CC BY
73
УДК 615.277.3.015:616-006-092.9
E. G. Shcherbakova1, V. MBukhman2, I. T. Shcherbakov1, D. A. Bodyagin2, E. R. Pereverzeva2,
E. B. Isakova2, I. A. Vasilenko1, L. S. Vorobyeva1, A. A. Barsukov1, N. N. Lipatov3
INCREASING CYCLOPHOSPHAMIDE ANTITUMOR ACTIVITY BY COMBINATION OF LYSOZYME AND LACTULOSE. EXPERIMENTAL EVALUATION
1 Russian Medical Academy of Prolonged Education, Moscow
2 Gause Institute of New Antibiotic, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow 3 Institute of Baby Feeding, Russian Academy of Agricultural Sciences, Moscow
ABSTRACT
Antitumor activity of cyclophosphamide (CY) increases with combined long-term oral introduction of lactulose (LACT) and hen white egg lysozyme (HWEL). This phenomenon in semisyngeneic system was stronger than the effect of CY+HWEL in F1 hybrid mice with intraperitoneally transplanted EL4 lymphoma. The LACT alone did influence neither rate of growing lymphoma, nor CY antitumor activity. CY+HWEL+LACT inhibited the increasing of ascites in mice and the tumor cells dissemination. In contrast to untreated or with CY-treated mice adoptive transfer of the spleen cells from the donors treated with CY+HWEL or CY+HWEL+LACT was accompanied by high level of growth inhibition in EL4 recipients. In comparison with the untreated or treated with CY mice there was the normalization of the different host parameters, including heart, a wall of intestines, lung or lymphoid organs, levels bifidobacteria or lactobacilli in contents of a large intestine after introduction of CY+HWEL+LACT. The received data indicate that the combination HWEL+LACT can appear useful as treatment of cancer patients.
Key words: antitumor action, cyclophosphamide, lysozyme, lactulose, experiment.
Э. Г. Щербакова1, В. М. Бухман2, И. Т. Щербаков1, Д. А. Бодягин2, Э. Р. Переверзева2,
Е. Б. Исакова2, И. А. Василенко1, Л. С. Воробьева1, А. А. Барсуков1, Н. Н. Липатов3
УВЕЛИЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФОСФАМИДА СОЧЕТАНИЕМ ЛИЗОЦИМА С ЛАКТУЛОЗОЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
1 Российская 'Медицинская Академия последипломного образования М3 РФ, Москва
2 ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва
3 ГУ НИИ детского питания РАСХН, Москва
РЕЗЮМЕ
Противоопухолевая активность циклофосфамида увеличивается при сочетанном длительном пероральном введении лактулозы (ЛАКТ) и лизоцима белка куриных яиц (ЛБКЯ). Этот эффект более выражен, чем действие ЛБКЯ в полусингенной системе на лимфоме ЕЬ4, трансплантированной внутрибрюшинно мышам-гибридам И. Одна ЛАКТ не влияла на накопление асцита, а также на противоопухолевую активность ЦФ. Комбинация ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ тормозила развитие асцита и генерализацию лимфомы. Адоптивный перенос селезеночных клеток от доноров, получивших ЦФ+ЛБКЯ или ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ, в отличие от контрольных мышей сопровождался выраженным торможением роста ЕЬ4 у реципиентов. При введении ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ происходила нормализация функционального состояния следующих органов: сердца, стенки кишечника, легких и лимфоидных органов, уровней бифидо- и лактобактерий в содержимом толстой кишки. Полученные данные позволяют предположить, что комбинация ЛБКЯ+ЛАКТ может оказаться полезной при лечении онкологических больных.
Ключевые слова: противоопухолевое действие, циклофосфамид, лизоцим, лактулоза, эксперимент.
ВВЕДЕНИЕ
Многие годы в онкологии изучается возможность использования модуляторов иммунобиологической реактивности организма для усиления противоопухолевой активности и избирательности действия цито-токсических препаратов.
Хотя добавление так называемых неспецифических иммуномодуляторов к цитостатикам во многих случаях не приводит к улучшению результатов лечения [34, 38], известны варианты, при которых такое добавление приводит к повышению эффективности терапии онкологических больных. Так, ингибитор аминопептидаз бестатин (убинимекс) способен эффективно повысить иммунореактивность пациентов с лимфомами, получивших интенсивную химиотерапию с последующей пересадкой костного мозга [16]. Левамизол включен в стандартные схемы лечения больных со стадией III рака толстой кишки. Продемонстрировано, что добавление левамизола или PSK (ассоциированный с белком полисахарид из высшего гриба Trametes versicolor) к 5-фторурацилу (с биохимической модуляцией метотрексатом или лейковори-ном) достоверно улучшает результаты лечения больных, страдающих раком толстой и прямой кишки [28, 31]. Внутриполостная иммунохимиотерапия OK-432 с цитостатиками (цисплатин, митомицин C, адри-амицин и т. п.) эффективнее одной иммуно- или химиотерапии при злокачественных выпотах [27]. Метаанализ результатов 11 рандомизированных клинических испытаний показал, что добавление стрептококкового иммуномодулятора OK-432 (Picibanil) к стандартной адъювантной химиотерапии достоверно увеличивает продолжительность жизни оперированных пациентов с немелкоклеточным раком легкого [32]. Хотя чувствительность слабо иммуногенных клеток рака желудка к химиотерапии низкая, удалось увеличить клиническую эффективность иммунохимиотерапии рака желудка путем биохимической модуляции и неспецифической иммуностимуляции модификаторами биологической реактивности (МБР). Послеоперационная иммунохимиотерапия рекомендуется в качестве стандартного лечения при раке желудка III стадии [25, 36].
Нами было показано, что длительное пероральное применение лизоцима белка куриных яиц (ЛБКЯ) в дозе 100 мг/кг либо не влияет на противоопухолевую активность циклофосфамида (ЦФ) в отношении мышиной лимфомы EL4, либо усиливает ее, хотя один лизоцим без цитостатика существенно не сказывается на рост опухоли [10]. Усиление эффекта ЦФ посредством ЛБКЯ наблюдалось только на мышах (C57Bl/6JxDBA/2)F1 с EL4, но не на мышах линии C57Bl/6J. Хотя ЦФ применялся в относительно невысокой эффективной дозе 100 мг/кг, он оказывал иммуномодулирующее действие благодаря угнетению супрессорных Т-клеток [7, 13]. Выявлено также, что ЛБКЯ и его сочетание с пребиотиком лактулозой (ЛАКТ) обеспечивает выраженный бифидо- и лакто-
генный эффект в модельных системах in vitro и in vivo, снижает морфофункциональные проявления алкогольной и медикаментозной интоксикации, способствует коррекции протеолитической (эластазоподобной), ан-типротеиназной и лизоцимной активности, улучшает баланс микроэлементов [9, 11, 12].
Описаны многочисленные положительные эффекты ЛАКТ, основными из которых являются улучшение микробиоценоза и моторики кишечника, снижение интоксикации при системной печеночной энцефалопатии и др., обусловленные стимуляцией бифидо- и лактофлоры, связыванием аммиака и подавлением его абсорбции, угнетением синтеза токсинов и канцерогенов [2, 9, 24]. ЛАКТ — малоизвестный препарат. Из данных литературы следует, что он проявляет антиканцерогенное действие и уменьшает риск развития рака толстой кишки [14, 15, 18, 30]. Это происходит в результате нормализации уровней факторов риска, которые представлены высоким значением рН содержимого кишечника и высоким содержанием в последнем вторичных желчных кислот [22, 29]. Длительный прием ЛАКТ изменяет ферментативную активность микрофлоры кишечника, что ведет к снижению рН (закис-ление кала) и уменьшению образования микробами вторичных желчных кислот [14].
В литературе отсутствуют сведения о противоопухолевой активности ЛАКТ или ее способности модулировать активность цитостатиков. Цель настоящего исследования — экспериментальное изучение эффективности циклофосфамида в сочетании с длительным пероральным применением одной ЛАКТ и в сочетании с ЛБКЯ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проведена на мышах-самцах гибридах (C57Bl/6JxDBA/2)F1 (B6D2F1) разводки питомника РАМН «Крюково». Мышей содержали в клетках по 5-10 голов на стандартной диете и свободном доступе к воде.
В работе использован штамм перевиваемой Т-кле-точной лимфомы EL4 [19]. Штамм хранится в жидком азоте при температуре -196 °C. После размораживания штамм поддерживали в сингенных условиях на мышах чистой линии C57Bl/6J (B6) в асцитной форме, серийными внутрибрюшинными (в/бр) пассажами по 106 асцитных опухолевых клеток на мышь. В основных экспериментах самцам мышей B6D2F1 (полусингенная система) вводили в/бр по 5x104 асцитных лимфомных клеток EL4, выделенных из 10-суточного асцита.
В работе использовали коммерческие препараты: лизоцим гидрохлорид фирмы Belovo (Бельгия), сироп лактусан (40% раствор лактулозы) производства ЗАО «Фелицата» (г. Ярославль) и циклофосфан (г. Саранск). Испытуемые вещества (далее — препараты) разводили в воде и/или физиологическом растворе натрия хлорида непосредственно перед введением. ЛБКЯ в дозе 100 мг/кг и ЛАКТ в дозе 115 мг/кг вводили через рот в желудок с помощью изогнутого металлического зонда; ЦФ инъецировали однократно в дозе
100 мг/кг в/бр. Схемы и режимы введения препаратов в конкретных опытах даны ниже.
Противоопухолевый эффект оценивали по параметрам, принятым в экспериментальной онкологии: выживаемость, масса опухоли, доля вылеченных животных. Дополнительным параметром служило также изменение массы тела: поскольку в опытах использовали взрослых мышей с относительно стабильной массой тела (20-25 г), то достоверное увеличение массы тела, наблюдаемое к 15-20-м суткам у нелеченных мышей, обусловлено накоплением асцита. Параметр увеличения продолжительности жизни (УПЖ) рассчитывали по формуле:
УПЖ (%) = (СПЖо - СПЖк)/СПЖкх100,
где УПЖ — увеличение продолжительности жизни;
СПЖо и СПЖк — средняя продолжительность жизни в днях в опыте и контроле (животные, не получавшие препаратов, — контроль роста опухоли) соответственно.
День прививки опухолевых клеток принят за 0.
Влияние на противоопухолевую резистентность организма оценивали в тесте локального адоптивного переноса Винна (местный нейтрализационный тест — МНТ) [39]. Мышам-донорам в контрольной группе вводили по 104 опухолевых клеток в/бр; мышам-доно-рам опытных групп после инокуляции опухолевых клеток вводили однократно в/бр ЦФ и затем ежедневно ЛБКЯ, ЛАКТ или их сочетание. Для проведения МНТ на 12-й день роста опухоли забивали мышей-доноров, извлекали селезенки, приготовляли суспензию селезеночных клеток в среде 199 и смешивали последние с опухолевыми клетками в соотношении 50:1 непосредственно перед введением мышам-реципиентам. Инокулят, содержащий 104 опухолевых клеток, вводили в/бр мышам-реципиентам в объеме 0,2 мл.
Количество и тип асцитных клеток, вымытых из брюшной полости, определяли при исследовании мазков, фиксированных метанолом и окрашенных по стандартным методикам. Патоморфологическое исследование органов (селезенка, сердце, кишечник, мезентериальные лимфатические узлы) с качественной оценкой относительного содержания опухолевых клеток в селезенке проведено на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для оценки морфофункционального состояния клеток из пула крови, взятой у всех животных соответствующей группы, проводили прижизненное многопараметровое фазометрическое исследование лимфоцитов на лазерном компьютерном цитофотометре «Цитоскан» [1] и определение продукции кислородных радикалов гранулоцитами методом зимозан-индуцированной хемилю-минесценции на хемилюминометре «Маклаб». Состав микрофлоры содержимого толстой кишки определяли общепринятым микробиологическим методом. По нашим неопубликованным данным, в 1 г кала интакт-ных мышей, использованных в эксперименте, содержится 5х108 КОЕ бифидобактерий и 109 КОЕ лактобактерий.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ. Достоверность различий выживаемости животных определяли по тесту Манна—Уитни [5], различий средних величин — по 1-критерию Стьюдента, а достоверность различий в долях выживших животных — по критерию X2 [8]. Достоверными считали различия при _р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В табл. 1 представлены результаты двух экспериментов, в которых сравнивали биологическую активность, проявляемую изучаемыми препаратами в использованной модельной системе. В этих опытах наблюдалась 100% прививаемость опухоли в группах контроля роста опухоли.
Таблица 1
Влияние лактулозы, лизоцима и их сочетания на рост асцитной лимфомы и эффекты циклофосфа-мида у мышей
Г руппа и СПЖ, дн. Ранж, сут УПЖ,% ЛГ,% Выживае- мость*,%
Опыт 1
КРО 10 24,8 24-29 0
ЦФ 10 37,1м 24-45 50 10 0
Лакт 10 24,7 24-30 0 0 0
ЦФ+Лакт 10 ЗІ.Г4’ 27-42 25 0 0
Опыт 2
КРО 10 23,4 20-29 0 0
ЦФ 10 31,6“ 27-44 35 0 0
ЛБКЯ 10 25,6 19-33 9 0 0
ЦФ+ЛБКЯ 10 32,4“'с> 25-39 38** 0 20
ЛБКЯ+Лакт 10 25,4 18-34 9 0 0
ЦФ+ЛБКЯ+Лакт 10 37 Зису 28-51 59+* 0 30
Все мыши получили по 5x104 клеток Е1.4 в/бр в день «0». п - число мышей. СПЖ - средняя продолжительность жизни в днях. УПЖ - увеличение продолжительности жизни. Л Г - лекарственная гибель. КРО - контроль роста опухоли. ЦФ - циклофосфамил. ЛБКЯ - лизоцим белка куриных яиц. ЛАКТ - лактулоза. и. су - достоверное отличие от КРО и ЦФ. соответственно. •- выжившими считали мышей переживших 90 сут, у которых на вскрытие опухоль не выявлена. *• - в расчётах учитывали только павших мышей.
В 1-м опыте ежедневное, начиная с 3-х суток и до гибели подопытных мышей, введение ЛАКТ не оказало ни противоопухолевого, ни токсического действия. Применение ЛАКТ после однократного в/бр введения ЦФ привело к достоверному ослаблению противоопухолевого действия ЦФ.
Однако во 2-м эксперименте было продемонстрировано, что в аналогичных условиях опыта одновременное длительное пероральное применение комбинации ЛБКЯ с ЛАКТ может значительно увеличивать противоопухолевую активность ЦФ. В этом опыте введение ЛБКЯ или комбинации ЛБКЯ+ЛАКТ не ока-
зало существенного влияния на выживаемость мышеи (УПЖ = 9 %). ЦФ оказывал умеренное влияние на выживаемость мышеИ. УПЖ составило 35 %. Длительное пероральное введение ЛБКЯ после ЦФ хотя и не привело к существенному повышению УПЖ, однако у 2 мышеИ опухоль не развилась и они выжили. Добавление ЛАКТ к ЛБКЯ после ЦФ привело к более выраженному увеличению активности ЦФ, что проявилось в значительной отсрочке гибели мышеИ (УПЖ = 59), и к полному излечению 30 % животных.
Таким образом, результаты этих опытов позволяют заключить, что в использованноИ модельноИ системе ЛБКЯ и, более выражено, ЛБКЯ+ЛАКТ способны усилить противоопухолевое деИствие, проявляемое однократным введением ЦФ в относительно невысокоИ дозе на раннеИ стадии развития перевиваемоИ опухоли.
Цитологические и гистологические исследования, проведенные на 17-е сутки после инокуляции опухоли, выявили значительную коррекцию реакции иммуно-компетентных клеток сочетанием ЛБКЯ+ЛАКТ в условиях однократного воздеИствия иммуномодулирующеИ дозы ЦФ (рис. 1 и 2). Так, если объем опухолевого асцита у нелеченных мышеИ к 17-м суткам составил в среднем 2,8 мл, то у мышеИ, получивших один ЦФ или сочетание ЦФ с комбинациеИ ЛБКЯ+ЛАКТ, — лишь 0,1 мл (р<0,05). Как видно из представленных на рис. 1 результатов дифференциального подсчета клеток, в асците мышеИ, получавших сочетание ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ, содержалось значительно меньше опухолевых клеток и была достоверно ниже частота митозов, чем у нелеченных или получивших ЦФ животных. В то же время такая комплексная терапия существенно изменяла соотношение клеток в перитонеальном экссудате леИкозных мышеИ: отмечено значительное повышение количества иммунокомпетентных клеток, прежде всего макрофагов, по сравнению с таковым при применении монотерапии ЦФ. Определенно улучшалась также морфология макрофагов. Под влиянием ЦФ ядра и цитоплазма клеток опухоли и макрофагов в перитонеальном экссудате были как бы пробиты пулями, что является типичным проявлением цито-токсического деИствия препаратов этоИ группы. У животных, получавших ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ, наблюдали увеличение количества макрофагов с неповрежден-ноИ цитоплазмоИ, которые атаковали клетки опухоли.
Потенцирование противоопухолевого эффекта ЦФ сочетанием ЛБКЯ+ЛАКТ проявлялось торможением генерализации ЕЬ4, о чем свидетельствует уменьшение инфильтрации лимфоидных органов (селезенки, мезентериальных лимфатических узлов, ткани тимуса), кишечника, легких, сердца. При этом наблюдалось значительное улучшение структурно-морфологических параметров органов по сравнению с таковыми у животных, получавших ЦФ.
Гистологическое исследование селезенки мышеИ, проведенное на 17-е сутки развития лимфомы, показало, что, в отличие от интактных (без опухоли и введения препаратов) животных (рис. 2, а), у нелеченных мышеИ из группы КРО отмечены атрофия лимфоидноИ
Рис. 1. Модификация комбинациеИ лизоцима с лактулозоИ активности циклофосфамида в отношении клеток опухолевого асцита:
КРО — контроль роста опухоли; ЦФ — циклофо-сфамид; ЛИЗ — ЛБКЯ (лизоцим белка куриного яИца); ЛАКТ — лактулоза
ткани фолликулов селезенки, повышенное развитие со-единительноИ ткани вокруг трабекул, наличие групп клеток БЬ4 в красноИ пульпе селезенки под капсулоИ (рис. 2, б). У животных с опухолью, получивших однократно в/бр ЦФ в 1-е сутки опыта (рис. 2, в), была также выявлена умеренная атрофия лимфоидноИ ткани фолликулов. В красноИ пульпе имелись множественные очаги экстрамедуллярного кроветворения миело-идного типа, избыток мегакариоцитов и мегакариобла-стов. Единичные опухолевые клетки располагались субсерозно и под капсулоИ органа. Под капсулоИ и вокруг трабекул появлялись очаги повышенного развития соединительноИ ткани. Селезенка мышеИ, получивших однократно ЦФ и затем ежедневно в течение 12 сут ЛБКЯ+ЛАКТ, не отличалась от интактного контроля (рис. 2, г).
Высокая обсемененность опухолевыми клетками при асцитноИ форме лимфомы отмечена в кишечнике. Так, на 14-17-е сутки развития опухоли в стенке тон-коИ кишки крупные скопления опухолевых клеток располагались под серозноИ оболочкоИ, часто с прорастанием между волокнами мышечноИ оболочки и в прилежащих участках брыжеИки. После однократного введения ЦФ к этому сроку клетки опухоли не обнаруживались, но развивались признаки повреждающего деИствия цитостатика, которые характеризовались отеком подслизистого слоя и собственноИ пластинки слизистоИ оболочки кишки, атрофиеИ и деструкциеИ эпителиальных клеток в криптах. На некоторых участках слизистоИ оболочки укорачивались и утолщались ворсинки; в части ворсин отмечена избыточная лим-
Рис. 2. Селезенка мышеИ при лимфоме ЕЬ4. Окраска гематоксилин-эозином. Об. х40:
а — интактныИ контроль; б — контроль роста опухоли: субсерозное разрастание опухолевых клеток ЕЬ4 на капсуле селезенки, атрофия лимфоидноИ ткани под капсулоИ; в — селезенка мыши с лимфомоИ после применения ЦФ: отсутствие опухолевых клеток на капсуле, повышенное развитие соединительноИ ткани вокруг трабекул; г — селезенка мыши с лимфомоИ после применения ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ: морфология не отличается от интактного контроля
фоидная инфильтрация стромы. В пейеровых бляшках отмечались умеренная очаговая дистрофия лимфоидной ткани и признаки склерозирования стромы. После применения ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ структура слизистой оболочки тонкой кишки не отличалась от контроля.
Таким образом, при применении ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ в селезенке и тонкой кишке не выявлялось изменений, как связанных с ростом опухоли, так и индуцированных ЦФ.
Особый интерес представляло исследование влияния изучаемых препаратов на миокард, поскольку считается, что одной из причин вторичной кардиомиопатии является интоксикация химическими соединениями, химиопрепаратами и некоторыми противоопухолевыми антибиотиками [6]. Кардиотоксичность является очень редким осложнением при лечении ЦФ [4]. Она проявляется в виде тахикардии, одышки, острого миоперикар-дита; в отдельных случаях развивается тяжелая сердечная недостаточность, связанная с геморрагическим миокардитом и некрозом миокарда [3]. При использовании высоких доз ЦФ кардиотоксичность является лимитирующим видом его токсичности и может изредка приводить к летальному эффекту. На вскрытии обнаруживают некротизированные мышечные клетки, диас-тазрезистентное окрашивание PAS и внутриклеточные включения фибрина, диффузное кровоизлияние в миокард с дегенерацией и некрозом сердечной мышцы, микротромбы, образованные фибрином (иногда фибрином и тромбоцитами), вышедшие из сосудов эритроциты и фибриновые тяжи в межклеточном пространстве, ге-
моррагическую гибель кардиомиоцитов и интерстици-альныИ отек [17, 20, 40].
Предполагается, что первичное поражение эндотелия ведет к интерстициальному отеку и, вторично, к поражению кардиомиоцитов. Следует также учесть, что ЦФ, входя в широко распространенные комбинации с обладающими выраженноИ кардиотоксичностью ант-рациклинами, может способствовать проявлению этого побочного эффекта [33]. И наоборот, предварительное введение антрациклина усиливает кардиотоксичность ЦФ [23]. Однако до настоящего времени немного известно о возможных механизмах кардиотоксичности ЦФ [35]. На модели перфузии изолированного кроличьего сердца проявлялось кардиотоксическое деИствие метаболита ЦФ, хлороацетальдегида [26]. Введение ЦФ в высоких дозах крысам сопровождалось уменьшением миокардиальноИ митохондриальноИ респираторноИ функции и ферментативноИ активности в респираторноИ цепи, увеличением содержания в миокарде ацетил-холина и норэпинефрина, что позволяет предположить, что индуцированная ЦФ кардиотоксичность тесно связана с митохондриальноИ дисфункциеИ, а изменения в автономноИ нервноИ системе сердца могут иметь отношение к этоИ дисфункции [21]. В доступноИ нам литературе мы не обнаружили сведениИ о кардиотоксичности низких доз ЦФ, проявляющеИся у онкологических пациентов или животных с опухолями.
В миокарде мышеИ с нелеченноИ лимфомоИ БЬ4 нами выявлены изменения, соответствующие морфо-логическоИ картине вторичноИ застоИноИ миокардио-патии, развившеИся на фоне острого лимфобластного леИкоза. При этом кардиомиоциты увеличивались в размерах, их цитоплазма неравномерно и весьма слабо окрашивалась эозином, поперечнополосатая исчер-ченность отсутствовала. Ядра кардиомиоцитов также были крупными овальными, содержимое ядер — ги-перхромным, а ядрышек — гипохромным. Между кар-диомиоцитами выявлялся диффузныИ интерстициаль-ныИ фиброз с умеренно выраженноИ лимфоцитарноИ инфильтрациеИ соединительнотканных прослоек, обнаруживались бластные и лимфобластные опухолевые клетки крупных размеров с полиморфными ядрами. Количество кровеносных капилляров в межмиокарди-альноИ строме было небольшим, но все они были полнокровны.
Однократное применение ЦФ препятствовало проникновению клеток лимфомы в миокард, но на 14-И и 17-И дни выявлялась морфологическая картина острого лекарственного миокардита. При этом волокна кардиомиоцитов набухали и увеличивались в размерах, цитоплазма кардиомиоцитов неравномерно и весьма слабо окрашивалась эозином, а поперечнополосатая исчерченность не прослеживалась. Ядра были увеличены в размерах и чаще всего имели овальную форму, их хроматин был базофильным, а ядрышки — гипохромными. Между кардиомиоцитами выявлялся выраженныИ отек соединительнотканных прослоек, вследствие чего они расширялись. В межмиокардиаль-ноИ строме обнаруживался воспалительныИ инфильт-
рат, состоящий из лимфоцитов и единичных полиморфно-ядерных лейкоцитов. Количество кровеносных капилляров в строме возрастало, они были резко полнокровны.
Применение ЛБКЯ после цитостатика хотя и тормозило развитие патоморфологических изменений, но на 14-й день выявлялись признаки умеренно выраженного лекарственного миокардита.
На 14-й и 17-й дни эксперимента у мышей с лим-фомой, получивших ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ, выявлялись лишь минимальные проявления острого токсического миокардита. Большинство волокон кардиомиоцитов имело нормальные размеры, цитоплазма клеток равномерно и весьма интенсивно окрашивалась эозином, четко выявлялась поперечнополосатая исчерченность. Между кардиомиоцитами практически отсутствовал отек соединительнотканных прослоек, в межмиокар-диальной строме обнаруживались только единичные лимфоциты. Количество кровеносных капилляров в строме было несколько повышенным, и они были полнокровны.
Таким образом, генерализация лимфомы ББ4 распространяется на миокард. ЦФ даже при однократном применении в невысокой дозе препятствует проникновению в миокард клеток лимфомы и уменьшению признаков вторичной миокардиопатии, но индуцирует развитие острого лекарственного миокардита. ЛБКЯ на фоне действия ЦФ оказывает умеренное кардиопротек-тивное действие, защищая кардиомиоциты от повреждения и обеспечивая снижение выраженности острого лекарственного миокардита. Сочетание ЛБКЯ+ЛАКТ усиливает защитный эффект ЛБКЯ, сохраняя кардиомиоциты и соединительнотканную строму миокарда от медикаментозного повреждения, сводит до минимума проявления токсического миокардита.
Исследование клеток крови мышей показало, что применение ЛБКЯ+ЛАКТ на фоне ЦФ способствовало снижению угнетающего эффекта ЦФ на кислородный метаболизм фагоцитирующих клеток. Зимозан-индуцированное образование кислородных радикалов гранулоцитами крови лейкозных мышей возросло в 4,3 раза по сравнению с таковым у лейкозных мышей, получавших только ЦФ (рис. 3).
Методом витальной компьютерной фазовой цитометрии показано, что развитие мышиной лимфомы ББ4 без лечения и при применении ЦФ ведет к изменению фазового профиля и характера поверхности Т-лимфоцитов крови (рис. 4). Фазово-интерференционные профили и характер поверхности лимфоцитов мышей, леченных ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ, и интактных животных к этому сроку были практически идентичны (рис. 4, 1С и 4, 4С) и значительно отличались от таковых в группе КРО (рис. 4, 2С) и у животных, получавших ЦФ (рис. 4, 3С). Морфометрически выявлена четкая тенденция к нормализации средних оптико-геометрических параметров (диаметр и высота) популяции Т-лимфоцитов животных, леченных сочетанием ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ. При этом на уровне ин-тактного контроля сохранялось процентное содержа-
Рис. 3. Образование активных кислородных радикалов гранулоцитами крови мышей с лимфомой ЕБ4: КРО — контроль роста опухоли; ЦФ — циклофо-сфамид; ЛИЗ — ЛБКЯ (лизоцим белка куриного яйца); ЛАКТ — лактулоза
Рис. 4. Прижизненные фазово-интерференционные портреты лимфоцитов крови мышей на 17-й день после перевивки лимфомы ББ4:
А — топограмма; В — трехмерное изображение; С — фазовый профиль клетки; 1 — интактные лимфоциты; 2 — КРО; 3 — ЦФ; 4 — ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ
ние малых лимфоцитов, тогда как применение одного ЦФ приводило к исчезновению этих клеток из циркуляторного русла.
Исследование микрофлоры толстой кишки мышей (рис. 5) выявило угнетение анаэробных представителей эубиоза в группе не получавших лечение мышей с опухолью и усугубление их дефицита при применении ЦФ. Сочетание ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ обеспечивало повышение уровня бифидо- и лактобактерий по сравнению с группой ЦФ с 101-2 до 106 КОЕ/г и с 103 до 107 КОЕ/г соответственно.
С целью изучения влияния препаратов и их сочетаний на противоопухолевый иммунитет использовали метод локального адоптивного переноса противоопухолевой резистентности клетками селезенки, выделен-
ными от мышей-доноров сравниваемых групп. Лечение мышей-доноров начинали в день 1 и забивали для переноса клеток селезенки в день 12. Как видно из данных табл. 2, все контрольные мыши, которым не вводили донорских селезеночных клеток (группа 1), погибли в результате роста опухоли, средняя продолжительность их жизни (СПЖ) составила 20,7 сут. У мышей-реципиентов, которым инокулировали опухолевые клетки ЕЬ4 в смеси с селезеночными клетками, выделенными от нелеченных доноров с лимфомой ЕЬ4 (группа 2), наблюдали некоторое торможение опухолевого роста (СПЖ = 34,8 сут). В этой группе опухоль развилась у 5 из 6 мышей. Введение донорам ЦФ (группа 3) практически не повлияло на активность их селезеночных клеток: опухоль также развилась у 5 из 6 мышей-реципиентов, но СПЖ несколько возросла и составила 41,2 сут. В то же время ежедневное перораль-ное введение опухолевым донорам ЛБКЯ (группа 4) или ЛБКЯ+ЛАКТ (группа 5) после однократной инъекции ЦФ привело уже через 12 сут к резкому увеличению противоопухолевой активности, проявляемой их селезеночными клетками: при адоптивном переносе опухоль развилась лишь у 1 из 6 и 2 из 6 реципиентов соответственно.
Таблица 2
Результаты теста локального адоптивного переноса у мышей
№ Доноры Реципиенты
гр. л Инокулят Частота развития опухоли,% Сроки гибели реципиентов, сут
1 18 6 ЕЬ4 6(100) 18,19,19,19,21,28
2 КРО б ЕЬ4+ КСД 5(83) 19,23,31,42,59
3 ЦФ 6 ЕЬ4+ КСД 5(83) 27,39,44,45,51
4 ЦФ+ЛБКЯ 6 ЕЬ4+ КСД 1(17) 34
5 ЦФ+ЛБКЯ+ЛАКТ 6 ЕЬ4+ КСД 2(33) 34,34
п - число мышей. КСД - клетки селезёнки доноров. По срокам гибели реципиентов различия достоверны между группами 2—>1, 3—>1, 5—>1,5—>2, 5—>3.
По частоте развития опухоли различия достоверны между группами 4—>1, 5—>1, 4-»2,4-»3.
Рис. 5. Влияние циклофосфамида и его сочетания с лизоцимом и лактулозой на содержание бифидо-и лактобактерий в фекалиях мышей с лимфомой ЕЬ4 (17-е сутки от перевивки опухоли):
КРО — контроль роста опухоли; ЦФ — циклофо-сфамид; ЛИЗ — ЛБКЯ (лизоцим белка куриного яйца); ЛАКТ — лактулоза
Таким образом, на модели мышиной лимфомы ЕЬ4 выявлена принципиальная возможность применения сочетания ЛБКЯ с ЛАКТ для повышения противоопухолевой резистентности организма и снижения токсического действия цитостатической терапии. Длительное пероральное применение ЛБКЯ и особенно его сочетания с ЛАКТ на фоне действия ЦФ может оказывать положительное влияние на противоопухолевую резистентность организма и усиливать противоопухолевый эффект цитостатика. Это может быть связано с увеличением количества иммунокомпетентных клеток как непосредственно в месте развития лимфомы в брюшной полости, так и в лимфоидных органах. Поскольку в изученных условиях ЦФ, в соответствии с данными литературы, наряду с прямым действием на опухолевые
клетки избирательно угнетает супрессорные клетки, можно предположить, что вводимый перорально ЛБКЯ в высокой дозе, особенно в комбинации с лактулозой, способствует более эффективному созреванию ответственных за отторжение опухоли иммунокомпетентных клеток — макрофагов и Т-киллеров.
Механизмы положительного действия длительного перорального введения высоких доз ЛАКТ и ЛБКЯ на организм мышей, получивших однократно относительно невысокую дозу ЦФ в ранней стадии развития опухоли, требуют дальнейшего изучения.
ВЫВОДЫ
1. Длительное введение через рот ЛАКТ в сочетании с ЛБКЯ усиливает противоопухолевую активность однократно введенного ЦФ в полусингенных условиях.
2. Усиление противоопухолевой активности цик-лофосфамида ЛАКТ в сочетании с ЛБКЯ коррелирует с увеличением содержания макрофагов в брюшной полости и предотвращением развития атрофических изменений в селезенке; в тесте локального адоптивного переноса выявляются селезеночные клетки, способные подавить развитие лимфомы ЕЬ4; сохранением способности гранулоцитов крови к зимозан-индуци-рованному образованию кислородных радикалов; сохранением содержания и средних оптико-геометрических параметров малых лимфоцитов крови.
3. Применение ЛАКТ в сочетании с ЛБКЯ препятствует генерализации лимфомы в ткани сердца и оказывает кардиопротективное действие, сводя до минимума проявления вызванного ЦФ токсического миокардита.
4. Применение ЛАКТ в сочетании с ЛБКЯ препятствует генерализации лимфомы в ткани стенки кишечника, ускоряет восстановление поврежденного ЦФ эпителия тонкой кишки ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани.
5. Применение ЛАКТ в сочетании с ЛБКЯ ускоряет восстановление уровней бифидо- и лактобактерий в содержимом толстой кишки мышей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабакова С. В., Василенко И. А., Щербакова Э. Г., Липатов ^^Использование нового подхода в оценке влияния биологически активных веществ на клеточные факторы естественного иммунитета // Аллергология и иммунология. — 2001. — Т. 2. — С. 20.
2. Буторова Л. И., Калинин А. В. Значение лакту-лозы в регуляции кишечной микрофлоры // Клинические перспективы гастроэнтерологии и гепатологии. — 2002. — №6. — С. 21-26.
3. ВИДАЛЬ СПЕЦИАЛИСТ: Справочник «Онкология». — М.: АстраФармСервис, 2003. — С. 480.
4. Гарин А. 'М., Хлебное А. В. Справочник практической химиотерапии опухолей. — М.: Росмэн, 1995.
— С. 309.
5. Гублер Е. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. — Л.: Медицина, 1973. — 141 с.
6. Пальцев М. А., Аничков Н. М. Патологическая анатомия. — М.: Медицина, 2000. — Т. 2., Ч. I. — С. 760.
7. Пименов A. A., Бархоткина М. Ф., Бухман В. М. и др. Специфичность Т-клеток памяти, иммунных к сингенной лимфоме мышей // Иммунология. — 1985. — №3. — С. 26-30.
8. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. — М.: Медицина, 1976. — 295 с.
9. Храмцов А. Г. (под ред.) Российская лактулоза — XXI век. Научные основы, производство и использование: Сборник статей. — М.: МИИТ, 2000. — С. 110.
10. Щербакова Э. Г., Бухман В. М., Исакова Е .Б. и др. Влияние лизоцима на рост мышиной лимфомы и противоопухолевую активность циклофосфамида // Антибиотики и химиотерапия. — 2002. — Т. 47, № 11. — С. 3-8.
11. Щербакова Э. Г., Ким В. В., Липатов Н. Н. и др. Добавка к напитку и способ производства напитка: Патент РФ № 2217009, Бюл. № 33 от 27.11.2003 г.
12. Щербакова Э. Г., Щербаков И. Т., Растунова Г. А., Ешилев Э. 'М. Протективный эффект лактусана и его сочетания с лизоцимом на модели алкогольной миокардиопатии. — Актуальные проблемы морфологии: Сб. науч. трудов. — Красноярск: КрасГМА, 2004.
— С. 288-289.
13. Ben-Efraim S. Immunomodulating anticancer alkylating drugs: Targets and mechanisms of activity // Curr. Drug Targ. — 2001. — Vol. 2. — Р. 197-212.
14. Berge Henegouwen G. P., van der Werf S. D., Ruben A. T. Effect of Long Term Lactulose Ingestion on Secondary Bile Salt Metabolism in Man: Potential Protective Effect of Lactulose in Colonic Carcinogenesis // Gut. — 1987. — Vol. 28, No. 6. — Р. 675-680.
15. Biasco G., Paganelli G. M. European Trials on Dietary Supplementation for Cancer Prevention // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1999. — Vol. 889. — Р. 152-156.
16. Bierman P. J., Abe F., Buyukberber S. et al. Partial review of immunotherapeutic pharmacology in stem cell transplantation // In vivo. — 2000. — Vol. 14, No. 1. — Р. 221-236.
17. Buja L. M., Ferrans V. J., Graw R. G. Jr. Cardiac pathologic findings in patients treated with bone marrow transplantation // Hum. Pathol. — 1976. — Vol. 7, No. 1.
— Р. 17-45.
18. Challa A., Rao D. R., Chawan C. B., ShackelfordL. Bifidobacterium Longum and Lactulose Suppress Azoxy-methane-Induced Colonic Aberrant Crypt Foci in Rats // Carcinogenesis. — 1997. — Vol. 18, No. 3. — Р. 517-521.
19. Gorer P. A. Antibody response to tumor inoculation in mice with special reference to partial antibodyes // Cancer Res. — 1947. — Vol. 7, No. 10. — Р. 634-641.
20. Gottdiener J. S., Appelbaum F. R., Ferrans V. J. et al. Cardiotoxicity associated with high-dose cyclophosphamide therapy // Arch. Int. Med. — 1981. —Vol. 141, No. 6. — P. 758-763.
21. Hanaki Y., Sugiyama S., Akiyama N., Ozawa T. Role of the autonomic nervous system in cyclophosphamide-induced heart mitochondrial dysfunction in rats // Biochem. Int. — 1990. — Vol. 21, No. 2. — P. 289-290.
22. Hennigan T. W., Sian M., Matthews J., Allen-Mersh T. G. Protective Role of Lactulose in Intestinal Carcinogenesis // Surg. Oncol. — 1995. — Vol. 4, No. 1.
— P. 31-34.
23. Isberg B., Paul C., Jonsson L., Svahn U. Myocardial toxicity of high-dose cyclophosphamide in rabbits treated with daunorubicin // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1991. — Vol. 28, No. 3. — P. 171-180.
24. Kaur J. S. Lactulose is sorbitol for treatment of obstipation in hospice programs // Reply. Mayo Clin. Proc.
— 2000. — Vol. 75, No. 5. — P. 541-541.
25. Kim J. P. Surgical Results in Gastric Cancer // Semin. Surg. Oncol. — 1999. —Vol. 17, No. 2. — P. 132-138.
26. Loqueviel C., Malet-Martino M., Martino R. A 13C NMR study of 2-(13)C-chloroacetaldehyde, a metabolite of ifosfamide and cyclophosphamide, in the isolated perfused rabbit heart model. Initial observations on its cardiotoxicity and cardiac metabolism // Cell Mol. Biol. — 1997. — Vol. 43, No. 5. — P. 773-782.
27. Nio Y., Nagami H., Tamura K. et al. Multi-Institutional Randomized Clinical Study on the Comparative Effects of Intracavital Chemotherapy Alone Versus Immunotherapy Alone Versus Immunochemotherapy for Malignant Effusion // Br. J. Cancer. — 1999. — Vol. 80, No. 5-6. — P. 775-785.
28. Ohwada S., Ikeya T., Yokomori T. et al. Adjuvant Immunochemotherapy with Oral Tegafur/Uracil Plus PSK in Patients With Stage II or III Colorectal Cancer: a Randomised Controlled Study // Br. J. Cancer. — 2004. — Vol. 90, No. 5. — P. 1003-1010.
29. Owen R. W. Faecal Steroids and Colorectal Carcinogenesis // Scand. J. Gastroenterol. Suppl. — 1997.
— Vol. 222. — P. 76-82.
30. Ponz de Leon, Roncucci L. Chemoprevention of Colorectal Tumors: Role of Lactulose and of Other Agents // Scand. J. Gastroenterol. Suppl. — 1997. — Vol. 222. — P. 72-75.
31. Sakamoto J., Kato J., Yasue M. Surgery and Multidisciplinary Treatment for Colorectal Cancer // Gan To Kagaku Ryoho. — 1998. — Vol. 25, No. 2. — P. 208-215.
32. Sakamoto J., Teramukai S., Watanabe Y., Hayata Y., Okayasu T., Nakazato H., Ohashi Y. MetaAnalysis of Adjuvant Immunochemotherapy Using OK-432 in Patients with Resected Non-Small-Cell Lung Cancer // J. Immunother. — 2001. — Vol. 24, No. 3. — P. 250-256.
33. Sanz M. N., Valcarce P. J., Broto E. P. et al. Enhancing factors in the cardiotoxicity of anthracyclines // An. Esp. Pediatr. — 1990. — Vol. 32, No. 1. — P. 11-14.
34. Sato Y., Kondo M., Kohashi S. et al. Randomized Controlled Study of Immunochemotherapy with OK-432 after Curative Surgery for Gastric Cancer // J. Immunother. — 2004. — Vol. 27, No. 5. — P. 394-397.
35. Schimmel K. J., Richel D. J., van den Brink R. B., Guchelaar H. J. Cardiotoxicity of cytotoxic drugs // Cancer Treat. Rev. — 2004. — Vol. 30, No. 2. — P. 181-191.
36. Toge T. Effectiveness of Immunochemotherapy for Gastric Cancer: a Review of the Current Status // Semin. Surg. Oncol. — 1999. — Vol. 17, No. 2. — P. 139-143.
37. Van Berge Henegouwen G. P., van der Verf
S. D. J., Ruben A. T. Effect of longterm lactulose ingestion on secondary bile salt metabolism in man: potential protective effect of lactulose in colonic carcinogenesis // Gut.
— 1987. — Vol. 28. — P. 675-680.
38. Watanabe M., Nishida O., Kunii Y. et al. Randomized Controlled Trial of the Efficacy of Adjuvant Immunochemotherapy and Adjuvant Chemotherapy for Colorectal Cancer, Using Different Combinations of the Intracutaneous Streptococcal Preparation OK-432 and the Oral Pyrimidines 1-Hexylcarbamoyl-5-Fluorouracil and Uracil/Tegafur // Int. J. Clin. Oncol. — 2004. — Vol. 9, No. 2. — P. 98-106.
39. Winn H. J. Immune mechanisms in homotransplantation. II. Quantitative assay of the immunologic activity of lymphoid cells stimulated by tumor homografts // J. Immunol. — 1961. — Vol. 86. — P. 228-239.
40. Yano S., Asai O., Kuraishi Y. et al. Myocardial hemorrhage due to high-dose cyclophosphamide treatment in a case of non-Hodgkin’s lymphoma // Rinsho Ketsueki. — 1993. — Vol. 34, No. 3. — P. 373-377.
