Вариабельность нуклеотидных последовательностей генаагр у российских изолятов Treponema pallidum Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

О.А.Образцова, К.А.Алейникова, А.А.Кубанов, Д.Г.Дерябин

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА arp У РОССИЙСКИХ ИЗОЛЯТОВ TREPONEMA PALLIDUM

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии, Москва

Цель. Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей внутреннего фрагмента гена arp у современных российских штаммов T. pallidum subsp. pallidum. Материалы и методы. В работе использованы 57 клинических изолятов, полученных в 2016 — 2017 гг. из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Центрального (Калужская область), Северо-Кавказского (Ставропольский край) и Сибирского (Республика Тыва) федеральных округов. Для исследования нуклеотидных последовательностей гена arp использована технология капиллярного секвенирования. Результаты. Предложена двухраундовая амплификация гена arp, обеспечивающая корректное прочтение его внутреннего участка. В составе данных участков описаны 4 варианта 60-нуклеотидных повторов, отличающихся по составу 6, 8 и 15 — 17 триплетов. Охарактеризованы различные комбинации подобных повторов, соответствующие рефе-ренсному штамму Nichols, глобально распространенной геногруппе Street 14, а также и впервые обнаруженному региональному варианту Stavropol. Заключение. Продемонстрирована целесообразность секвенирования гена arp как инструмента повышения эффективности молекулярного типирования T. pallidum.

Журн. микробиол., 2018, № 3, С. 45—52

Ключевые слова: Treponema pallidum subsp. pallidum, молекулярное типирование, ген arp, секвенирование

O.A.Obraztsova, K.A.Aleinikova, А.A.Kubanov, D.G.Deryabin

Arp GENE NUCLEOTID SEQUENCES VARIABILITY IN RUSSIAN TREPONEMA PALLIDUM ISOLATES

State Research Center of Dermatovenerology and Cosmetology, Moscow, Russia

Aim. Analysis of the arp gene internal fragment nucleotide sequences variability in modern russian T. pallidum subsp. pallidum strains. Materials and methods. 57 T. pallidum isolates obtained from specialized dermatovenerologic clinics ofthe Central (Kaluga), the North Caucasus (Stavropol) and the Siberian (Tyva) regions in 2016 — 2017 were used in the study. The sequensing of the arp gene was performed using capillary electrophoresis technology. Results. A two-round amplification of the arp gene have been proposed, which ensures a correct reading of its internal region. Four variants of 60-nucleotide repeats in the internal arp fragment are described, which differing in 6, 8 and 15 — 17 codons compositions. Various combinations of these repeats, corresponding to the reference Nichols strain, globally distributed Street 14 genogroup, and the firstly described Stavropol regional variant are shown. Conclusion. The prospect of arp gene sequencing as a way to increase T. pallidum molecular typing efficiency is postulated.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 3, P. 45—52

Key wods: Treponema pallidum subsp. pallidum, molecular typing, arp gene, sequencing

ВВЕДЕНИ Е

Молекулярная эпидемиология, возникшая как результат интеграции молекулярно-генетических методов в традиционные эпидемиологические исследования, с конца XX века стала одним из основных инструментов кон-

троля над распространением и изменчивостью возбудителей инфекционных заболеваний [4]. В наибольшей степени этот подход оказался востребованным при анализе эпидемиологии некультивируемых патогенов, ярким примером которых является возбудитель сифилиса — Treponema pallidum subsp. pallidum [1].

Отправной точкой для разработки метода генотипирования бледной тре-понемы стала расшифровка ее полного генома [6] и последующее сравнение с геномами других представителей вида T. pallidum [3, 12], позволившее идентифицировать на бактериальной хромосоме наиболее вариабельные локусы. На основании двух из них — генов arp и tprII — в 1998 году был предложен первый метод молекулярного типирования T. pallidum subsp. pallidum [13], в дальнейшем поддержанный CDC (США) и получивший широкое распространение при анализе эпидемиологии сифилиса во всем мире как CDC-метод [2, 10].

Использование для этих целей гена arp (acidic repeat protein) определялось особенностями его структуры: наличием консервативных терминальных участков (в том числе мембрана-связывающего домена и сайта для сигнальной пептидазы I), а также находящегося между ними вариабельного фрагмента из 60-нуклеотидных тандемных повторов, занимающего 51% от общей длины гена [9]. При этом предложенный подход к выявлению подобного полиморфизма основан на амплификации соответствующего участка гена arp и последующего определения количества 60-нуклеотидных повторов на основе характеристик электрофоретической подвижности ампликона в агарозном геле [13]. В зависимости от числа подобных повторов (от 2 до 22) идентифицируемому изоляту присваивается соответствующий цифровой индекс, в дальнейшем дополняемый буквенным обозначением, соответствующим определенному профилю полиморфизма длин фрагментов рестрикции продуктов амплификации генов tprII (16 вариантов).

Многолетний опыт использования CDC-метода заставил констатировать ряд ограничений его дискриминирующей способности, в том числе связанных с выраженным доминированием вариантов T. pallidum subsp. pallidum с четырнадцатью повторами в гене arp [2, 10]. В этой связи, для повышения разрешающей способности метода было предложено дополнительное секвениро-вание генов tp0136, tp0319, tp0548 и 23S рРНК [5], а также вариабельного участка гена tp0548 (позиции 131 — 215) [11]. При этом последний подход, позволивший разделить подтип 14а на 2, а 14d на 4 отдельные подгруппы, получил наибольшее распространение и в настоящее время интегрирован в систему молекулярного типирования при сифилисе.

Вместе с тем, анализ гена arp (слияние tp0433 — 0434) свидетельствует о неполном раскрытии его дифференцирующего потенциала. Основанием для этого утверждения являются данные о неидентичном характере нуклеотидных последовательностей тандемных повторов, на основании которых могут быть выделены их I, II, III и II/III подтипы [9]. Другой особенностью может являться различный порядок расположения этих подтипов в составе внутреннего фрагмента гена arp [7]. Соответственно секвенирование гена arp вместо рутинной детекции ПЦР-продуктов его амплификации представляется перспективным направлением совершенствования CDC-метода, приводящим молекулярное типирование T. pallidum subsp. pallidum к стандартам мультилокус-ного секвенирования бактериальных геномов.

В этой связи, целью настоящего исследования явился анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей внутреннего фрагмента гена arp у

современных российских штаммов T. pallidum subsp. pallidum, выполненный с использованием технологии капиллярного секвенирования (по Сенгеру).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены 57 клинических изолятов, полученных в 2016 — 2017 гг. из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Центрального (Калужская область), Северо-Кавказского (Ставропольский край) и Сибирского (Республика Тыва) федеральных округов. В качестве референса использован T. pallidum subsp. pallidum штамм Nichols, культивируемый на тестикулярной модели у кроликов.

Выделение ДНК из исследуемого биоматериала проводилось с использованием набора реагентов «Проба-НК» (ДНК-технология, Россия). Присутствие генетического материала T.pallidum subsp. pallidum в полученных образцах подтверждалось методом ПЦР с праймерами к гену polA (регион 1156 — 1531 пар оснований), кодирующему специфическую ДНК-полимеразу I данного микроорганизма [8].

Рутинное типирование подтвержденных клинических изолятов проводили с использованием CDC-метода [13] путем амплификации гена arp, а также амплификации генов подсемейства tprII с последующей рестрикцией эндонуклеазой Tru9 I (НПО СибЭнзим, Россия) и оценкой электрофоретиче-ской подвижности полученных продуктов в агарозном геле относительно маркеров молекулярных масс GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (ThermoFi-sherScientific, США). В соответствии с рекомендацией Marra С.М. et al. [11] дополнительно проводили секвенирование вариабельного участка гена tp0548.

Подбор праймеров для секвенирования вариабельного фрагмента гена arp осуществляли с использованием банка аннотированных нуклеотидных последовательностей Национального центра биотехнологической информации США (GenBank NCBI USA) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/] и on-line сервиса nucleotide BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/].

Амплификация гена arp проводилась с использованием термоциклера DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Очистка ПЦР-продукта после первого этапа амплификации проведена с использованием набора «QIAquick PCR Purification Kit» (Qiagen, Германия). Очищенный ПЦР-продукт был использован для второго этапа амплификации с применением меченых терминирующих нуклеотидов из набора реагентов Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Осажденные продукты ПЦР использовали для проведения секвенирования вариабельного фрагмента гена arp на приборе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с применением программного обеспечения 3130 Data Collection v.3.0.

Первичная расшифровка нуклеотидных последовательностей вариабельного фрагмента гена arp проведена в программе Sequencing Analysis 5.3.1. Для выравнивания гена arp на референсные сиквенсы T.pallidum subsp. pallidum использована программа Mega 5.

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

Исследование 57 образцов генетического материала T.pallidum в соответствии с рутинной процедурой CDC относило их исключительно к 14 молекулярному субтипу по гену arp. Наличие гена arp с четырнадцатью 60-нуклео-тидными тандемными повторами продемонстрировано и в референс-

Таблица 1. Праймеры, использованные для амплификации фрагментов гена arp T. pallidum subsp. pallidum

Последовательность 5'-3'

Длина ПЦР-продукта (п.о.)

arp_F_1 arp_R_1

arp_F_2 arp_R_2

Внешние праймеры (первый раунд амплификации) CAA GTC AGG ACG GAC TGT CC 1643

GGT ATC ACC TGG GGA TGC Внутренние праймеры (второй раунд амплификации) ATC TTT GCC GTC CCG TGT GC 1015

CCG AGT GGG ATG GCT GCT TC

ном геноме T. pallidum штамм Nichols. Последующее типирование по генам tprll и tp0548 позволило частично разделить анализируемую выборку, выделив в ней доминантный (14 d/f - 89,5%) и минорные (14 b/g и 14 c/f по 3,5%; 14 b/f и 14 i/f по

1,7%) молекулярные субтипы. Однако однотипный характер гена arp существенно снизил эффективность дискриминации данных клинических изолятов. Тем самым полученный результат подтвердил декларированную необходимость совершенствования CDC-метода, в частности, путем углубленного анализа гена arp с применением технологии капиллярного секвениро-вания.

Практическое решение этой задачи потребовало внесения изменений в протокол амплификации гена arp, поскольку использование предложенных Pillay А. et al. [13] прямого и обратного праймеров как на этапе фрагментации анализируемого участка ДНК, так и в реакции амплификации с применением меченых терминирующих нуклеотидов, не обеспечивало качественного прочтения концевых участков анализируемых нуклеотидных последовательностей. В этой связи, нами была предложена процедура двухраундовой амплификации гена arp с использованием двух пар прямого и обратного праймеров (табл. 1). При этом использование первой (внешней) пары праймеров ориентировано на получение первичного ампликона размером 1643 п.о., расположенного между 388 и 1541 нуклеотидами в гене arp и наряду с его центральным участком из 60-нуклеотидных тандемных повторов дополнительно включающего фрагменты 5' - и 3'-концевых консервативных участков. В свою очередь, на этапе секвенирования с использованием терминирующих нуклеотидов использовалась вторая (внутренняя) пара праймеров, амплифицирующая внутренний участок гена arp, полученного после первого раунда амплификации (рис. 1). Подобный подход обеспечил качественное прочтение участка гена arp между 414 и 1409 нуклеотидами (размером 1015 п.о.), результатом которого являлось как четкое определение количества 60-нуклеотидных повторов, так и их первичных нуклеотидных последовательностей.

Результаты проведенного секвенирования во всех случаях подтвердили присутствие во внутреннем участке гена arp четырнадцати тандемных повторов, одновременно зафиксировав вариации их нуклеотидного состава, а также различный характер взаимного расположения подобных неидентичных повторов.

Анализируемые повторы характеризовались высоким содержанием GC-пар (67%), наличием двух палиндромных последовательностей (CCGGCC и GAGGGGAG), а также

вариабельностью пяти триплетов в Рис. 1. Схема двухраундовой амплификации гена ^ £ о i с i с лл t е.

arp T. pallidum subsp. pallidum с использованием позициях 6 8 15, 16 и 17 (табл. 2). внешней и внутренней пар праймеров. Наиболее частым вариантом являлся

388

547

1386

1541

X

»tp*

1386 .1409

3'

5'

3-

60-нуклеотидный повтор с триплетом GTG в 6 и AAG в 8 позициях, а также триплетами GAG, CGT и GAG в 15

— 17 позициях. Ранее исключительное присутствие аналогичных 60-нуклеотидных повторов было показано у T. pallidum, выделенных от обезьян, T. pallidum subsp. pertenue и T. pallidum subsp. endemi-cum [7], что позволяет предполагать их эволюционную первичность, составившую основу для последующей дивергенции гена arp. Вторым по частоте встречаемости являлся повтор, отличающийся от описанного выше варианта единственным одно-нуклеотидным полиморфизмом — заменой пиримидинового основания во втором положении 6 триплета, приводящим к изменению кодируемой аминокислоты с аланина на ва-лин (GCG ^ GTG; A ^ V). Более существенными оказывались отличия третьего и четвертого вариантов, нуклео-тидные замены в 15

— 17 триплетах которых произошли по типу транзиции, т.е. путем замещения пуринового основание на пури-новое, а пиримидино-вое на пиримидиновое. При этом замены пу-ри новых осно ваний во втором положении 15 (GAG ^ GGG) и 16 (CGT ^ CAT) трипле-

■в

1 л

t

я я

о

л

g

я

0 =

X

1

5

г «

0

1

^

is

я

о

5

о

а

ч

Is

=

а g |

« к °

<N Н S

Я Я К 0$

S

ч

ю

Я

н

о

< М

О

О о

< о

сзо м ^о м м м

CGT Pi T G C § KI KI

м м go О g'o о

н

U сл Н

О

ч <

о

*

^О м

о ^ >

о

>

\о ^О М О ^ ^О О

о

О Рч

о

go > ^ go > >

сз" Q

<0 и

go >

CjO м

н

о

о

я ft о н

X

о =

¡2 о к

я н Я

It

я

к &

и

о к

-с

3

я

3

о

И

U

s к

Я №

S ft С

5'

3'

.....

т~гт

I I V//.

Nichols (1) Street 14 (54) I I I Stavropol (3)

I I I У//Ш Madras*

.........Simian*

О тип I

I тип IV

Рис. 2. Структура внутренних участков гена arp, состоящих из различных вариантов 60-нуклео-тидных повторов.

Варианты нуклеотидных повторов I — IV аналогичны табл. 2. Справа указано наименование известной или впервые описанной комбинации повторов (в скобках — количество штаммов из анализируемой выборки; * комбинации приведены по данным литературы).

тов повлекли за собой изменение кодируемых аминокислот с глутами-новой кислоты на глицин (E ^ G) и с аргинина на гистидин (R ^ H), а ну-клеотидная замена в третьем положении 17 триплета (GAG ^ GAA), напротив, не сопровождалась изменением кодируемой аминокислотной последовательности. Наконец, различия между третьим и четвертым вариантами 60-нуклеотидного повтора заключались в замене двух пу-риновых оснований 8 триплета с соответствующим изменением кодируемой аминокислоты с лизина на глицин (AAG ^ GGG; K ^ G). В целом полученные данные достаточно хорошо согласуются с известными представлениями о вариантах нуклеотидных последовательностей тандемных повторов гена arp [7, 9], в то время как предложенная нами нумерация наиболее корректно отражает вероятные последовательные изменения их первичной структуры.

Последующий анализ комбинаций расположения различных вариантов 60-нуклеотидных тандемных повторов во внутреннем участке гена arp приводил к заключению существованию нескольких молекулярных субтипов данного гена (рис. 2).

Комбинация внутреннего участка гена arp у референсного штамма Nichols при прочтении от 5'-конца заключалось в нерегулярном чередовании повторов I и II типов, завершающихся двумя повторами IV типа на 3'-конце фрагмента. Однако формула подобной комбинации 5'-II-II-I-II-I-I-II-II-I-

I-I-I-IV-IV-3' не была зафиксирована ни у одного из современных российских клинических изолятов T. pallidum. На этом фоне наиболее распространенной в анализируемой выборке оказывалась комбинация 5'-II-

II-I-II-I-I-II-II-IV-I-I-I-III-IV-3', установленная у 54 из 57 исследованных клинических изолятов и по своей последовательности соответствующая внутреннему фрагменту гена arp штамма Street 14 [12]. Тем самым соотнесение полученных данных с представлениями о существовании в глобальной популяции T.pallidum subsp. pallidum двух обособленных генетических кластеров, известными представителями которых являются штаммы Nichols (Dallas, Chicago B и др.) и Street 14 (Philadelphia-1, AZ 11 и др.), приводило к заключению о принадлежности российских изолятов к последней, также как это было показано для возбудителей сифилиса, циркулирующих в странах Восточной Европы [5]. На этом фоне у трех клинических изолятов, поступивших из Северо-Кавказского федерального округа (Ставропольский край), была обнаружена ранее неизвестная комбинация внутреннего участка гена arp, состоящая только из повторов I и II типов, описываемая формулой 5'-II-II—I—II—I—I—II—II—I—II—II—I—I—I—3' и обозначенная нами как молекулярный вариант Stavropol (рис. 2). Тем самым подобная находка развивает предположение о существовании в глобальной популяции T. pallidum subsp. pallidum более значительного разнообразия гена arp, что ранее было показано на при-

мере одного из регионально распространенных вариантов — выделенного в Индии штамма Madras [7].

ОБСУЖДЕНИ Е

Молекулярное типирование T. pallidum subsp. pallidum, основанное на исследовании вариабельных генов arp, tprII и tp0548, в настоящее время стало распространенным и востребованным инструментом слежения за глобальной и региональной эпидемиологией сифилиса [1, 2]. В то же время, длительный опыт использования данного метода заставил констатировать ряд ограничений его дискриминирующей способности, в том числе определяемых высокой частотой встречаемости гена arp с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандем-ными повторами.

Предложенным в настоящем исследовании подходом к повышению эффективности генотипирования T. pallidum явился переход от электрофорети-ческой детекции ампликонов гена arp к секвенированию его внутреннего вариабельного участка, реализованный с использованием оригинальной двух-раундовой процедуры амплификации.

Проведенное секвенирование гена arp позволило получить три согласующихся результата: 1) отнести все исследуемые гены к вариантам с 14 нуклеотид-ными повторами; 2) подтвердить существование 4 вариантов 60-нуклеотидных повторов, отличающихся по составу 6, 8 и 15 — 17 триплетов [7, 9]; 3) описать различные комбинации подобных неидентичных повторов. При этом принципиально важным результатом стало выявление в российской популяции нескольких вариантов гена arp. Подавляющее большинство из них (54 из 57) относились к варианту, характерному для геногруппы Street 14, что впервые показывает её доминирование в обследованных субъектах Российской Федерации. С другой стороны, вариант последовательного расположения 60-нуклеотидных повторов, характерный для геногруппы Nichols, был зафиксирован только у соответствующего референсного штамма, что свидетельствует о произошедшем полном вытеснении данного генотипа. Наконец еще одной принципиально важной находкой стало обнаружение ранее неизвестного варианта гена arp, имеющего четко ограниченный ареал распространения.

Таким образом, результаты проведенного исследования принципиально подтвердили целесообразность секвенирования гена arp для повышения эффективности молекулярного типирования T. pallidum, позволив дифференцировать вариант данного гена с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандемны-ми повторами на несколько молекулярных субтипов. Планируемое увеличение количества исследуемых клинических изолятов с вовлечением субъектов Российской Федерации с традиционно высоким уровнем заболеваемости сифилисом потенциально должно еще более расширить дискриминирующую эффективность предложенного метода, позволив охарактеризовать пандемический и региональные молекулярные варианты T. pallidum subsp. pallidum. Одновременно продолжение исследований в обозначенном направлении явится шагом, приводящим молекулярное типирование возбудителя сифилиса к стандартам мультилокусного секвенирования бактериальных геномов.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России на плановый период 2018 — 2020 гг.

ЛИТЕРАТУРА

1. Белозоров А.П., Сокол О.А. Молекулярное типирование микроорганизма Treponema pallidum подвид pallidum. Дерматолопя та венеролога. 2013, 4 (62): 5-11.

2. Кубанов А.А., Воробьев Д.В., Обухов А.П., Образцова О.А., Дерябин Д.Г. Молекулярная эпидемиология Treponema pallidum в приграничном регионе Российской Федерации (Республика Тыва). Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017, 1: 30-34.

3. Cejkova D., Zobanikova M., Chen L. et al. Whole genome sequences of three Treponema pallidum ssp. pertenue strains: yaws and syphilis treponemes differ in less than 0.2% of the genome sequence. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012, 6(1). doi: 10.1371.

4. Dekker M.C., van Duijn C.M. Prospects of genetic epidemiology in the 21st century. Eur. J. Epidemiol. 2003, 18 (7): 607-616.

5. Flasarova M., Pospisilova P., Mikalova L. et al. Sequencing-based molecular typing ofTreponema pallidum strains in the Czech Republic: all identified genotypes are related to the sequence of the SS14 strain. Acta Derm. Venereol. 2012, 92: 669-674.

6. Fraser C.M., Norris S.J., Weinstock G.M. et al. Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. Science. 1998, 281 (5375): 375-388.

7. Harper K.N., Liu H., Ocampo P.S. et al. The sequence of the acidic repeat protein (arp) gene differentiates venereal from nonvenereal Treponema pallidum subspecies, and the gene has evolved under strong positive selection in the subspecies that causes syphilis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008, 53 (3): 322-332.

8. Liu H., Rodes B., Chen C.Y., Steiner B. New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene. J. Clin. Microbiol. 2001, 39 (5): 1941-1946.

9. Liu H., Rodes B., George R., Steiner B. Molecular characterization and analysis of a gene encoding the acidic repeat protein (Arp) of Treponema pallidum. J. Med. Microbiol. 2007, 56 (6): 715-721.

10. Ma D.Y., Giacani L., Centurion-Lara A. The molecular epidemiology of Treponema pallidum subspecies pallidum. Sex Health. 2015, 12 (2): 141-147.

11. Marra C.M., Sahi S.K., Tantalo L.C. et al. Enhanced molecular typing of Treponema pallidum: geographical distribution of strain types and association with neurosyphilis. J. Infect. Dis. 2010, 202: 1380-1388.

12. Matejkova P., Strouhal M., Smajs D. et al. Complete genome sequence of Treponema pallidum spp. pallidum strain SS14 determined with oligonucleotide arrays. BMC Microbiol, 2008, 8:76. doi:10.1186/1471-2180-8-76.

13. Pillay A., Liu H., Chen C.Y et al. Molecular subtyping of Treponema pallidum subspecies pallidum. Sex. Transm. Dis. 1998, 25 (8): 408-414.

Поступила 25.12.17

Контактная информация: Дерябин Дмитрий Геннадьевич, д.м.н., проф.,

107076, Москва, ул. Короленко, 3, стр. 6, р.т. (499)785-20-40