); эритроциты в состоянии кариопикноза (21), кариорексиса (22) и кариолизиса (23); эритроцит со смещённым от центра к периферии ядром (24)
Ядро нормального эритроцита не сегментировано и имеет эллипсовидную форму. В соответствии с рекомендациями [2] расстояние между вершинами эллипса (длину большой оси ядра) будем обозначать символом D, а ширину ядра (длину малой оси эллипса) - символом d. Предварительные анализы этих величин у индюков разного возраста и страдающих гиповитаминозом свидетельствуют о варьировании этих размерных признаков. Возможно, что при изучении патологических состояний сельскохозяйственных птиц будет полезным сравнение этих двух величин у особей разных экспериментальных групп. Математической характеристикой «вытянутости» эллипса является его экстентриситет, однако практическое определение этой величины на микроскопических изображениях ядер технически затруднительно. Поэтому мы предлагаем анализ более просто вычисляемого соотношения - D/d. Назовём эту величину индексом удлинённости ядра (Ine, Index of nucleus elongation). В периферической крови индюков встречаются эритроциты с почти круглыми ядрами (Ine=1) и очень удлинёнными ядрами (lne>3) [8].
При цитогенетическом анализе эритроцитов критерием некоторых из аномальных ядерных образований, описанных ниже, является их размер относительно размеров нормальных ядер. В клетках буккального эпителия
человека и других млекопитающих ядра имеют почти круглую форму. Поэтому при анализе их ядер в качестве размерной величины используют диаметр основного ядра клетки. В эритроцитах птиц ядра имеют эллипсовидную форму, и их индекс удлинённости может сильно варьировать. При обнаружении ядерных аномалий, форма которых также может отличаться от круга, сравнение диаметров не всегда оказывается корректным. Поэтому предлагается другой параметр - площадь нормального ядра (Snn, square of the normal nucleus), которую примем за 1 (100%). Размеры (площади) всех аномальных ядерных структур (двойных ядер, ядерных лопастей, почек, микроядер и др.) при необходимости будем СООТНОСИТЬ С Snn.
2. Микроядра - это хроматиновые образования размером от 1/3 до 1/16 площади нормального ядра, возникающие в цитоплазме клетки обособленно от основного ядра и содержащие целые хромосомы или их фрагменты, не включённые при делении клетки в состав дочерних ядер (рис., 2-4). Некоторые авторы минимальным размером микроядер считают величину равную 1/20 размера нормального ядра.
Микроядра являются патологической структурой и могут быть обнаружены в клетках любых тканей. Образуются они при делении клетки в результате отставания ацентрических фрагментов или целых хромосом от движущихся к полюсам основных наборов хромосом. Микроядра обнаружены в клетках человека, животных и растений. На этом основании сделан вывод о единстве механизма образования микроядер у различных организмов и возможности его использования в качестве универсального маркера воздействия на организм мутагенных факторов.
Если во время митоза отставшая хромосома в телофазе не включается в состав одного из формирующихся ядер дочерних клеток и остаётся в цитоплазме одной из них, то вокруг неё образуется своя оболочка, сходная с ядерной оболочкой и эта хромосома превращается в микроядро. Аналогичные процессы происходят с отделёнными ацентрическими фрагментами хромосом, возникшими в результате разрыва нитей ДНК. Такие фрагменты, лишённые центромеры и поэтому не имеющие прикреплённых нитей веретена деления, отстают от хромосом, движущихся к полюсам, остаются в цитоплазме и также формируют микроядра.
Микроядра могут формироваться из материала хроматиновых мостов, возникших между двумя дочерними ядрами. Такие мосты образуются в тех случаях, когда в результате транслокации или неправильной репарации разрывов ДНК образуется дицентрическая хромосома, центромеры которой в анафазе расходятся к разным полюсам. При разрыве такого моста в двух точках образуется ацентрический фрагмент, который может сформировать микроядро.
Ряд авторов высказывал предположение о том, что микроядра могут образовываться в интерфазе в результате вывода из ядра некоторого количества аномально амплифицированного гетерохроматина, а также, что микроядра могут возникать вследствие деструкции ядра и апоптоза клетки [3, 5, 6, 9]. Однако, как будет показано ниже, фрагменты хроматина, очень схожие с микроядрами, обнаруживаемые в клетках, находящихся в состоянии апоптоза, учитывать как микроядра не рекомендуют [7, 10].
При завершении митоза не попавшие в ядро и рассредоточенные в цитоплазме хромосомы и их фрагменты формируют свою собственную оболочку, образуя микроядра различной величины. Если в делящейся клетке отставших хромосом или хромосомных фрагментов оказалось два или более, то они могут сформировать соответствующее число микроядер, размеры которых будут зависеть от количества, включённого в них хроматина. Судьбы микроядер в различных клетках могут быть различны [11] и являются предметом исследований
цитопатологов. Установлено (по крайней мере - для раковых клеток человека), что в следующей после митоза интерфазе более 60% микроядер теряют свою компартментацию из-за разрушения ядерной оболочки. Полагают, что это связано с нарушениями процесса сборки ядерной пластинки [12].
В процессе развития микроядерного тестирования критерии для признания внеядерной гетерохроматиновой структуры микроядром несколько менялись. Изменения касались размеров и интенсивности окраски микроядер, а также их положения и степени изолированности от основного ядра.
Размеры микроядер. На ранних этапах разработки и использования микроядерного теста считали, что размер микроядра не должен был превышать 1/5 размера основного ядра [13]. В настоящее время максимальный размер микроядра ограничивают 1/3 величины основного ядра [10, 14-16].
Ряд авторов высказали предположение, что размер микроядер может быть связан с природой фактора: кластогенные факторы продуцируют микроядра малых размеров, а анеугенные - крупные. В связи с этим дифференциация обнаруженных микроядер по размеру может быть дополнительной информацией, характеризующей исследуемый фактор. Поскольку значительная часть методических разработок по учёту микроядер опубликована для буккальных клеток человека, имеющих круглые ядра, то при характеристике размеров микроядер чаще сравнивают диаметры основного ядра и микроядер. У рыб, амфибий и птиц ядра эллипсовидной формы. Поэтому в качестве единицы сравнения у птиц предлагается использовать не диаметры ядер, а их площади на препаратах, разделяя их на три размерных группы (например, площадью >0,1 Snn, (0,1-0,2)Snn и (0,21-0,33)Snn. При необходимости число размерных групп может быть увеличено с соответствующим уменьшением размерных интервалов.
Расположение микроядер. Требования к расположению микроядер относительно основного ядра у авторов различных исследований существенно различаются. В некоторых публикациях указывалось на необходимость полной изоляции микроядра от основного ядра слоем цитоплазмы (рис., 2). Однако, начиная с самых ранних публикаций результатов микроядерного тестирования, многие авторы называли микроядрами и такие хроматиновые образования, которые касались оболочки основного ядра (рис., 3). Такие ядерные аномалии называли «примыкающими микроядрами» (adjacent micronuclei) [17-19]. Во многих публикациях последних лет такие аномалии продолжают называть микроядрами уже без сохранения определения «примыкающиие». Мы предлагаем это уточняющее определение восстановить, т.к. наш опыт анализа микроядер свидетельствует, что удалённость микроядра от основного ядра может быть различной и в ряде случаев слой цитоплазмы между ними может быть очень тонким, вплоть до не выявляемого визуально. Исключение таких хроматиновых структур из класса микроядер может вести к занижению интенсивности воздействия мутагенного фактора. Мы предлагаем такие ядра относить к подгруппе «микроядер, примыкающих к ядру» и учитывать как отдельную категорию. Раздельный учёт «классических» микроядер и «примыкающих микроядер» позволит при сравнительном анализе учитывать частоты микроядер отвечающих только строгим критериям, но в то же время и учитывать суммарные частоты всех возникших микроядер, в том числе и тех, оболочка которых оказалась очень близко к оболочке основного ядра. При этом ядра с примыкающими к ним микроядрами нужно отличать от пузырящихся ядер и лопастных ядер, критерии которых будут указаны ниже. Главным отличием примыкающего микроядра от «пузырьков» пузырящегося ядра и ядерных лопастей является то, что ядро и микроядро имеют контакт только в точке касания, не имеют продолжительной общей границы, а их гетерохроматиновые массы изолированы друг от друга мембранами ядра и микроядра (рис., 3).
В некоторых исследованиях выделяли «микроядра на ножках» или «микроядра соединённые с ядром тонкой нитью», т.е. такие микроядра, тело которых находилось на определённом удалении от основного ядра, но было связано с ним тонким каналом кариоплазмы (рис., 4). В настоящее время такие микроядра рассматривают как результат одинарного разрыва хроматинового моста, образованного дицентрической хромосомой, центромеры которой разошлись к разным полюсам. Мы также сохраняем эту категорию микроядер, но предлагаем учитывать их отдельно от двух предыдущих категорий для того чтобы сохранилась возможность подсчёта частоты «мостов».
Цвет и оттенок микроядер. В первых работах, посвящённых микроядерному тестированию, подчёркивалось, что цвет и оттенок микроядер должен быть таким же, как и у основного ядра. Однако по мере изучения природы микроядер стало понятно, что в некоторых из них конденсация ДНК может происходить медленнее, чем в ядре. В некоторых клетках из-за различий в степени конденсации хроматина, оптическая плотность микроядер может быть меньше оптической плотности хроматина основного ядра. Поэтому в настоящее время допускается, что ядро может быть светлее основного ядра, но не может быть более тёмным.
Форма и морфология края микроядер. Многие авторы указывают, что хроматин микроядер окружён оболочкой по своей природе сходной с оболочкой ядра. В связи с этим ещё одним обязательным критерием микроядер многие авторы называют их форму и геометрию края. По их мнению микроядра должны быть круглой или овальной формы, а их края - гладкими и непрерывными. Однако ещё в одной из первых работ по методике микроядерного тестирования было указано, что микроядра могут быть любой формы [13, с. 35]. Кроме того, существует мнение, что микроядра могут не иметь оболочки подобной ядерной [20, с. 36]. Наш опыт анализа микроядер в эритроцитах рыб и птиц показывает, что в эритроцитах можно обнаружить микроядра, у которых только часть периметра имеет форму дуги с ровным краем. Другая часть периметра может иметь неровный, зубчатый край. Такие микроядра могут появляться в результате неполного завершения, аномального формирования или даже разрушения их оболочки [12]. В этом случае та часть хроматина микроядра, которая осталась не отграниченной от цитоплазмы, вероятно, может иметь неровный край. Поэтому внеядерная хроматиновая структура, соответствующая всем критериям микроядра, но имеющая часть периметра с неровным краем, всё-таки должна быть классифицирована как микроядро.
Количество микроядер в клетке. В клетках изредка могут быть обнаружены 2 и более микроядер. Их количество может быть определённой характеристикой интенсивности действия мутагенного фактора. Поэтому клетки с 2 и большим количеством микроядер могут учитываться отдельными категориями.
Таким образом, для отнесения окрашенной внутриклеточной структуры к микроядру, она должна соответствовать следующим критериям: 1) микроядро может быть расположено в цитоплазме клетки в одном из трёх вариантов: а) отделённым от ядра ясно видимым слоем цитоплазмы; б) контактировать с оболочкой ядра по касательной без объединения хроматинового материала; в) быть соединённым с ядром хроматиновым «мостом»; 2) микроядро должно находиться в одной фокальной плоскости с ядром; 3) размер микроядра не должен превышать 1/3 величины основного ядра и при необходимости микроядра могут быть разделены по размерным группам; 4) цвет и видимая фактура хроматина ядра и микроядра должны или совпадать, или микроядро может быть светлее ядра; структуры, окрашенные темнее ядра, следует относить к артефактам; 5) микроядро должно быть округлой или овальной
формы с гладким непрерывным краем; если исследователь допускает возможность существования микроядер с частично неровным краем, то их долю среди всех обнаруженных микроядер желательно указывать; 6) микроядро не должно проявлять рефракцию т.е. не должно давать ореолов (рефракция лучей свидетельствует о преломлении лучей отличающимся от их преломления в хроматине основного ядра и является отличительной особенностью многих артефактов, например, мелких кристаллов красителя).
При несоблюдении указанных критериев за микроядра можно принять ряд компонентов, являющихся артефактами. Часто встречаемый артефакт - это мелкие тёмные гранулы, которые образуют на поверхности препарата некоторые красители. Такие гранулы могут быть очень похожими на микроядра. Основной их отличительной особенностью является то, что они имеют иную интенсивность окраски и светопреломление. При анализе клеток буккального эпителия млекопитающих или крови инфицированных птиц за микроядра можно принять бактерий. Однако обычно они отличаются от микроядер меньшим размером, цветом и интенсивностью окраски, а также находятся в иной фокальной плоскости, т.к. лежат не внутри клетки, а над или под ней [6, с. 10].
После интенсивного воздействия химических или физических факторов в крови птиц возможно появление эритроцитов с другими атипичными ядрами. В 1992 году П. Толберт с сотрудниками [21] предложили при цитогенетическом анализе буккального эпителия человека анализировать помимо микроядер другие видимые аномалии морфологии ядра. Учёт этих аномалий повысил чувствительность метода. Позже различные ядерные аномалии, в дополнение к микроядрам, стали учитывать в клетках других позвоночных животных, в том числе - птиц. Ниже рассмотрены характеристики и критерии этих ядерных аномалий в соответствии с предлагаемой классификацией.
3. Двуядерные клетки (binucleated cells). У птиц эритроциты в норме содержат одно ядро. Однако некоторые процессы могут приводить к появлению в крови двуядерных эритроцитов. В более редких случаях могут быть выявлены клетки с тремя и даже четырьмя ядрами. Обнаружение таких клеток рассматривают как проявление патологии.
Двуядерной клеткой принято считать клетку, содержащую два ядра, изолированных друг от друга слоем цитоплазмы и размер которых приблизительно равен размеру ядер в нормальных одноядерных клетках (рис., 5). Основным критерием отличия двуядерной клетки от клеток с другими парными хроматиновыми структурами является их размер. Величина ядер в двуядерной клетке должна быть близкой размерам ядра в нормальных клетках. Если размеры обоих хроматиновых тел или хотя бы одного из них заметно меньше размера нормального ядра, то такая аномалия должна быть отнесена к другому типу аномальных ядер (или лопастным, или почкующимся).
Двуядерные клетки могут образовываться в результате полиплоидизирующего митоза, заканчивающегося без цитотомии [22, 23]. Другим возможным механизмом возникновения двуядерных клеток считают амитоз -прямое деление ядра путём его перешнуровки, без формирования митотического веретена, характерного для митоза. При инфекционных заболеваниях у человека в уротелиальном эпителии обнаружены двуядерные клетки, что позволило предположить возможность их возникновения в результате слияния одноядерных клеток под влиянием вирусов [24]. У птиц такие процессы пока не изучены.
Ряд авторов [21, 25, 26] помимо клеток с изолированными ядрами, к двуядерным клеткам относили и такие, в которых были обнаружены два контактирующих ядра одинаковых размеров и окраски (рис., 6). Теоретически возможно возникновение в клетке двух ядер с изолированными друг от друга
оболочками, и расположенными настолько близко другу к другу, что в световой микроскоп изолирующий их слой цитоплазмы не просматривается. Однако до тех пор, пока не доказано единство природы этих двух типов ядерных структур, целесообразнее их учитывать раздельно.
Возможно обнаружение ещё одной аномальной структуры, которая возникает в результате образования в клетке одной или нескольких дицентрических хромосом, центромеры которых разошлись к разным полюсам. Если в такой клетке образовались два ядра, но цитокенез запаздывает или же не происходит вовсе, то такая хромосома (или, реже, несколько хромосом) образуют между дочерними ядрами мост. Образовавшаяся структура очень напоминает гантель (рис., 7).
Вероятно, ещё одним вариантом предыдущей аномалии может быть структура, образованная двумя ядрами соединённым в виде «восьмёрки». Отличием этой ядерной аномалии от предыдущей является то, что хроматидный мост оказывается не за пределами дочерних ядер, обособленных оболочкой, а внутри каждого из них, причём оболочки этих ядер образуют конусы, сходящиеся вершинами (рис., 8).
Возможно, что в результате последующего разрыва хроматид дицентрических хромосом и цитокинеза образуются два «хвостатых» ядра, описание которых дано ниже. Однако «восьмёрки» могут представлять собой не полностью завершённый амитоз, механизм которого отличен от механизма возникновения «гантелей». Поэтому, до выяснения природы и механизмов образования аномалий, условно называемых «восьмёрками» мы предлагаем их учитывать отдельно от аномалий в виде «гантели». В будущем, когда механизмы их возникновения будут поняты и доказаны, сравнительный анализ частот этих аномалий можно будет проводить, либо учитывая их частоты раздельно, либо суммируя.
Таким образом, для определения обнаруженной аномалии как двуядерной клетки, она должна соответствовать следующим критериям. 1) Размеры обоих ядер в клетке должны быть одинаковы. Размер каждого из них близок размеру ядра в нормальной клетке. Эти признаки указывают на наличие в этих ядрах полных (или почти полных) наборов хромосом. Если оба ядра, или одно из них существенно меньше нормального ядра, то обнаруженная аномалия должна быть отнесена к другому типу (лопастным ядрам или почкующимся ядрам). 2) Оба ядра, отделены друг от друга хорошо видимым слоем цитоплазмы (изолированные ядра). 3) Оба ядра расположены так, что их оболочки примыкают друг к другу, но без явного объединения кариоплазмы (примыкающие ядра). Если в будущем будет доказано их единство с изолированными ядрами, аналитикам достаточно будет объединить частоты этих двух подтипов. В противном случае (если их природа окажется различной), аналитикам будут доступны значения частот каждой из этих аномалий отдельно. 4) Двуядерные клетки с ядрами -«гантелями». Ядра соединены между собой хроматиновым мостом. 5) Двуядерные клетки с ядрами - «восьмёрками». Оба таких ядра имеют конусообразные «выросты», вершины которых соприкасаются.
4. Двулопастное ядро (bilobed nucleus) - это ядро с перетяжкой, делящей его на две приблизительно равные доли (рис., 9). Ширина ядра в области перетяжки составляет 0,3-0,5 длины малой оси эллиптического ядра [2]. Лопасти могут несколько различаться размерами (площадью), но размер меньшей лопасти не должен быть менее 1/3 размера нормального ядра. Отличительной особенностью клетки с двулопастным ядром, позволяющей дифференцировать её от двуядерной клетки, является суммарный размер обеих лопастей. Величина
двулопастного ядра должна быть приблизительно равна величине нормального ядра и не должна превышать её.
Возможной причиной появления двулопастных ядер может быть амитотическое деление клетки, зафиксированное на начальных этапах этого процесса. Помимо амитоза возможной причиной формирования подобных структур называют расхождение к разным полюсам веретена деления центромер дицентрических и кольцевых хромосом, возникших в клетке перед кариокинезом [16]. Другой возможной причиной возникновения двухлопастных ядер может быть сильное повреждение веретена деления, приводящее к незавершённому митозу, сопровождаемое при этом нарушением ещё и кариотомии [3]. Таким образом, механизмы образования двухлопастных ядер недостаточно ясен. Тем не менее, двулопастные ядра могут служить маркёром геномной нестабильности потому, что установлены корреляции частот их образования с интенсивностью воздействия мутагенных факторов [16].
Двулопастному ядру было дано много других названий. Ядра, сходные по морфологии с двулопастным в одних работах называли сегментированными ядрами (segmented nuclei) [27], в других - гантелевидными ядрами [16]. В ряде работ эту ядерную аномалию называют «ядрами с насечкой» [28]. В одной из обзорных работ, посвящённых ядерным аномалиям в клетках буккального эпителия человека, был предложен термин «сдвоенные ядра» [3]. По мнению этого автора, такой термин «отражает наличие в клетке двух ядер и, характеризует их как соединённые друг с другом». Однако если одним из механизмов возникновения таких ядер окажется амитоз, то более подходящим термином для них окажется «раздвоенные ядра». По-видимому, из-за трудностей идентификации клеток с двумя примыкающими ядрами и двулопастных клеток, такие ядра объединяли в одну группу с двулопастными и назвали её группой «bi-lobed/bi-nucleated erythrocyte» [29]. Учитывая неясности механизмов возникновения подобных ядерных аномалий, мы предлагаем использовать термин «двулопастные ядра», как наиболее точно отражающий морфологическую особенность аномалии при сохраняющейся неопределённости механизма их возникновения. При этом ещё раз подчеркнём, что критерием отличия клеток с одним двулопастным ядром от двуядерных клеток, по-видимому, должен быть размер этих парных структур. В двуядерных клетках каждая из парных структур должна иметь размер близкий к размеру нормального ядра в одноядерной клетке. Если размеры каждой из парных структур равны половине нормального ядра, то эту парную структуру следует отнести к двулопастным ядрам. В двулопастном ядре одна из лопастей может быть меньше другой. Но размер малой лопасти не должен быть меньше 1/3 размера нормального ядра. Если же размер малой хроматиновой структуры меньше 1/3 нормального ядра, то её следует отнести, в зависимости от морфологии, либо к почкующемуся ядру, либо к лопастному ядру.
Таким образом, обнаруженная аномальное ядро должно будет отнесено к двулопастному ядру, если оно имеет характерную перетяжку, делящую его на две приблизительно равные доли и сужающую его в этой области на 0,3-0,5 длины малой оси эллиптического ядра,
5. Лопастное ядро (lobed nucleus) - это ядро с обособленным фрагментом гетерохроматина, сохранившим с ядром частичный контакт. Величина фрагмента может составлять от 1/3 до 1/2 величины нормального ядра. Степень контакта хроматинового фрагмента с ядром может варьировать от лишь частичного выпячивания хроматина, отделённого от основной его ядерной массы перетяжкой (рис., 10), до почти полной изоляции и сохранении контакта лишь в виде хроматинового моста различной ширины (рис., 11). В ранее опубликованных работах такие структуры также называли протрузиями типа
«разбитое яйцо» и ядерными почками. Однако такие фрагменты не могут быть отнесены к ядерным почкам, т.к. по определению почка - это структура, размером от 1/16 до 1/3 размера основного ядра. Понятие же «протрузия» в цитопатологии имеет столь широкий смысл, что использовать его для конкретной аномалии ядра, по-видимому, нецелесообразно. Для аномалий такого типа предлагается сохранить термин «лопасть» и лопастными ядрами называть только те из аномалий, которые представляют собой фрагменты материала ядра величиной от 1/3 до 1/2 размера основного ядра.
6. Почкующимися ядрами (budding nucleus) называют ядра, имеющие характерные выпячивания ядерной оболочки, заполненные хроматином, сохраняющим тесную связь с хроматином ядра (рис., 12). Размеры таких выпячиваний могут варьировать от 1/20 до 1/3 размера нормального ядра. Выпячивание ядерной оболочки может располагаться в любой части ядра, в том числе на его острых вершинах. В последнем случае, как указывает Л.П. Сычева [3], почкующиеся ядра морфологически очень сходны с описанными в литературе [30] ядерными протрузиями типа «разбитое яйцо». Однако в отличие от ядерных почек, хроматин которых составляет единое целое с хроматином ядра, аномалии типа «разбитое яйцо» имеют характерную особенность - они или полностью отделены от ядра слоем цитоплазмы или связаны с ним тонким кариоплазматическим мостом. От лопастных ядер с примыкающей лопастью (величина которых 0,34-0,5 величины нормального ядра) почкующиеся ядра отличаются меньшими размерами (1/20-1/3).
В некоторых работах с целью облегчения подсчёта аномалий ядерные почки и протрузии типа «разбитое яйцо» классифицированы вместе в единую категорию [7]. Мы сочли такое объединение невозможным по той причине, что содержимое ядерных почек имеет обширный контакт с материалом ядра, в то время как протрузии, называемые «разбитым яйцом», практически изолированы ядерными мембранами и слоем цитоплазы от основного ядра и их контакт с основным ядром осуществляется только посредством тонкого кариоплазматического моста. В предлагаемой здесь классификации ядерная аномалия (протрузия) типа «разбитое яйцо», в зависимости от размеров «отбитого» фрагмента должна быть отнесена либо к клеткам с лопастным ядром, либо к двуядерным.
Ядерные почки относят к чувствительным маркерам хромосомной нестабильности. Было установлено, что эти ядерные аномалии по своему происхождению несколько отличаются от микроядер. Если в микроядрах находится преимущественно ДНК с теломерными и теломерно-центромерными участками, то в ядерных «почках» эти участки хромосом не были обнаружены [31]. О содержимом ядерных почек пока нет единого мнения. Первоначально предполагали, что ядерные почки являются участками амплифицированной ДНК, обособленными по периферии ядра [32]. Позже результаты исследований привели к заключению, что в отличие от микроядер, которые могут содержать и ацентрические фрагменты хромосом, и целые хромосомы, ядерные почки содержат только фрагменты хромосом, но никогда не содержат целые хромосомы [16]. Вместе с тем, в работе [33] было показано, что ядерные почки могут содержать любую хромосому кариотипа.
Полагают, что образование почкующихся ядер связано с амплификацией определённой части генома. Кроме того, установлено, что из таких ядерных почек при воздействии на клетку гамма-излучения часто могут образовываться микроядра [32]. Выдвинуто предположение о существовании противоположно направленного процесса - для предотвращения анеуплоидии ядерная оболочка способна «улавливать» ДНК, оказавшуюся в цитоплазме [31].
Для учёта клеток с почкующимися ядрами могут быть предложены следующие критерии. 1) Клеточное ядро имеет сужение, благодаря которому формируется почка из ядерного материала. 2) Ядерная почка имеет непосредственный контакт с гетерохроматином ядра, протяжённость которого может составлять до 1/3 малой оси ядра. Это является основным признаком, отличающим ядерную почку от примыкающего микроядра. 3) Размеры ядерной почки могут быть различными - от 1/16 до 1/3 проекционной площади ядра, [2, 34]. Аномалия ядра, при которой размер выпячивания более 1/3 (и до 1/2) размера основного ядра должна быть отнесена к другому типу - к лопастным ядрам. 4) Почки имеют интенсивность окраски сравнимую с интенсивностью окраски основного ядра,
7. Пузырящиеся ядра в эритроцитах. При сильных генотоксических воздействиях на птиц в их эритроцитах могут быть обнаружены ядерные аномалии, названные blebbed nuclei - «пузырящимися ядрами» (рис., 13). Аномалия представляет собой ядро, часть мембраны которого имеет множественные мелкие выпячивания внешне сходными с маленькми «почками» или с пузырями, образующимися на поверхности жидкости. P. Clark [29] аналогичные ядерные аномалии, назвал «эритроцитами с микролопастными ядрами (erythrocyte with a micro-lobed nucleus). Механизм образования пузырящихся ядер, по-видимому, тот же, что и в случае почкующихся ядер, но происходящий во многих участках хроматина. По этой причине пузырящиеся ядра можно было бы рассматривать как частный случай почкующегося ядра, имеющего большое количество (3 и более) мелких почек. Однако термин «пузырящиеся ядра» используется большинством исследователей, обнаруживших это явление и, поэтому отказ от его использования был бы не рационален. В связи с этим предлагаются следующие критерии для учёта пузырящихся ядер: а) большое количество (3 и более) мелких выпячиваний кариолеммы; б) размер выпячиваний - до 0,2 длины малой оси эллипсовидного ядра.
8. Хвостатые ядра (tailed nucleus) - это ядра, имеющие нитевидный отросток из хроматина (рис., 14), а также ядра, один край которых резко сужен и вытянут в виде клювовидного отростка (рис., 15) [2, 35]. Возникновение в интерфазе хвостатых ядер объясняют образованием дицентрических хромосом, которые можно было бы наблюдать в предшествующей метафазе. Если во время анафазы центромеры такого дицентрика расходятся к разным полюсам, то эта хромосома образует хроматиновый мост между двумя ядрами. Разрыв этого моста приводит к образованию нитевидного отростка. Если же ядерные оболочки формируются не только вокруг дочерних ядер, но и охватывают соединяющий их мост, то образуются ядра - «восьмёрки», а последующий цитокинез, сопровождаемый разрывом моста, приводит к образованию двух клеток с ядрами, имеющими «хвост» в форме клювовидного отростка [2]. Установлена значительная корреляция частот «хвостатых» ядер с частотой формирования хроматиновых мостов в двуядерных клетках, что доказывает происхождение хвостатых ядер в результате разрыва мостов в процессе карио- и цитокинеза. В медицине оценка частоты лимфоцитов с «хвостатыми» ядрами предложена как экспресс-метод выявления людей, подвергшихся радиационному облучению [35]. Таким образом, аномальное ядро должно быть отнесено к категории «хвостатых» если оно имеет клювовидный или нитевидный отросток, длина которого составляет 1/4-1/3 длины большой оси ядра.
9. Зазубренное ядро (notched nucleus) - это ядро, имеющее клинообразную инвагинацию ядерной оболочки (рис., 16). У птиц эту аномалию в эритроцитах называли ядром с обрезанными краями, ядром с выемкой (emarginated nucleus) или выемчатым ядром и определяли как ядро, «имеющее чёткую видимую выемку, края которой не соприкасаются, приблизительно до
середины большой оси» [2, 36] Однако, в работах, анализирующих ядерные нарушения в эритроцитах рыб, такие ядра были описаны значительно раньше, чем у птиц [37] и названы «зазубренными» (notched), или «надрезанными». Позже критерии идентификации зазубренных (выемчатых) ядер у рыб были использованы при выявлении подобных аномалий в эритроцитах птиц. Полагают, что надрезы не содержат ядерного материала и разграничены ядерной оболочкой [26]. Термин «зазубренное ядро» нам представляется более точным, чем «выемчатое», так как выемчатость предполагает удаление части хроматинового материала, в то время как зазубренность указывает на частичное нарушение нормального, равномерного распределения хроматина в ядре. Объяснения причин и механизмов образования эритроцитов с зазубренными (выемчатыми) ядрами пока не получены. Таким образом, при анализе ядерных аномалий критерием зазубренного ядра является наличие на одной из его сторон клинообразной инвагинации ядерной оболочки, создающей свободную от хроматина неокрашенную область, заполненную цитоплазмой.
10. Ядра со впадиной (nuclei with cavity) в некоторых работах были выделены как самостоятельный тип аномалий морфологии ядра эритроцитов (рис., 17) [38]. Можно предположить, что ядра со впадиной являются одним из крайних проявлений аномалии «ядро с зазубриной», но до появления доказательств единства этих двух аномалий их следует учитывать отдельно.
11. Почковидные ядра (kidney-shaped nuclei) в эритроцитах (рис., 18) обнаружены у некоторых видов птиц [38]. Поскольку ранее подобная аномалия была обнаружена у рыб, подвергнутых экспериментальным воздействиям растворов солей тяжёлых металлов, возможно, что у птиц эти изменения также могут коррелировать с интенсивностью воздействия вредоносных факторов. До выяснения причин возникновения и диагностической ценности этой морфологической аномалии ядра предлагается её частоту также фиксировать в протоколах.
12. Вакуолизированное ядро (vacuolated nucleus). Ядра нормальных эритроцитов обычно равномерно заполнены гетерохроматином. При интенсивных генотоксических воздействиях на организм и при онкологических заболеваниях в ядрах некоторых клеток равномерное распределение хроматина нарушается и внутри ядра образуются вакуоли, заполненные кариоплазмой (рис., 19). При этом ядро может несколько увеличиваться в размерах («разбухать»), но структура и интенсивность окрашивания хроматина сохраняются такими же, как и в нормальных ядрах. Эту особенность клеток было предложено учитывать при анализе ядерных аномалий в буккальном эпителии человека [3]. Вероятно, будет целесообразным проанализировать частоты вакуолизированных ядер и в эритроцитах птиц. При возникновении вакуолей в ядре возможно их появление и в цитоплазме.
Вакуолизированное ядро необходимо отличать от ядра с конденсацией хроматина при кариопикнозе. В последнем случае в ядре также образуются светло окрашенные полости, разделяющие глыбки и тяжи хроматина. Однако ядро не «разбухает», а, наоборот сморщивается, а хроматин становится более темным и плотным [3].
Таким образом, критериями для выявления этой аномалии ядер предложены следующие признаки: 1) ядерная вакуоль имеет округлую форму и чёткие границы; 2) размер ядра с вакуолью не меньше, или несколько больше размеров нормальных ядер (ядро выглядит «разбухшим»); 3) структура и окраска хроматина приблизительно соответствует хроматину нормальных ядер или может быть гомогеннее и бледнее.
13. Перинукпеарные вакуоли (perinuclear vacuoles). Помимо эритроцитов с внутриядерной вакуолью в мазках крови возможно обнаружение клеток с перинуклеарной вакуолью - находящейся около ядра областью цитоплазмы, имеющей округлую форму с чёткими границами и меньшую интенсивность окраски (рис., 20). Появление перинуклеарной вакуоли вызывает смещение хроматина. Иногда граница перинуклеарной вакуоли имеет размытые контуры. Перинуклеарная вакуоль может образоваться и как полость в межмембранном пространстве ядерной оболочки. Полагают, что перинуклеарные вакуоли являются одним из симптомов ранних этапов разрушения ядра. Поскольку доказано увеличение частоты клеток с перинуклеарными вакуолями в буккальном эпителии после воздействия химических веществ и радиации [3, 39], то учёт перинуклеарных вакуолей в эритроцитах птиц также может быть целесообразен при изучении частот ядерных аномалий, индуцируемых химическими веществами, радиацией и биологическими патогенами.
Важными признаками вредоносного действия какого-либо фактора на организм птиц являются клетки с деструктивными изменениями внутриклеточных органелл. Разрушение клеток крови у птиц происходит во многих органах, но в особенно большом количестве - в печени и селезёнке. Однако при сильных генотоксических воздействиях, иммунных, онкологических и инфекционных заболеваниях в периферической крови могут быть обнаружены эритроциты на различных стадиях некробиоза. Мы обнаруживали такие эритроциты в мазках крови индюков с очень сильно выраженными симптомами гиповитаминоза. При некробиозе нарушается обмен веществ в клетке, и происходят изменения клеточного ядра в виде кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса.
14. Кариопикноз (karyopyknosis) - это явление дегенеративного изменения ядра, сопровождаемое уменьшением его размера и повышением оптической плотности ядерного материала в результате сильной и необратимой конденсации хроматина (рис., 21). Размеры пикнотического ядра обычно составляют от одной до двух третей ядра нормальных клеток.
При кариопикнозе в ядре преобладает активность ферментов конденсации по сравнению с активностью нуклеаз. В результате хроматин сильно уплотняется, а ядро становится тёмноокрашенным, бесструктурным, гомогенным и значительно уменьшается в размере [3, 7, 40]. В некоторых публикациях конденсация хроматина выделена в самостоятельный тип ядерной аномалии, однако большинство методических работ указывает на то, что это явление следует рассматривать лишь как одну их характеристик кариопиноза. Его биологическое значение всё ещё остаётся неизвестным, но большинство исследователей придерживаются мнения, что клетки с пикнотическими ядрами являются погибающими клетками. Полагают, что кариопикноз предшествует кариорексису и связан с начальным этапом апоптоза клетки [10, 41].
15. Кариорексис (karyorrhexis) - это процесс распада клеточного ядра на части. Он является одним из промежуточных этапов некробиоза и происходит после кариопикноза, предшествуя кариолизису. При кариорексисе хроматин начинает разделяться на глыбки и тяжи, расстояние между которыми постепенно увеличивается. При сохранении ядерной оболочки происходит дальнейший распад хроматинового материала ядра на отдельные фрагменты различного размера (рис., 22). Это приводит к формированию не связанных между собой округлых, бесструктурных глыбок. При этом размер ядра не изменяется. После разрушения ядерной оболочки они попадают в цитоплазму и подвергаются лизису. Визуально в цитоплазме клетки, находящейся в состоянии кариорексиса, находятся несколько крупных или большое количество мелких, плотных и интенсивно окрашенными фрагментов ядра. Такие клетки не рекомендуют
анализировать на присутствие в них микроядер или ядерных почек т.к. на этой стадии происходит фрагментация ядра и образование ядерных фрагментов, морфологически сходных с микроядрами и ядерными почками [3, 7, 10, 40, 42].
16. Кариолизис (karyolysis) - это процесс растворения в цитоплазме фрагментов клеточного ядра, распавшегося в результате кариорексиса. Кариолизис является завершающим этапом некробиоза, наступающего после кариопикноза и кариорексиса. При кариолизисе ядро клетки утрачивает чёткие контуры. Гетерохроматин ядра приобретает гомогенную структуру и окрашивается очень слабо [3, 40, 42]. У млекопитающих может происходить внутрисосудистый лизис эритроцитов в циркулирующей крови и костном мозге, причём цитолитической функцией обладают даже кроветворные клетки (а именно: эритро- и нормобласты и мегакариоциты), которые не относят к иммунной системе. Полагают, что эта способность является потенциальной и реализуется лишь в критических для организма ситуациях [43]. Указаний на существование такого явления у птиц мы в литературе не обнаружили и, вероятно, это может стать предметом специальных исследований.
Помимо аномалий морфологии ядер некоторые авторы отмечают аномалии морфологии самих клеток. Наиболее часто отмечают эритроциты с ядром, смещённым от центра клетки к её периферии и безъядерные эритроциты.
17. Эритроциты с ядром, смещённым из центра к его периферии (erythrocytes with the nucleus displaced to the cell periphery) были описаны у кур (рис., 24) [44]. Биологическое значение такого перемещения ядра в эритроцитах не ясно. Возможно, оно является следствием нарушения метаболических процессов в клетке. Сравнительный анализ частот возникновения эритроцитов со смещённым ядром у птиц с различной этиологией или экспериментально подвергнутых действию различных генотоксичных факторов, позволит установить информационную ценность этой аномалии.
18. Безядерные эритроциты (non-nucleated erythrocytes) изредка встречаются в периферической крови птиц [45, с.136]. При патологических состояниях их частоты могут изменяться и поэтому эту аномалию целесообразно тоже регистрировать.
Детальные характеристики возможных вариантов описанных ядерных аномалий, иллюстрируемые фотографиями, а также шаблон протокола для выполнения анализа аномалий приведены в [46].
Индексы и коэффициенты, характеризующие цитогенетические аномалии в клетках
Для характеристики степени вытянутости ядра в эритроцитах птиц был предложен индекс удлинённости ядра, представляющий собой отношение длины большой оси эллиптического ядра к длине малой его оси. Предполагается, что этот индекс может быть информативен при характеристике вредных воздействий на птиц определённых внешних факторов.
Для характеристики цитогенетического статуса организмов, находившихся под влиянием экспериментального или средового фактора, использовали частоты каждой ядерной аномалии отдельно, а также суммарную частоту всех выявленных ядерных аномалий. В работах [3, 4] был предложен интегральный цитогенетический показатель, за который принимали суммарную частоту клеток с микроядрами, протрузиями и мостами. Поскольку протрузия - собирательный термин, включающий в себя «ДНК-содержащие образования, расположенные вне ядра, шаровидной, нитевидной или иной формы, чётко отграниченные от ядра и соединяющиеся с ним перемычкой» [3], то при использовании нашей
классификации аномалий интегральный цитогенетический показатель будет равен сумме частот всех клеток с микроядрами, двуядерных клеток (кроме клеток с изолированными ядрами), лопастных, двулопастных, почкующихся и пузырящихся ядер. В интегральный цитогенетический показатель не включают частоты клеток с зазубренными и вакуолизированными ядрами, с перинуклеарной вакуолью а также частоты клеток в состояниях кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса.
В 2012 г. был предложен ещё один показатель - индекс накопления цитогенетических нарушений (index of accumulation of cytogenetic damage, Iac), учитывающий показатели клеточной кинетики. К этому времени было установлено, что интенсификация апоптоза ведёт к снижению частоты клеток с цитогенетическими нарушениями. В то же время полагали, что активизация пролиферации тормозит процессы репарации и способствует образованию клеток с цитогенетическими нарушениями. Учитывая оба эти процесса, было предложено «определять Iac как произведение интегрального показателя цитогенетических нарушений (суммы клеток с микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами в промилле Ic - cytogenetic index) и интегрального показателя пролиферации (суммы клеток с двумя и более ядрами в промилле Ip - index of proliferation), деленное на апоптический индекс (сумму всех клеток в апоптозе в промилле Iapop - apoptotic index), т.е. Iac= (Ic x Ip / Iapop) x 100. В том случае, когда цитогенетические нарушения или двуядерные клетки не выявлены, нулевое значение изменяют на единицу» [4]. В исследованиях ядерных аномалий в эритроцитах птиц эти индексы до настоящего времени не использовали, но возможно, что их применение и сравнительный анализ будут полезны для понимания интенсивности мутационных процессов в природных популяциях, а также при экспериментальном анализе мутагенности физических и химических факторов для птиц.
Заключение. Относительная простота анализа ядерных аномалий в клетках животных и широкий спектр морфологических проявлений этих аномалий привели к образованию большого количества их наименований. При этом часто для обозначения аномалий явно различающейся природы использовали одни и те же термины и, наоборот, одинаковые аномалии именовали различно. Эта ситуация особенно заметна при сравнении публикаций авторов, каждый из которых специализируется на исследованиях ядерных аномалий у животных одного класса (например рыб или птиц). Однако даже в рамках одного класса животных критерии выявляемых ядерных аномалий и терминология, используемые разными авторами, могут сильно различаться. Это создаёт трудности для сравнительного анализа результатов, полученных разными авторами, и значительно снижает их информационную ценность.
Вместе с тем, поскольку механизмы возникновения одних и тех же аномалий в клетках всех животных, вероятно, одинаковы, то и терминология, и критерии их учёта должны быть одинаковы для всех типов клеток во всех классах животных.
В данной работе для практического анализа предложена классификация ядерных аномалий в эритроцитах птиц. Она позволяет дифференцировать ядерные аномалии по пяти размерным классам (>0,1; 0,1 -0,2; 0,21-0,33, 0,34-0,5, 0,51 -1,0). При этом возможно определение частных и суммарных частот хроматиновых фрагментов, полностью отделившихся от основного ядра, примыкающих к ядру, связанных с ядром хроматиновыми мостами, а также морфологических структур, хроматин которых не отделён от хроматина основного ядра.
Поскольку сведения о разнообразии ядерных аномалий и механизмах их возникновения будут расширяться, классификация этих аномалий также потребует усовершенствования и оптимизации терминологии. Возможно появление новых названий таких аномалий. В таких случаях каждое новое наименование
выявленной ядерной аномалии необходимо сопровождать чётким определением, в котором должны быть указаны морфологические особенности, максимальный и минимальный размеры, визуальная характеристика хроматина и принципиальные отличия нового описываемого типа аномалии от уже известных и описанных.
Установлено, что уровень мутагенеза соматических клеток в тканях разных типов может быть различен. Специальные исследования, проведённые на лабораторных грызунах, позволили установить существенные различия в частотах цитогенетических нарушений, индуцируемых различными мутагенами и канцерогенами в клетках разных органов одного и того же организма. Это послужило основанием для разработки полиорганного микроядерного теста для человека [47]. Сведения о частотах ядерных аномалий в клетках различных тканей у сельскохозяйственной птицы отсутствуют и выполнение таких исследований весьма целесообразно.
Важным вопросом остаётся чувствительность микроядерного теста при анализе воздействия на птиц каких-либо мутагенных или канцерогенных факторов. Для выяснения этого вопроса необходимо проведение лабораторных экспериментов с модельными мутагенами (канцерогенами), индуцирующими различные механизмы мутагенеза.
Публикации о результатах тестирования ядерных аномалий обычно не содержат детальной информации о морфологии редких и трудно поддающихся описанию и объяснению аномалий. Однако информация о них представляет особую ценность для понимания многообразия аномалий и механизмов их образования. Публикация фотографий и анализ таких данных позволит совершенствовать систему типов аномалий, что упростит и, безусловно, интенсифицирует исследования по спонтанному и индуцированному мутагенезу у диких и сельскохозяйственных птиц.
Предложенный вариант учёта микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах птиц может быть полезен для скрининга состояния здоровья птиц в птицеводческих хозяйствах и мониторинга изменений в природных экосистемах. Методика может быть использована для учёта ядерных аномалий других животных, эритроциты которых содержат ядра - рыб, амфибий и пресмыкающихся.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. The Micronucleus Assay in Toxicology. Issues in Toxicology No. 39. Eds.: Michael Fenech, Siegfried Knasmüller. Croydon: CPI Group (UK) Ltd, 2019. 657 p.
2. Цитогенетические параметры нестабильности генома птиц в эколого-генетическом мониторинге / М.А. Курса [и др.] // Проблеми безпеки атомних електростанцм i Чорнобиля. Выпуск 3, Часть 2. Киев, 2005. С. 92-98.
3. Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кариологических показателей при оценке цитогенетического статуса человека // Медицинская генетика. 2007. № 11. С. 3-11.
4. Сычева Л.П. Цитогенетический мониторинг для оценки безопасности среды обитания человека // Гигиена и санитария. 2012. № 6. С. 68-72.
5. Ильинских Н., Васильев С., В Кравцов. Микроядерный тест в скрининге и мониторинге мутагенов. Рига: LAMBERT Academic Publishing. 2011. 524 с.
6. Калаев В.Н., Нечаева М.С., Калаева Е.А. Микроядерный тест буккального эпителия ротовой полости человека: монография. Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2016. 136 с.
7. Potential Uses, Limitations, and Basic Procedures of Micronuclei and Nuclear Abnormalities in Buccal Cells / O. Torres-Bugarín, M.G. Zavala-Cerna, A. Nava, et al. // Disease Markers. 2014. Vol. 2014, 13 p.
8. Крюков В.И. Частоты ядерных аномалий в эритроцитах периферической крови клинически здоровых индеек (Meleagris gallopavo) в возрасте 6 и 17 недель // Вестник аграрной науки. 2019. № 5(80). С. 84-93.
9. Koss' diagnostic cytology and its histopathologic bases. 5th ed. / ed. by Leopold G. Koss. Philadelphia, Pa.; London: Lippincott Williams & Wilkins, 2006. 3276 p.
10. The HUMNxl scoring criteria for different cell types and nuclear anomalies in the buccal micronucleus cytome assay / Claudia Bolognesi et al. // Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 2013. Vol. 753. Issue 2. P. 100-113.
11. Микроядра как маркеры хромосомных изменений клеток / И.Б. Бродский [и др.] // Журнал фундаментальной медицины и биологии. 2012. № 1. С. 4-9.
12. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei / E.M. Hatch et al. // Cell. 2013. Vol. 154. № 1. P. 47-60.
13. Schmid W. The micronucleus test for cytogenetic analysis. // Chemical mutagens. 1976. Vol. 4. P. 31-52.
14. Fenech M. The in vitro micronucleus technique // Mutation Research. 2000. Vol. 455. P. 81-95.
15. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay // Nature Protocols. 2007. Vol. 2. № 5. P. 1084-1104.
16. Анбумани С., Ливанова A.A., Федорцева Р.Ф. Ядерные аномалии соматических клеток как универсальные индикаторы воздействия ионизирующего излучения // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2017. № 2. С. 66-75.
17. Жулева Л.Ю., Дубинин Н.П. Использование микроядерного теста для оценки экологической обстановки в районах Астраханской области // Экология. 1994. Т. 30. № 7. С. 999-1004.
18. Richard F., Muleris M., Dutrillaux B. The frequency of micronuclei with X chromosome increases with age in human females // Mutation Research. 1994. Vol. 316. P. 1-7.
19. FISH detection of chromosome 1 aberration in human interphase and metaphase lymphocytes after exposure to benzene / B. Holeckova et al. // Ann. Agric. Environ. Med. 2008. Vol. 15. № 1. P. 99-103.
20. Ковалева O.A., Безденежных H.A., Кудрявец Ю.И. Нехромосомный цитогенетический анализ соматических клеток млекопитающих // Biopolymers and Cell. 2013. Vol. 29. № 1. С. 33-41.
21. Tolbert P.E., Shy C.M., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development // Mutat. Res. 1992. Vol. 271. № 1. P. 69-77.
22. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука. 1981. 237 с.
23. Ковалева O.A. Цитогенетические аномалии в соматических клетках млекопитающих // Цитология и генетика. 2008. № 1. С. 58-72.
24. Micronucleus frequencies in exfoliated buccal cells in normal mucosa, precancerous lesions and squamous cell carcinoma. / G. Casartelli et al. // Anal Quant Cytol Histol. 2000. Vol. 22. № 6. P. 486-492.
25. Buccal micronucleus cytome assay. / P. Thomas et al. // Nat. Protoc. 2009. Vol. 4. P. 825-837. DOI: 10.1038/nprot.2009.53.
26. Erythrocyte micronucleus cytome assay of 17 wild bird species from the central Monte desert, Argentina / A.A.M. Quero et al. // Environmental Science and Pollution Research. 2016. Vol. 23. № 24. P. 25224-25231. DOI: 10.1007/s11356-016-7638-5.
27. Santos C.S.A. Biomonitorization of birds under recovery: a long term study // Dissertafäo apresentada a Universidade de Aveiro para obten?ao do grau de Mestre em Biologia Aplicada. Universidade de Aveiro (Portugal), Departamento de Biologia. 2012. 89 p.
28. Юрченко B.B. Цитогенетические нарушения в эпителии щеки человека при экспозиции генотоксикантами // Токсикол. вести. 2005. № 6. С. 14-21.
29. Clark P. Assessment of avian erythrocytes that exhibit variant nuclear morphology // Comparative Clinical Pathology. 2015. Vol. 24. № 3. P. 485-490.
30. Tolbert P.E., Shy C.M., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: a field test in snuff users // Am. J. Epidemiol. 1991. Vol. 134. № 8. P. 840-850. DOI: 10.1093/oxfordjournals.aje.a116159.
31. Origin of nuclear buds and micronuclei in normal and folate-deprived human lymphocytes. / H.K. Lindberg et al. // Mutat Res. 2007. Vol. 617. № 1-2. P. 33-45. DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2006.12.002.
32. Selective entrapment of extrachromosomally amplified DNA by nuclear budding and micronucleation during S phase / N. Shimizu et al. // The Journal of cell biology. 1998. Vol. 140. № 6. P. 1307-1320.
33. Nuclear Bud Formation: A Novel Manifestation of Zidovudine Genotoxicity / A. Dutra et al. // Cytogenet. Genome Res. 2010. Vol. 128. № 1-3. P. 105-110. DOI: 10.1159/000298794/
34. Radiation-induced acute immediate nuclear abnormalities in oral cancer cells: serial cytologic evaluation. / N.V. Bhattathiri et al. // Acta Cytol. 1998. Vol. 42. № 5. P. 1084-1090.
35. Пат. 2141658 РФ, МПК G01N 33/48. Способ экспресс-выявления облучённых пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций / Кравцов В.Ю., Федорцева Р.Ф., Старкова Е.В. [и др.]. № 97120394/14; заявл. 20.11.1997; опубл. 20.11.1999. Бюл. 32.
36. The physiological and genetic differences between flycatchers (Ficedula albicollis vs. Ficedula hypoleuca) / M. Drahulian et al. // Folia Oecologica. 2018. Vol. 45. № 2. P. 111-119.
37. Assessment of the piscine micronuclei test as an in situ biological indicator of chemical contaminants effects / K.R. Carrasco et al. // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1990. Vol. 47. P. 2123-2136. DOI: 10.1139/f90-237.
38. Erythrocytic abnormalities in three antarctic penguin species along the Antarctic Peninsula: biomonitoring of genomic damage. / E. De Mas et al. // Polar Biology. 2015. Vol. 38. № 7. P. 1067-1074.
39. Rieber M., Rieber M.S. Sensitization to radiationinduced DNA damage accelerates loss of bcl-2 and increases apoptosis and autophagy. // Cancer Biology & Therapy. 2008. Vol. 7. № 10. P. 1561-1566. DOI: 10.4161/cbt.7.10.6540.
40. Калаев B.H., Артюхов В.Г., Нечаева М.С. Микроядерный тест буккального эпителия ротовой полости человека: проблемы, достижения, перспективы // Цитология и генетика. 2014. Т. 48. № 6. С. 62-80.
41. Zamzami N., Kroemer G., Condensed matter in cell death. // Nature. 1999. Vol. 401. № 6749. P. 127-128. DOI: 10.1038/43591.
42. Минеева О.В., Минеев А.К. Нарушения морфологии эритроцитов периферической крови озёрной лягушки Rana ridibunda Pallas, 1771 // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 664-667.
43. Бельченко Д.И. Лизис эритроцитов крови и костного мозга эритробластами и мегакариоцитами. // Аллергология и иммунология. 2003. № 1. С. 65-67.
44. Микроядерный тест на генотоксичность в птицеводстве / И.Н. Яковлева [и др.] // Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения: матер. междунар. научно-производств. конф., Белгород. Часть 1. п. Майский: Изд-во БелГСХА, 2012. С. 140-142.
45. Atlas of Clinical Avian Hematology / Ph. Clark et al. // West Sussex, United Kingdom. A John Wiley & Sons, Ltd., Publication. 2009. VIII+182 p.
46. Микроядерный тест. Атлас микроядер и ядерных аномалий в эритроцитах позвоночных животных. Протокол анализа аномалий ядер эритроцитов // URL: http://labogen.ru/15_mnt/mntest.html (дата обращения: 10.01.2020).
47. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях: монография / Н.Н. Беляева [и др.]; под ред. Ю.А. Рахманина, Л.П. Сычевой. М.: Гениус, 2007. 312 c.
REFERENCES
1. The Micronucleus Assay in Toxicology. Issues in Toxicology No. 39. Eds.: Michael Fenech, Siegfried Knasmuller. Croydon: CPI Group (UK) Ltd, 2019. 657 p.
2. Tsitogeneticheskie parametry nestabilnosti genoma ptits v ekologo-geneticheskom monitoringe / M.A. Kursa [i dr.] // Problemi bezpeki atomnikh elektrostantsiy i Chornobilya. Vypusk 3, Chast 2. Kiev, 2005. S. 92-98.
3. Sycheva L.P. Biologicheskoe znachenie, kriterii opredeleniya i predely varirovaniya polnogo spektra kariologicheskikh pokazateley pri otsenke tsitogeneticheskogo statusa cheloveka // Meditsinskaya genetika. 2007. № 11. S. 3-11.
4. Sycheva L.P. Tsitogeneticheskiy monitoring dlya otsenki bezopasnosti sredy obitaniya cheloveka // Gigiena i sanitariya. 2012. № 6. S. 68-72.
5. Ilinskikh N., Vasilev S., V Kravtsov. Mikroyadernyy test v skrininge i monitoringe mutagenov. Riga: LAMBERT Academic Publishing. 2011. 524 s.
6. Kalaev V.N., Nechaeva M.S., Kalaeva Ye.A. Mikroyadernyy test bukkalnogo epiteliya rotovoy polosti cheloveka: monografiya. Voronezh: Izdatelskiy dom VGU, 2016. 136 s.
7. Potential Uses, Limitations, and Basic Procedures of Micronuclei and Nuclear Abnormalities in Buccal Cells / O. Torres-Bugarin, M.G. Zavala-Cerna, A. Nava, et al. // Disease Markers. 2014. Vol. 2014, 13 p.
8. Kryukov V.I. Chastoty yadernykh anomaliy v eritrotsitakh perifericheskoy krovi klinicheski zdorovykh indeek (Meleagris gallopavo) v vozraste 6 i 17 nedel // Vestnik agrarnoy nauki. 2019. № 5(80). S. 84-93.
9. Koss' diagnostic cytology and its histopathologic bases. 5th ed. / ed. by Leopold G. Koss. Philadelphia, Pa.; London: Lippincott Williams & Wilkins, 2006. 3276 p.
10. The HUMNxl scoring criteria for different cell types and nuclear anomalies in the buccal micronucleus cytome assay / Claudia Bolognesi et al. // Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 2013. Vol. 753. Issue 2. P. 100-113.
11. Mikroyadra kak markery khromosomnykh izmeneniy kletok / I.B. Brodskiy [i dr.] // Zhurnal fundamentalnoy meditsiny i biologii. 2012. № 1. S. 4-9.
12. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei / E.M. Hatch et al. // Cell. 2013. Vol. 154. № 1. P. 47-60.
13. Schmid W. The micronucleus test for cytogenetic analysis. // Chemical mutagens. 1976. Vol. 4. P. 31-52.
14. Fenech M. The in vitro micronucleus technique // Mutation Research. 2000. Vol. 455. P. 81-95.
15. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay // Nature Protocols. 2007. Vol. 2. № 5. P. 1084-1104.
16. Anbumani S., Livanova A.A., Fedortseva R.F. Yadernye anomalii somaticheskikh kletok kak universalnye indikatory vozdeystviya ioniziruyushchego izlucheniya // Mediko-biologicheskie i sotsialno-psikhologicheskie problemy bezopasnosti v chrezvychaynykh situatsiyakh. 2017. № 2. S. 66-75.
17. Zhuleva L.Yu., Dubinin N.P. Ispolzovanie mikroyadernogo testa dlya otsenki ekologicheskoy obstanovki v rayonakh Astrakhanskoy oblasti // Ekologiya. 1994. T. 30. № 7. S. 999-1004.
18. Richard F., Muleris M., Dutrillaux B. The frequency of micronuclei with X chromosome increases with age in human females // Mutation Research. 1994. Vol. 316. P. 1-7.
19. FISH detection of chromosome 1 aberration in human interphase and metaphase lymphocytes after exposure to benzene / B. Holeckova et al. // Ann. Agric. Environ. Med. 2008. Vol. 15. № 1. P. 99-103.
20. Kovaleva O.A., Bezdenezhnykh N.A., Kudryavets Yu.I. Nekhromosomnyy tsitogeneticheskiy analiz somaticheskikh kletok mlekopitayushchikh // Biopolymers and Cell. 2013. Vol. 29. № 1. S. 33-41.
21. Tolbert P.E., Shy C.M., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: methods development // Mutat. Res. 1992. Vol. 271. № 1. P. 69-77.
22. Brodskiy V.Ya., Uryvaeva I.V. Kletochnaya poliploidiya. Proliferatsiya i differentsirovka. M.: Nauka. 1981. 237 s.
23. Kovaleva O.A. Tsitogeneticheskie anomalii v somaticheskikh kletkakh mlekopitayushchikh // Tsitologiya i genetika. 2008. № 1. S. 58-72.
24. Micronucleus frequencies in exfoliated buccal cells in normal mucosa, precancerous lesions and squamous cell carcinoma. / G. Casartelli et al. // Anal Quant Cytol Histol. 2000. Vol. 22. № 6. P. 486-492.
25. Buccal micronucleus cytome assay. / P. Thomas et al. // Nat. Protoc. 2009. Vol. 4. P. 825-837. DOI: 10.1038/nprot.2009.53.
26. Erythrocyte micronucleus cytome assay of 17 wild bird species from the central Monte desert, Argentina / A.A.M. Quero et al. // Environmental Science and Pollution Research. 2016. Vol. 23. № 24. P. 25224-25231. DOI: 10.1007/s11356-016-7638-5.
27. Santos C.S.A. Biomonitorization of birds under recovery: a long term study // Disserta?ao apresentada a Universidade de Aveiro para obten?ao do grau de Mestre em Biologia Aplicada. Universidade de Aveiro (Portugal), Departamento de Biologia. 2012. 89 p.
28. Yurchenko V.V. Tsitogeneticheskie narusheniya v epitelii shcheki cheloveka pri ekspozitsii genotoksikantami // Toksikol. vesti. 2005. № 6. S. 14-21.
29. Clark P. Assessment of avian erythrocytes that exhibit variant nuclear morphology // Comparative Clinical Pathology. 2015. Vol. 24. № 3. P. 485-490.
30. Tolbert P.E., Shy C.M., Allen J.W. Micronuclei and other nuclear anomalies in buccal smears: a field test in snuff users // Am. J. Epidemiol. 1991. Vol. 134. № 8. P. 840-850. DOI: 10.1093/oxfordjournals.aje.a116159.
31. Origin of nuclear buds and micronuclei in normal and folate-deprived human lymphocytes. / H.K. Lindberg et al. // Mutat Res. 2007. Vol. 617. № 1-2. P. 33-45. DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2006.12.002.
32. Selective entrapment of extrachromosomally amplified DNA by nuclear budding and micronucleation during S phase / N. Shimizu et al. // The Journal of cell biology. 1998. Vol. 140. № 6. P. 1307-1320.
33. Nuclear Bud Formation: A Novel Manifestation of Zidovudine Genotoxicity / A. Dutra et al. // Cytogenet. Genome Res. 2010. Vol. 128. № 1-3. P. 105-110. DOI: 10.1159/000298794/
34. Radiation-induced acute immediate nuclear abnormalities in oral cancer cells: serial cytologic evaluation. / N.V. Bhattathiri et al. // Acta Cytol. 1998. Vol. 42. № 5. P. 1084-1090.
35. Pat. 2141658 RF, MPK G01N 33/48. Sposob ekspress-vyyavleniya obluchennykh patsientov s povyshennymi chastotami khromosomnykh aberratsiy / Kravtsov V.Yu., Fedortseva R.F., Starkova Ye.V. [i dr.]. № 97120394/14; zayavl. 20.11.1997; opubl. 20.11.1999. Byul. 32.
36. The physiological and genetic differences between flycatchers (Ficedula albicollis vs. Ficedula hypoleuca) / M. Drahulian et al. // Folia Oecologica. 2018. Vol. 45. № 2. P. 111-119.
37. Assessment of the piscine micronuclei test as an in situ biological indicator of chemical contaminants effects / K.R. Carrasco et al. // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1990. Vol. 47. P. 2123-2136. DOI: 10.1139/f90-237.
38. Erythrocytic abnormalities in three antarctic penguin species along the Antarctic Peninsula: biomonitoring of genomic damage. / E. De Mas et al. // Polar Biology. 2015. Vol. 38. № 7. P. 1067-1074.
39. Rieber M., Rieber M.S. Sensitization to radiationinduced DNA damage accelerates loss of bcl-2 and increases apoptosis and autophagy. // Cancer Biology & Therapy. 2008. Vol. 7. № 10. P. 1561-1566. DOI: 10.4161/cbt.7.10.6540.
40. Kalaev V.N., Artyukhov V.G., Nechaeva M.S. Mikroyadernyy test bukkalnogo epiteliya rotovoy polosti cheloveka: problemy, dostizheniya, perspektivy // Tsitologiya i genetika. 2014. T. 48. № 6. S. 62-80.
41. Zamzami N., Kroemer G., Condensed matter in cell death. // Nature. 1999. Vol. 401. № 6749. P. 127-128. DOI: 10.1038/43591.
42. Mineeva O.V., Mineev A.K. Narusheniya morfologii eritrotsitov perifericheskoy krovi ozernoy lyagushki Rana ridibunda Pallas, 1771 // Vestnik Nizhegorodskogo universiteta im. N.I. Lobachevskogo. 2010. № 2 (2). S. 664-667.
43. Belchenko D.I. Lizis eritrotsitov krovi i kostnogo mozga eritroblastami i megakariotsitami. // Allergologiya i immunologiya. 2003. № 1. S. 65-67.
44. Mikroyadernyy test na genotoksichnost v ptitsevodstve / I.N. Yakovleva [i dr.] // Problemy selskokhozyaystvennogo proizvodstva na sovremennom etape i puti ikh resheniya: mater. mezhdunar. nauchno-proizvodstv. konf., Belgorod. Chast 1. p. Mayskiy: Izd-vo BelGSKhA, 2012. S. 140-142.
45. Atlas of Clinical Avian Hematology / Ph. Clark et al. // West Sussex, United Kingdom. A John Wiley & Sons, Ltd., Publication. 2009. VIII+182 p.
46. Mikroyadernyy test. Atlas mikroyader i yadernykh anomaliy v eritrotsitakh pozvonochnykh zhivotnykh. Protokol analiza anomaliy yader eritrotsitov // URL: http://labogen.ru/15_mnt/mntest.html (data obrashcheniya: 10.01.2020).
47. Poliorgannyy mikroyadernyy test v ekologo-gigienicheskikh issledovaniyakh: monografiya / N.N. Belyaeva [i dr.]; pod red. Yu.A. Rakhmanina, L.P. Sychevoy. M.: Genius, 2007. 312 c.
