CC BY
27
Вюник Дшпропетровського унiверситету. Бюлопя, екологш. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2016. 24(2), 332-337.
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
doi :10.15421/011643
www.ecology.dp.ua
УДК 579.266:579.222.2
Використання фумарату бактерiями Desulfuromonas sp.
О. Чайка, Т. Перетятко, С. Гудзь, А. Галушка
Львiвський нацюнальний утверситет iMem 1вана Франка, Львiв, Украгна
Дослщжено використання фумарату бактершми Desulfuromonas sp. за р1зних умов культивування та сульфщогенну активн1сть мжрооргатзмш у середовищах з елементною с1ркою та р1зними донорами електротв. Найвищу сульфщогенну активн1сть бакте-рш Desulfuromonas sp. виявлено у середовищ1 з натрш лактатом i натрш п1руватом. За наявносп елементно! с1рки бактери найкра-ще ростуть у середовищi з натрiй лактатом, малатом i фумаратом. Бактери Desulfuromonas sp. за вщсутносп у середовищi елементно! сiрки здатнi використовувати фумарат як донор i акцептор електрошв. За росту бактерш у середовищi з фумаратом у культуральнш рiдинi нагромаджуегься сукцинат i в малш юлькосп - ацетат. Наявнiсть останнього, можливо, пов'язана з особли-востями функцюнування циклу трикарбонових кислот у бактерш роду Desulfuromonas. Одночасне внесення двох акцепторгв елек-тронш (фумарату та елементно! сiрки) супроводжувалось iнгiбуванням аркоредукщ!. За внесення у середовище з фумаратом дода-ткового джерела карбону (натрш лактату) та акцептора електронш (елементно! сiрки) спостершали зростання сулъфiдогенно! акгивностi у п'ять разв.
Ключоа слова: сiрковiдновлювалънi бактерй; сукцинат; фумаратредуктаза; пдрогеназа; фумаратне дихання
The main goal of the work was to study the utilization of fumarate by sulfur-reducing bacteria Desulfuromonas sp. under different growth conditions and accumulation of hydrogen sulfide by bacteria in the media with sulfur and different electron donors. Sulfur-reducing bacteria Desulfuromonas sp., isolated from soil in Yazivske sulfur deposit, were used in the reasearch. Bacteria were grown in the medium Postgate C without sulfates. The content of hydrogen sulfide was determined by formation of methylene blue. The content of organic acids (fumarate, succinate, lactate, acetate) was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The biomass of cells was determined by the photoelectrocolorymetry method using KFK-3. The highest level of accumulation of hydrogen sulfide by bacteria Desulfuromonas sp. was found in media with sodium lactate and sodium pyruvate. The maximal concentration of hydrogen sulfide was 1.9 mM. Maximal accumulation of biomass was observed in the media with malate, lactate and fumarate with the presence of elemental sulfur. Sulfur-reducing bacteria Desulfuromonas sp. are able to utilize fumarate as an electron donor and acceptor in the absence of elemental sulfur in the medium. After the incubation of Desulfuromonas sp. in the medium with fumarate chromatographic analysis of culture liquid has shown that fumarate is converted to succinate and small quantities of acetate The presence of acetate is, probably, due to the particularaties of the functioning of citric acid cycle in bacteria of the genus Desulfuromonas. Consequently, the results indicate that the fumarate serves as a donor and acceptor of electrons.The simultaneous introduction of two electron donors - fumarate and elemental sulfur -was accompanied by inhibition of sulfur reduction. After an additional source of carbon (sodium lactate) and electron acceptor (elemental sulfur) was added to the medium with fumarate a fivefold increase of sulfidogenic activity was observed. Thus, regulation of respiration in bacteria Desulfuromonas sp. is directed to the primary utilization of the most energetically favorable electron acceptors.
Keywords: reducing bacteria; succinate; fumarate reductase; hydrogenase; fumarate respiration
Львiвcький нацюнальний утверситет im. 1вана Франка, вул. Грушевського, 4, Львiв, 79005, Украгна Ivan Franko National University of Lviv, Hrushevskoho Str. 4, Lviv, 79005, Ukraine Tel.: +38-067-336-47-44. Е-mail: [email protected]
Utilization of fumarate by sulfur-reducing bacteria Desulfuromonas sp.
O. Chayka, T. Peretjatko, S. Gudz, A. Halushka
Ivan Franko National University of Lviv, Lviv, Ukraine
Вступ
Бактери здшснюють анаеробне дихання, за якого за-мють кисню термшальними акцепторами електрон1в слу-гуютъ фумарат, ттрат, подасульфщ чи iншi окиснет не-органiчнi та органiчнi сполуки (Kroger et al., 2002). Для бшьшосп мiкроорганiзмiв використання фумарату як акцептора електротв при диханнi - лише додатковий механiзм, що дозволяе здобути бшьшу к1лък1стъ енергй' за анаеробних умов (Lancaster and Simon, 2002). Фумаратне дихання характерне для багатъох факулътативно анаероб-них (Escherichia coli, Proteus rettgeri, Salmonella sp., Klebsiella sp.) i обллатно-анаеробних бактерш (Clostridium formoaceticum, Desulfovibrio gigas, Propionibacterium sp., Vibrio succinogenes, Wolinella succinogenes) (Hedderich et al., 1999).
Для сульфатвщновлювальних бактерш ключовий фермент фумаратного дихання - фумаратредуктаза (сукци-нат : мноноксидоредуктаза) (EC 1.3.5.1), яка може вико-нувати функцш сукцинатдепдрогенази щд час окиснення сукцинату, а також х1нон: фумаратредуктази щд час фу-маратного дихання (Lemos, 2002; Zaunmüller et al., 2006).
Lancaster and Simon (2002) показали, що фумаратреду-ктаза такого типу наявна у бшьшосп сульфат- i арковщ-новлювальних бактерiй, зокрема, Desulfovibrio desulfuri-cans, D. vulgaris i в шших протеобактергях. У бактерш Geobacter sulfurreducens видшено фермент, який дае як термiнальна фумаратредуктаза та сукцинатдепдрогеназа у циклi трикарбонових кислот (Butler et al., 2006).
Gebhardt et al. (1985) показали, що арковщновлюва-льш бактери De sulfuromonas acetoxidans мстять сукци-натдепдрогеназу (EC 1.3.99.1), яка за наявносп НАДН+, може вщновлювати фумарат до сукцинату. Використо-вуючи базу даних NCBI (www.ncbi) у бактерiй Desul-furomonas acetoxidans DSM 684, вдентифжували амшо-кислотну послiдовнiстъ фумаратредуктази (чи сукцинатдепдрогенази), яка мае подiбнiстъ iз фумаратредуктазою W. succinogenes на 28%, Desulfovibrio sp. - 29%, Geobacter sulfurreducens - 82%.
Найкраще досладжено механизм вщновлення фумарату мезофшьними бактер1ями W. succinogenes, як1 ви-користовують молекулярний пдроген або формiат як донор електронiв (Hedderich et al., 1999). У вщновлет фумарату беруть участь два штегроват в мембрану ферменти: фумаратредуктаза та пдрогеназа (чи формiат-пдрогеназа). Щд час окиснення пдрогену чи формiату електрони транспортуються вщ пдрогенази через цито-хром b i х1нон до фумаратредуктази, створюючи електрохiмiчний градiент (Kroger et al., 2002).
Шляхи вщновлення фумарату в арковщновлювальних бактерiй роду Desulfuromonas не з'ясоваш, тому мета ще! статп - з'ясувати деяю закономiрностi використання фумарату арковщновлювальними бактер1ями Desulfuromonas sp.
Матерiал i методи дослiджень
У дослiдженнi використали сiрковiдновлювалъш бактерй' Desulfuromonas sp., видалещ з територй' Яз1всько-го аркового родовища (Chayka et al., 2010). Бактерй' ви-рощували у модифкованому середовищi Постгейта С
(г/л): KH2PO4 - 0,5, NH4Cl - 1,0, CaCl2 • 6H2O - 0,06, MgCl2 • 6H2O - 0,05, натрш лактат (40%) - 12 мл, дажд-жовий екстракт - 1,0, натрш лимоннокислий - 0,3, аскорбшова кислота - 1,0, елементна сiрка - 1,0, вода дис-тильована до 1 л; рН = 7,5 (Postgate, 1984). Середовище стеритзували за 1 атм протягом 30 хв i розливали у пробiрки (25 мл), закривали стерильними гумовими корками, так щоб у них не залишилося повпря. Бiомасу кллин визначали турб1диметрично на фотоелектро-колориметр, використовуючи КФК - 3 (X = 340 нм, кювета 3 мм). Вмст ггдроген сульфщу визначали за утворен-ням метиленово! синi (Sugiyama, 2002).
Вмiст оргатчних кислот (фумарату, сукцинату, лакта-ту, ацетату) визначали методом високоефективно! рщинно! хроматографй' (HPLC). Хроматографiчна система складалася з двох помп VarianProStar 210, хромато-графiчноl колонки Polaris 5 C18-A, 250 х 4,6 мм у модулi колонок VarianProStar 500, спектрофотометричного детектора з фотодюдною матрицею VarianProStar 335. Як рухому фазу використовували 0,2% розчин трифтор-оцтово! кислоти (AppliChem) у вода (отриманш iз допомо-гою системи очищення води AdronaCrystalCreBio з уль-трафшьтром Milipore). Хроматографiчне роздiлення здiй-снювали у 0,2% розчинi трифтороцтово! кислоти протягом 8 хв. Потк розчинника становив 1,5 мл/хв (Kerem et al., 2004). Хроматограми записували за довжини хвилi 212 нм. Температура колонки становила 35 °С.
Результата представлет як середне значення з поправкою на стандартну похибку (М ± m). Досл!ди повто-рювали тричi з трьома паралельними постановками для кожного варiанта. Статистичне опрацювання результатгв проводили, використовуючи програму Origin 6.1.
Результати та ix обговорення
У попереднiх дослгдженнях ми встановили, що бактерй' Desulfuromonas sp. добре ростуть у середовищi з фумаратом за в;дсутност1 елементно! сiрки (Chayka et al., 2010). При цьому фумарат повнiстю забезпечуе клiтини органiчним карбоном. За наявносп елементно! арки Desulfuromonas sp. як джерело карбону використовують етанол, натрiй ацетат, натрш лактат, натрш труват, сук-цинат, фумарат, малат. Дослгдження сульфадогенно! активност1 бактерiй Desulfuromonas sp. у середовищах з елементною сiркою та рiзними донорами електрон1в показало, що максимальне нагромадження ггдроген суль-фщу вiдбуваеться на 6-12-й добi культивування. Най-вищу сульфгдогенну активнiсть бактерш Desulfuromonas sp. виявлено у середовищi з натрiй лактатом i натрш шруватом (рис. 1). Максимальна концентращя г^дроген сульфиду становила 1,9 мМ. Бактерй Desulfuromonas sp. найкраще ростуть у середовищi з натрiй лактатом, мала-том i фумаратом за наявносп елементно! срки (рис. 2).
Дослвджуват бактерй можуть використовувати фумарат як акцептор електрошв i, одночасно, як джерело карбону. Тому в наступних експериментах дослгдили деяю закономiрностi використання фумарату бактерiями Desulfuromonas sp. за наявносп у середовищi додаткових донор1в i акцепторiв електрошв.
За анаеробного дихання бактерй використовують ак-цептори електронiв iз рiзними значенням окисно-
виновного потенщалу. Значения окисно-в1дновного потенц1алу термшального акцептора елекгрон1Б визначае мюце виходу електрона з дихального ланцюга, а отже, кшьксть АТФ, що утворюеться в результат окисного фосфорилювання. Чим вище значення окисно-в1дновного потенщалу акцептора, тим бшьше енергп отримуе мжро-оргатзм унаслвдок дихання. У природних умовах, де за-звичай одночасно присутт декшька можливих акцепгорiБ електрошв, факультативнi анаероби спочатку використо-вують найвигiдиiшi з них (iз найвищими значеннями
окисно-в1дновного потенцiалу), облiгатнi - лише низько-потенцiальнi акцептори. Послвдовтсть використання рiзних акцепторiв електронiБ у кожного мжрооргатзму детермiиоваиа генетично, контролюеться складними ре-гуляторними мехаиiзмамн (Kozlova, 2008). Окисно-вiдиовний потенцiал окисно-вщновно! пари фумарат / сукцинат вищий за окисно-вiдиовний потенцiал окисно-вщновно! пари So/HS-, тому за одночасно! наявносп у середовищi фумарату та елементно! сiрки бактерй' спочатку вщновлювали фумарат.
S 0,4-
М 0,3-
иатрiй лактат
иатрiй натрш сукцинат малат ацетат пiруват
Донори електроиiБ
фумарат
Рис. 1. Нагромадження бюмаси бактерiями Desulfuromonas sp. за наявносп у середовиии елементно! счрки та рiзних донор1в електрон1в (M ± m, n = 3)
2,0-
1,5-
1,0-
о
а
«
С 0,5
0,0
- иатрiй лактат етанол
натрш ацетат натрш труват сукцинат
- малат
—►— фумарат
3 5
Час, доба
Рис. 2. Нагромадження пдроген сульфвду бакгершчи Desulfuromonas sp. за наявносп у середовини елементно! счрки та рiзних донор1в електрон1в (M ± m, n = 3)
Хроматоrрафiчний аиалiз культурально! рiдини пiсля вирощуваиня Desulfuromonas sp. у середовищi з фумаро-вою кислотою показав, що бактерй' нагромаджують сукцинат i, в незначних клькостях, ацетат (рис. 3). За цих умов у середовищi виявлено 0,9 г/л ацетату, як пром1жно! сполуки окисненя фумарату у цикл трикарбонових кислот (ЦТК). Бактерй' D. acetoxidans здшснюють анаеробне окиснення ацетату за учасп модифшовашго ЦТК (Thauer, 1988). Ц1 мiкроорrаиiзми мтстять сукцинш-КоА: ацетат-КоА-траисферазу замiсть ацетил-КоА-синтетази та сукци-нiл-КоА-сиитетази, як1 е у бшьшосп аеробних i анаероб-них мiкрооргаиiзмiв (Thauer, 1988). Сукцинш-КоА: аце-
тат-КоА-трансфераза забезпечуе утворення сукцинату з сукцинiл-КоА i активацiю ацетату (Thauer, 1988; Gebhardt et al., 1985). За внесення у середовище культивуваиия фумарату та елементно! арки бактерй' вщновлюють фумарат до сукцинату. За цих умов вмют пдроген сульфщу незначний (0,15 мМ) (рис. 4). Отже, одночасне внесення двох акцепторiв елекIронiв, фумарату та елементно! арки, супроводжуеться iнгiбувaииям сiркоредукцi!.
Бактерй D. acetoxidans окиснюють лактат до ацетату, який перетворюеться через ацетил-КоА у модифшо-ваному ЦТК до CO2 (Gebhardt et al., 1985; Thauer, 1988). У процеа росту бактерш Desulfuromonas sp. у середовищ1
з натрш лактатом 1 елементною аркою спостерггасться повне використання лактату та нагромадження ацетату в концентраци 1 г/л. За наявносп у середовищ1 натрш лактату (як донора електронв) 1 фумарату тсля 14 дб куль-тивування бактери Desulfuromonas .р. нагромаджують сукцинат (рис. 5) 1 в малих к1лькостях ацетат. За цих умов спостерпгаеться повне вщновлення фумарату до сукцина-
ту та повне використання лактату. Одержат результата вказують на те, що дослщжуван бактерii здатнi викори-стовувати фумарат як акцептор електронв за наявносп у середовищ лактату. Наявтсть мало! кшькосп ацетату, можливо, вказуе на те, що лактат окиснюеться до ацетату (пром1жний продукт), який перетворюеться через ацетил-КоА на ЦТК.
н о ч
о я и
'а
я я
о «
0-1-
Час, доба
Рис. 3. Використання фумарату (—■—), нагромадження сукцинату (—•—) та ацетату (—▲—) бактертми Desulfuromonas sp. (М ± т, п = 3)
6
5
4
3
2
Час, доба
Рис. 4. Використання фумарату (—■—), нагромадження сукцинату (—•—), ацетату (—▲—) та пдроген сульфвду (—♦—) бактертми Desulfuromonas sp. у середовиии з фумаратом 1 елементною с1ркою (М ± т, п = 3)
Хроматографiчний аналiз культурально! рщини тсля вирощування Desulfuromonas &р. у середовищi з фумаратом, натрiй лактатом i елементною сiркою показав, що бактери нагромаджують сукцинат i, в малих кшькостях, ацетат (рис. 6). За цих у мов вщбувасться повне вщнов-лення фумарату до сукцинату та повне використання лактату. Однак у середовищi iз фумаратом, натрiй лактатом i елементною сiркою бактери уп'ятеро бшьше про-дукують пдроген сульфщу, нж у середовищi iз фумаратом i елементною сркою (рис. 4 i 6).
Вщновлення фумарату мшрооргатзмами з викори-станням рiзних донор1в електронiв вщбувасться за учасп двох штегрованих у мембрану ферменпв - фумаратре-
дуктази та гздрогенази, як1 пов'язанi м1ж собою менахь ном (Hedderich ^ а1., 1999). Нагромадження сукцинату в результат! вщновлення фумарату свщчить про те, що бактери використовують фумарат як акцептор електрошв (Койоуа, 2008). За використання фумарату бактер1ями Desulfuromonas .р. як донора електрошв вщбувасться йо-го окиснення в циклi трикарбонових кислот до вуглекис-лого газу, при цьому у середовищi нагромаджусться не-значна юльюсть ацетату. Отримаш результати вказують на те, що дослщжуват бактери використовують фумарат як акцептор i як донор електрошв за анаеробних умов. Зазвичай у природних умовах одночасно виявляеться декшька потенцiйних акцептор1в електронiв (Койоуа,
2008). Мгкроорганзмам енергетично випдщше спершу ви-користати акцептори електрон1в i3 вищим окисно-вщнов-ним потенцiалом. Дослщження використання фумарату Desulfuromonas sp. за наявносп шших акцептор1в електро-
нв показало, що бактери спершу використовують акцептори електронв i3 вищим окисно-вщновним потенцiалом. Така властивiсть мiкроорганiзмiв - адаптивна вщповщь на мiнливi умови навколишнього середовища.
ts 'а
я я
о «
12
10
0-
4 8
Час, доба
8
6
4
2
Рис. 5. Використання фумарату (—■—), нагромадження сукцинату (—•—) та ацетату (—▲—) бактер1ями Desulfuromonas sp. у середовищ1 з фумаратом i натр1й лактатом (M ± m, n = 3)
10-
Э 6
еч 'Я й Он
н
я ^
я я
о «
4-
2-
"Т-20
0,8
0,6 «
0,4 ¡5
U
о а
.13 0,2 С
0,0
Доба
8
0
4
8
Рис. 6. Використання фумарату (—■—) та нагромадження сукцинату (—•—), ацетату (—▲—) та г1дроген сульф1ду (—♦—) бактер1ями Desulfuromonas sp. у середовищ1 з фумаратом, натрш лактатом (—▼—) 1 елементною с1ркою (M ± m, n = 3)
Висновки
Дослщжено сульфщогенну активтсть бактерш Desulfuromonas sp. у середовищах з елементною сiркою та рiз-ними донорами елекгронiв. Найвищу сульфщогенну актив-н1сть бактерiй Desulfuromonas sp. виявлено у середовищ1 з натрш лактатом i натрiй труватом. Бактери найкраще ростуть у середовищ1 з малатом, натрш лактатом i фумаратом за наявностi у середовищ1 елеменгао! сiрки.
Дослщження закономiрностей використання фумарату бактерiями Desulfuromonas sp. за рiзних умов куль-тивування показало, що за росту бактерш у середовищ1 з фумаратом у культуральнш рщит нагромаджуеться сукцинат i незначна кшьюсть ацетату. Наявтсть остан-нього, можливо, пов'язана з особливостями функцюну-вання циклу трикарбонових кислот у бактерiй роду
Desulfuromonas sp. ®yMapar y KoH^mpa^i 6 r/n npurai-nye cynb^igoreHHy aKTHBHicrb gocnig^yBaHHx 6aKTepiH. 3a BHeceHHa y cepegoBH^e 3 $yMaparoM gogamoBoro g^epena Kap6oHy (HaipiH naKrary) Ta a^emopa eneKipo-HiB (eneMeHTHOi cipKu) cnocrepiranu 3pocraHHH cynt^igo-reHHOi aKTHBHocri yn'mepo. TaKHM hhhom, peryn^ia gu-xaHHH y 6aKrepiH Desulfuromonas sp. cnpaMoBaHa Ha Te, ^o cnepmy BigHoBnroroTbca eHepreTHHHo HaHBHrigHimi aкцeптopн eneKipomB.
Ei6.ii<>i |)n(|>i'mii iiocii. liiniiii
Butler, J.E., Glaven, R.H., Esteve-Nunez, A., Nunez, C., Shelo-bolina, E.S., Bond, D.R., Lovley, D.R., Butler, J.E., 2006. Genetic characterization of a single bifunctional enzyme for fumarate reduction and succinate oxidation in Geobacter sulfurreducens and engineering of fumarate reduction in Geobacter metallireducens. J. Bacteriol. 188(2), 450-455.
Gebhardt, N.A.,Thauer, R.K., Linder, D., Kaulfers, P.-M., Pfennig, N., 1985. Mechanism of acetate oxidation to CO2 with elemental sulfur in Desulfuromonas acetoxidans. Arch. Microbiol. 141, 392-398.
Hedderich, R., Klimmek, O., Kroger, A., Dirmeier, R., Keller, M., Stetter, K.O., 1999. Anaerobic respiration with elemental sulfur and with disulfides. FEMS Microbiol. Rev. 22, 353-381.
Kerem, Z., Bravdo, B., Shoseyov, O., Tugendhaft, Y., 2004. Rapid liquid chromatography - ultraviolet determination of organic acids and phenolic compounds in red wine and must. J. Cromatogr. A. 1052, 211-215.
Kozlova, I.P., Radchenko, O.S., Stepura, L.G., Kondratyuk, T.O., Pilyashenko-Novokhatnyy, A.I., 2008. Geoximichna diyalnist mikroorganizmiv ta yiyi prykladni aspekty [The geochemical activity of microorganisms and its practical aspects]. Naukova Dumka, Kyiv (in Ukrainian).
Kröger, A., Biel, S., Simon, J., Gross, R., Unden, G., Lancaster, C., Roy, D., 2002. Fumarate respiration of Wolinella suc-cinogenes: Enzymology, energetics and coupling mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1553, 23-38.
Lancaster, C., Roy, D., Simon, J., 2002. Succinate: Quinone oxido-reductases from e-proteobacteria. Biochim. Biophys. Acta 1553, 84-101.
Lemos, R.S., Fernandes, A.S., Pereira, M.M., Gomes, C.M., Teixeira, M., 2002. Quinol:fumarate oxidoreductases and succinate:quinone oxidoreductases: Phylogenetic relationships, metal centres and membrane attachment. Biochim. Biophys. Acta 1553, 158-170.
Postgate, J.R., 1984. The sulfate-reducing bacteria. 2nd ed. Cambridge University, Cambridge.
Sugiyama, M., 2002. Reagent composition for measuring hydrogen sulfide and method for measuring hydrogen sulfide. United States Patent, №6340596.
Thauer, R.K., 1988. Citric-acid cycle, 50 years on modifications and an alternative pathway in anaerobic bacteria. Eur. J. Bi-ochem. 176, 497-508.
Zaunmüller, T., Kelly, D.J., Glöckner, F.O., Unden, G., 2006. Succinate dehydrogenase functioning by a reverse redox loop mechanism and fumarate reductase in sulphate-reducing bacteria. Microbiology 152, 2443-2453.
Chayka, O., Peretjatko, T., Gudz, S., 2010. Sirkovidnovlyuval'ni bakteriyi vodoym Yazivs'koho sirkovoho rodovyshcha [Sulfur reducing bacteria of Yazivske sulfur deposit]. Nauk. Visn. Uzhhorod. Univ. Ser. Biol. 28, 52-55 (in Ukrainian).
Hadiümna do редкоnегlí 07.08.2016
