CC BY
87
БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 114-117
Усовершенствованный способ получения гнотобиотических животных
Л.А. Болотских, З.С. Лушникова
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Усовершенствован способ получения гнотобиотических животных различных видов для медико-биологических исследований. Разработанные методические приёмы могут успешно использоваться в лабораторном животноводстве для очистки конвенциональных животных от патогенной микрофлоры и перевода их в SPF-статус.
Ключевые слова: гнотобиологический изолятор, гнотобиотические животные, гистерэктомия.
Гнотобиотические животные являются уникальной моделью в медико-биологических исследованиях. Они могут быть использованы в физиологии, патологии, иммунологии, радиологии, токсикологии, биологии, фармакологии, онкологии и других областях. Интерес к этим видам животных вызван тем, что использование гнотобиотических животных, например, безмикробных, позволяет изучать различные физиологические и патологические процессы в чистом виде без влияния сопутствующего микробного фактора, а использование гнотобиотов с определенными ассоциациями позволяет точно установить влияние отдельных микроорганизмов на эти процессы [2,4]. Гнотобио-тические животные представляют определенный интерес и в области лабораторного животноводства, так как являются основой получения животных, свободных от патогенных факторов (SPF — животных), крайне необходимых экспериментаторам [1, 3].
Разработанные методические приемы были успешно использованы для получения гнотобиологических животных различных видов, а также для создания коллекционного фонда лабораторных животных SPF-статуса.
Аппаратура. Для получения и содержания гнотобиотических животных исполь-
зуются гнотобиологические изоляторы различных типов: западно-германского (Haiyoka, Ehret), английского (Vickers, Jsotec), французского (La Colen) производства.
Автоклавы могут быть использованы как отечественного, так и зарубежного производства. Для стерилизации корма, воды, клеток, поилок и другого оборудования и материалов используется автоклавный контейнер, выполненный из нержавеющей стали. В задней стенке контейнера имеются отверстия для прохождения пара, которые герметично закрываются фильтровальным материалом.
Для стерилизации аэрозолем 2%-ной перуксусной кислоты внутренней поверхности камеры изолятора и шлюзов применяют распылитель. Для создания аэрозоля пульверизатор присоединяют к компрессору, нагнетающему воздух в распылительное устройство. Используют также распылители зарубежного производства типа STERIVAP (Франция), которые стерилизуют изоляторы газообразной концентрированной перуксусной кислотой.
Течеискатель присоединяют для проверки герметичности изолятора. Используют галоидный течеискатель ГТИ-3 и фреон-12.
Из дополнительных материалов необходимы переходники из ПВХ для соеди-
114
Усовершенствованный способ получения гнотобиотических животных
нения автоклавного контейнера со шлюзом изолятора, фильтрованная ткань типа УТВ для смены фильтров в автоклавных контейнерах, термостойкая пленка на лавсановой основе для закрытия автоклавного контейнера, клейкая лента типа Scotch; клейкая лента типа ПХЛ.
Получение перуксусной кислоты. Перук-сусная кислота — основное дезинфицирующее средство в гнотобиологии. Перуксус-ная кислота производится за рубежом в виде 40%-ного раствора. Это бесцветная жидкость с очень сильным острым запахом, легковоспламенимая, неустойчивая. В виду таких свойств в обязательном порядке при работе с ней надевают перчатки, очки и маску. В связи с тем, что перуксус-ная кислота неустойчивая, приготовленный 2%-ный раствор перуксусной кислоты должен использоваться в течении З часов. За день активность 1%-ного раствора перук-суснои кислоты уменьшается на 1З%.
Перуксусная кислота синтезируется в определенной последовательности из перекиси водорода (7З,5 мл), серной кислоты (З,5 мл) и уксусного ангидрида (З50 мл). Хранится в небольшом количестве в темной посуде в холодильнике. Перед употреблением необходимо проверить титр и установить концентрацию кислоты титрованием 0,1 Н серноватистокислым натрием.
Подготовка гнотобиологических изоляторов к работе. Монтаж изолятора осуществляется согласно конструкции изолятора по схеме.
После монтажа камера изолятора проверяется на герметичность при помощи галоидного течеискателя ГТИ-З. Камеру изолятора заполняют небольшим количеством фреона и при помощи чувствительного датчика проверяют герметичность.
После установления целостности камеры и герметичности всех соединений и узлов изолятора, тщательно моют ее внутреннюю поверхность мыльным раствором с последующим ополаскиванием водопроводной, а затем дистиллированной водой.
Далее осуществляется стерилизация изолятора. Камеру изолятора стерилизуют с помощью распылителя 2%-ного раствора перуксусной кислоты (0,2—0,3 л раствора на 1 м3 камеры) в определенной последовательности: сначала стерилизуются фильтры и перчатки, затем внутренние крышки, шлюз, имеющиеся стеллажи, ванночки, стены, пол, потолок камеры. На следующий день осуществляют вентиляцию изолятора. Через 2—3 дня повторяют стерилизацию и проветривают изолятор до полного исчезновения запахов перуксусной кислоты из выходных фильтров, подключая изолятор в сеть.
Подготовка животных и проведение операции гистерэктомии. Для операции отбирают здоровых беременных самок на последних сроках беременности. Для точного планирования операции у крыс и мышей используют контролируемое спаривание. Для этого операцию у крыс проводят на 22-й, а у мышей на 21-й день беременности. Наиболее пригодными для операции (по результатам выживаемости плодов) являются самки со 2-й или 3-й беременностью.
На рисунке показан общий вид гно-тобиологического изолятора в продольном разрезе.
Гнотобиологический изолятор содержит светопрозрачную гнотобиологическую камеру 1 с входным и выходным воздушными фильтрами 2 и 3 для подачи стерильного воздуха, манипуляционными перчатками 4 и аэрошлюзом 5 с крышкой 6. Установлены сосуды 7, 8, 9 с дезинфектантами и нагреватели соответственно 10, 11,
12 или их блок, отдельная изолированная светопрозрачная операционная камера 13 для проведения гистерэктомии с горизонтально расположенным входным воздушным фильтром 14 для подачи стерильного воздуха. Горизонтальный ламинарный поток от задней стенки 15 передаётся к передней 16 со свободным истечением через отверстие 17, площадку 18 для размещения на ней сосудов 7, 8, 9 с дезинфектан-
ШИППЕ + ' ШШ Я I I I
Л.А. Болотских, З.С. Лушникова
Гнотобиотический изолятор:
1 - камера изолятора; 2, 3 - входной и выходной фильтры; 4 - манипуляционные перчатки; 5 - аэрошлюз; 6 - крышка аэрошлюза; 7, 8, 9 -дезинфектанты; 10, 11, 12 - нагреватели; 13 -операционная камера; 14 - горизонтальный входной фильтр; 15, 16 - задняя и передняя стенки; 17 - отверстие; 18 - площадка; 19 -аэрошлюз; 20 - переходник; 21 - клетка; 22 -блок управления
тами и нагревателями 10, 11, 12 или их блоков.
При включенной вытяжной лабораторной вентиляции производят стерилизацию внутренних поверхностей камер 1 и 13 изолятора, манипуляционных перчаток 4, набора хирургических инструментов, аэрошлюзов 5 и 19, соединяющего их трубчатого переходника 20 и крышки 6, 2%-ным раствором перуксусной кислоты, готовой или синтезированной.
Подбирают самку-донора со второй или третьей беременностью, помещают ее в операционную камеру 13, удаляют шерсть с живота, обмывают кожу теплой водой, обрабатывают 10%-ным раствором йода, дают наркоз, приклеивают к поверхности кожи
анаэробную пленку, которую также обрабатывают 10%-ным раствором йода.
После этого разрезают пленку по срединной линии живота и склеенную с ней кожу с поперечными разрезами по концам, рассекают по этим линиям мышцы живота и брюшины, отворачивают лоскуты ткани в стороны, обкладывают рану стерильными марлевыми салфетками с разводом краев тупым ранорасширителем. Выводят рога беременной матки из брюшной полости, перевязывают матку в области шейки нитью или марлевым жгутиком, смоченным 10%-ным раствором йода, пересекают кровеносные сосуды и связки матки, ампутируют матку в области шейки дистальнее места перевязки. При этом операция гистерэктомии и дальнейшие операции по извлечению плодов проводят в одной операционной камере
13 при непрерывном горизонтально направленным в ней ламинарном потоке стерильного воздуха при температуре 3738 ОС от задней стенке 15 к передней 16 со свободным истечением через отверстие 17 с использованием входного воздушного фильтра 14.
Затем погружают ампутированную матку вместе с плодами на 1 минуту в сосуды 7, 8, 9 с дезинфектантами при температуре 38 ОС (соответственно с 10%-ным раствором йода, 5%-ным раствором хлорамина и 1%-ным раствором Люголя), размещенные на площадке 18 операционной камеры 13. Разрезают стенки матки, извлекают плоды, освобождают их от плодовых оболочек, осушают с перевязкой и отсечением пуповины. Проводят микробиологический контроль околоплодных материалов, и осушенные плоды подают через аэрошлюзы 5 и 19, соединенные переходником 20, в гнотобиологическую камеру. Подсаживают к самкам-кормили-цам (безмикробным или SPF-статуса), помещенным в индивидуальные клетки 21 в гнотобиологической камере 1, где происходит вскармливание полученного при-
116
херше
Усовершенствованный способ получения гнотобиотических животных
плода с помощью специально разработанной молочной диеты.
Данным способом получено 30 линий мышей SPF-статуса.
Племенные ядра линейных мышей переводили из изоляторов и содержали в помещении обычного типа с соблюдением барьерных условий. Проводился регулярный микробиологический и патологический контроль.
Опыт показал, что животные, очищенные от патогенной микрофлоры и переведенные из гнотобиологического изолятора, могут в условиях обычного помещения при соответствующих барьерных условиях (защита от проникновения диких грызунов, стерилизация корма, подстилки и оборудования, дезинфекции и т.д.) сохранять нормальный микробиологический статус до 2 лет и более.
Следовательно, имеется реальная возможность в экспериментально-биологи-
ческих клиниках каждого института проводить эксперименты на здоровых животных. Усовершенствованный и отработанный способ позволяет переводить в SPF-статус животных других видов и линий.
Литература
1. Душкин В.А., Интизаров М.М., Петрачёв Д.А., Подопригора Г.И., Попов В.И., Сорокин В.В., Шишков В.П. Теоретические и практические основы гнотобиологии. М., Колос, 1983.
2. Чахава О.В. Гнотобиология. М., Медицина, 1972.
3. Подопригора Г.И., Душкин В.А., Болотских Л.А., Буцолич Э., Кишш Э., Акошхеди И., Надудвари И. Оперативные методы получения безмикробных мышей, крыс и морских свинок. Вестник АМН, 1981, № 12, с. 54-58.
4. Подопригора Г.И. Гнотобиология на рубеже двух столетий. 1996, № 14, с. 239-251.
AN IMPROVED METHOD FOR DEVELOPMENT OF GNOTOBIOTIC MODELS
L.A. Bolotskih, Z.S Lushnikova
Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
To provide gnotobiotic animals of different species for biomedical investigations, an appropriate method was developed and tested. This method can be applied to the conventional laboratory animals for «cleaning» them of pathogenic microorganisms and converting into SPF-status.
Key words: gnotobiological isolation ward, gnotobiotic animals, hysterectomia.
