CC BY
073
Ветеринарный врач. 2025. № 1. С. 73 - 78
The Veterinarian. 2025; (1): 73 - 78
Научная статья
УДК 619.615.2/661.155.3
DOI: 10.33632/1998-698Х 2025 1 73
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ПОСТАНОВКИ ПЦР-РВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ЛЕПТОСПИР
Константин Валерьевич Усольцев', кандидат ветеринарных наук, [email protected]
Рафкат Искандарович Шангараев', кандидат ветеринарных наук, [email protected] Камил Саубанович Хаертынов', кандидат биологических наук, [email protected]
Мария Евгеньевна Горбунова', кандидат биологических наук, [email protected] Красовская Юлия Викторовна^, кандидат ветеринарных наук, [email protected] Наиль Ильдарович Хаммадов', кандидат биологических наук, [email protected] Константин Анатольевич Осянин', кандидат биологических наук, [email protected]
1
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань,
Российская Федерация
2
Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Казань, Российская
Федерация
Автор, ответственный за переписку: Рафкат Искандарович Шангараев.
Аннотация. Лептоспироз является одним из наиболее распространенных пр ирод но-очаговых инфекции как в России, так и во многих зарубежных странах. Широкому распространению данного возбудителя способствуют наличие большого числа резервуарных хозяев и восприимчивых животных. Стратегия диагностики лептоспироза включает сбор эпидемиолого-эпизоотологических, клинических, патоморфологических данных с обязательным подтверждением диагноза лабораторными исследованиями. Применение высокочувствительных экспресс лабораторных методов имеет большое значение в комплексе мер борьбы с лептоспирозом. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по чувствительности значительно превосходит другие лабораторные тесты и является наиболее оптимальным методом ин-
дикации инфицированных животных и бактерионосителей. Цель данной работы
подбор вариантов
ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления возбудителей лептоспироза в различных объектах исследования. Индикацию патогенных лептоспир проводили с применением методов гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ. Сравнивания полученные результаты установлено, что гнездовой вариант ПЦР-РВ имел более высокую чувствительность. Минимальное пороговое число Ct при разведении образцов ДНК возбудителя лептоспироза в 10 ^, 10 ^,10 "' и 10 ^ в гнездовой ПЦР-РВ составило 2,04; 4,34; 6,55; 7,55 соответственно, тогда как тот же показатель при использовании аналогичных разведений ДНК патогенных лептоспир в ПЦР-РВ равнялся 31,75; 34,01; 34,29 и 31,79. Таким образом, способ гнездовой ПЦР-РВ из-за более высокой чувствительности целесообразнее использовать для исследования образцов из объектов окружающей среды, так как в них часто патогенные лептоспиры присутствуют в низкой концентрации, а для индикации возбудителей лептоспироза в биологическом материале, полученном от подозрительного в заболевании животных - ПЦР-РВ. Оценку специфичности применяемых способов ПЦР проводили с использованием образцов ДНК Leptospira interrogans (серо-группа Tarassovi) и ДНК гетерогенных микроорганизмов. В результате амплификации исследуемых образцов представленными способами на основе метода ПЦР-РВ положительный результат установлен лишь с ДНК L. interrogans (серогруппа Tarassovi), что подтверждает высокую специфичность используемых олигонуклеотидов.
Ключевые слова: ген, гнездовая ПЦР-РВ, лептоспироз, патогенные лептоспиры, природноочаговая инфекция
Для цитирования: Усольцев К.В., Шангараев Р.И., Хаертынов К.С., Горбунова М.Е., КрасовскаяЮ.В., Хаммадов Н.И., Осянин КА. Усовершенствование способов постановки ПЦР-РВ для индикации патогенных лептоспир // Ветеринарный врач. 2025. №1. С. 73- 78. DOI: 10.33632/1998-698Х 2025 1 73
74
IMPROVEMENT OE RT-PCR METHODS EOR INDICATION OE PATHOGENIC LEPTOSPIR
Konstantin V. Usoltsev', candidate of veterinary sciences, [email protected]
Rafkat I. Shangaracv'. candidate of veterinary sciences, [email protected]
Kamil S. Khacrtynov'. candidate of biological sciences, [email protected]
Maria E. Gorbunova', candidate of biological sciences, [email protected]
Yulia V. Krasovskaya^, candidate of veterinary sciences, [email protected]
Nail I. Khammadov', candidate of biological sciences, [email protected] Konstantin A. Osyanin', candidate of biological sciences, [email protected]
1
2
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Security, Kazan, Russian Federation Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman, Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Rafkat Iskandarovich Shangaraev.
Abstract. Eeptospirosis is one of the most common natural focal infections both in Russia and in many foreign countries. The widespread spread of this pathogen is facilitated by the presence of a large number of reservoir hosts and susceptible animals. The strategy for the diagnosis of leptospirosis includes the collection of epidemiological, epizootological, clinical, and pathomorphological data with mandatory confirmation of the diagnosis by laboratory tests. The use of highly sensitive rapid laboratory methods is of great importance in the complex of measures to combat leptospirosis. Polymerase chain reaction (PCR) is significantly more sensitive than other laboratory tests and is the most optimal method for indicating infected animals and bacterial carriers. The purpose of this work is to determine the optimal way to detect the DNA of the causative agents of leptospirosis. The indication of pathogenic leptospira was carried out using the methods of nested RT-PCR and RT-PCR. Comparing the results obtained, it was found that the nested RT-PCR variant had a higher sensitivity. The minimum threshold number of Ct when diluting DNA samples of the causative agent of leptospirosis at 10 10 10 "' and 10 ^ in the nested RT-PCR was 2.04; 4.34; 6.55; 7.55, respectively, whereas the same indicator when using similar dilutions of DNA of pathogenic leptospira in RT-PCR was 31.75; 34.01; 34.29 and 31.79. Thus, due to the higher sensitivity, the nest RT-PCR method is more appropriate for studying samples from environmental objects, since pathogenic leptospira are often present in low concentrations in them, and RT-PCR is used to indicate the causative agents of leptospirosis in biological material obtained from suspected animal diseases. The specificity of the PCR methods used was assessed using DNA samples from Leptospira interrogans (serogroup Tarassovi) and DNA from heterogeneous microorganisms. As a result of amplification of the studied samples with the presented methods based on the RT-PCR method, a positive result was established only with the DNA of L. interrogans (serogroup Tarassovi), which confirms the high specificity of the oligonucleotides used.
Keywords: gene, nested RT-PCR, leptospirosis, pathogenic leptospires, natural focal infection
Введение. Лептоспироз - нетрансмиссивная природно-очаговая болезнь, характеризующаяся желтухой, гемоглобинурией, патологией почек и репродуктивного тракта. Возбудителями лептоспироза являются патогенные лептоспиры, которые имеют высокие генотипический и антигенный полиморфизмы. В настоящее время известно более 268 серологических вариантов и десять геномных видов возбудителя [1].
Эпизоотическая ситуация по лептоспирозу животных в Российской Федерации характеризуется эндемичностью: неблагополучие имеет восходящую тенденцию, однако заболеваемость животных не превышает данные предыдущих годов. Среди сельскохозяйственных животных наибольшее число инфицированного поголовья зарегистрировано у крупного рогатого скота (КРС) и лошадей [2].
Как и при других инфекционных болезнях стратегия диагностики лептоспироза включает сбор и анализ эпидемиолого-эпизоотологических, клинических и патоморфологических данных с обязательным подтверждением диагноза лабораторными методами [3]. Молекулярно-генетические исследования, в частности полимеразная цепная реакция (ЕЩР) являются неотъемлемой частью современных лабораторных методов диагностики инфекционных болезней. По чувствительности ЕЩР значительно превосходит другие лабораторные тесты и является наиболее приемлемым методом индикации инфицированных животных [4]. Кроме того, метод ЕЩР дает возможность провести генотипирование видов, серогрупп патогенных лептоспир непосредственно в образцах клинического материала [5].
Одним из наиболее важных аспектов при разработке диагностических ЕЩР тест-систем является правильный выбор генетической мишени возбудителя, от которого зависит чувствительность и специфичность анализа. У патогенных лептоспир особый интерес представляет ген lipL32, который
75
ответственен за кодирование липопротеина L32 наружной оболочки клетки возбудителя. Данный ген отсутствует у сапрофитных представителей рода Leptospira, а белок L32, кодируемый эти геном является наиболее распространенным у патогенных лептоспир [6]. В патогенезе лептоспироза липопротеин L32 участвует во взаимодействии возбудителя лептоспироза с клетками макроорганизма. Использование этого белка и гена, который его кодирует в качестве маркера при диагностике лептоспироза представляет наибольший практический интерес [7].
В настоящее время известны различные модификации ПЦР, которые отличаются по технике постановки, по способам детекции результатов, а также по чувствительности и специфичности. Одним из наиболее часто применяющихся на практике вариантов ПЦР является проведение реакции амплификации с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ), которое имеет существенные преимущества [8]. С помощью данной методики помимо постановки диагноза можно определить количество целевой молекулы в образце. Также детекция продуктов реакции осуществляется в режиме реального времени, что снижает риск контаминации [9]. Однако в некоторых случаях для повышения чувствительности и специфичности применяется гнездовой вариант ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.
Целью данной работы являлось подбор вариантов ПЦР-РВ для выявления возбудителей лептоспироза в различных объектах исследования.
Материалы и методы. В работе была использована культура Leptospira interrogans серогруппы Tarassovi, полученная из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Инактивация культуры возбудителя лептоспироза была проведена на лизирующем буфере из набора для выделения ДНК РИБО-преп (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) при температуре +70 °C в течение 20 мин, с последующим выделением нуклеиновых кислот (НК) согласно инструкции производителя. Концентрация микробных клеток в культуре L. interrogans (серо-группа Tarassovi) была определена по стандарту мутности [10]. Также в работе были использованы лизаты бактериальных культур Bacillus, cereus, Bacillus, subtilis, Escherichia, coli. Mycobacterium bovis BCG и Staphylococcus. aureus.
При постановке ПЦР была использована комбинация наружных и внутренних праймеров, а также флуоресцентно-меченный зонд, амплифицирующие фрагмент гена lipL32. Наружные прямой и
обратный
праймеры
имели
следующую
нуклеотидную
последовательность (5’
3’):
ttttggctatctccgttgcactctt; aagtctccgtcgcctggttcac. Нуклеотидная последовательность внутренних прайме-
ров и флуоресцентно-меченного зонда.
в
свою очередь, была следующей (5’
3’):
tcttttgttctgagcgaggacac; acggcaggaatccaaacataga и ROX-ccagggacaaacgaaaccgtaaaaac-RTQ2 соответственно. Синтез праймеров и зонда был осуществлен в ЗАО «Евроген» (Россия). Постановку ПЦР проводили на амплификаторе BIO-RAD CFX96 (ВЮ RAD, США). Для приготовления реакционной смеси использовали набор «ПЦР-микс» («Компания Синтол», Россия).
Гнездовую ПЦР-РВ проводили в два раунда. На первом раунде, без детекции результатов, использовали наружные прямой и обратный праймеры. Реакционная смесь объемом 20,0 мкл для первого раунда имела следующий состав: 2,5 кратный ПЦР-буфер - 8,0 мкл, прямой и обратный праймеры -
0,5 мкл, деионизированная вода
6,0 мкл, ДНК матрица
был представлен так: начальная денатурация при 95,0 °C в течение 5 мин
5,0 мкл. Температурно-временной режим
один цикл; и 20 циклов 95
'С - 30 сек, отжиг праймеров при 56,3 °C - 30 сек. Для второго раунда гнездовой ПЦР-РВ использовали
о.
реакционную смесь объемом 20,0 мкл следующего состава: 2,5 кратный ПЦР-буфер - 8,0 мкл, прямой, обратный праймеры и флуоресцентно-меченный зонд - 0,5 мкл, деионизированная вода - 5,5 мкл, ДНК матрица (после первого раунда) - 5,0 мкл. Температурно-временные условия для второго раунда реак-
ции были представлены так: 95,0 °C - 5 мин один цикл, 95,0 °C
15 сек, 58,3 °C - 30 сек - 40 циклов.
Для постановки ПЦР-РВ использовали реакционную смесь объемом 20,0 мкл следующего состава: 2,5 кратный ПЦР-буфер - 8,0 мкл, прямой, обратный праймеры и флуоресцентно-меченный зонд
0,5 мкл, деионизированная вода
5,5 мкл, ДНК матрица
метры были следующими: 95,0 °C - 5 мин один цикл, 95,0 °C
5,0 мкл Температурно-временные пара-- 15 сек, 58,3 °C - 30 сек - 40 циклов.
При оценке чувствительности гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ был проанализирован показатель Ct (cycle threshold), представляющий собой пороговое число циклов ПЦР, при котором относительные единицы флуоресценции (RFU - Relative fluorescence units) превышают пороговое значение.
Результаты исследований и их обсуждение. При определении чувствительности гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ были приготовлены разведения ДНК культуры L. interrogans серогруппы Tarassovi 10'2, 10 ^,10 "^ и 10'5. Первоначальная концентрация микробных клеток в культуре составила 1x10^. Для экстракции НК был взят лизат в объеме 50,0 мкл, в котором концентрация микробных тел составила
76
примерно 5 X 10” клеток. В разведениях ДНК 10-^, 10-^, 10-^ и 10-^ в пересчете на количество бактериальных клеток соответствовало примерно бхЮ^, 5\IО^. 50 и 5 микробных тел соответственно. Результаты определения чувствительности гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ для индикации патогенных лептоспир представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты определения чувствительности гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ для индикации патогенных лептоспир
Разведение
ДНК
Гнездовая ПЦР-РВ
ПЦР-РВ
10-2
10-2
2,04
4^
График флуоресценции
Amplification
Ct
График флуоресценции
10-4
6,55
10-5
7,55
1600
1400
1200
1000
600
600
400
200
о
10
20
Cycles
30
40
31,75
34,01
34,29
31,79
Aniplification
250
200
150
10О
50
10
20
Cycles
30
40
а
Э
о
о
О
1Z
Результаты исследования показали, что гнездовой вариант показал более высокую чувствительность. Минимальное пороговое число Ct при разведении образцов ДНК возбудителя лептоспироза в 10-2, 10-2,10-4 и 10-5 в гнездовой ПЦР-РВ составило 2,04; 4,34; 6,55 и 7,55 соответственно. Показатель Ct при использовании аналогичных разведений ДНК патогенных лептоспир в ПЦР-РВ равнялся 31,75; 34,01; 34,29 и 31,79. Таким образом, чувствительность гнездовой ПЦР-РВ была выше по сравнению с ПЦР-РВ.
с целью определения специфичности гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ для индикации патогенных лептоспир была проведена амплификация с использованием образцов ДНК L. interrogans (серогруппа Tarassovi) и гетерогенных микроорганизмов: Е. соИ, В. се reus. В. subtilis,M. bovis BCG и .S', aureus. Результаты определения специфичности гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ показали, что амплификация прошла только с использованием образцов ДНК L. interrogans (серогруппа Tarassovi), что подтверждает высокую специфичность праймеров только к возбудителю лептоспироза.
В лабораторной практике наряду с чувствительностью и специфичностью время выполнения анализа также имеет большое значение. Экспресс-индикация возбудителя инфекции дает возможность назначить соответствующие антибактериальные препараты и провести высокоэффективную терапию. В данной работе в качестве индикации патогенных лептоспир использовано два варианта ПЦР-анализа: гнездовой и способ с детекцией результатов в режиме реального времени. Гнездовой вариант, несмотря на высокую чувствительность, требует сравнительно длительного времени для получения результата. При выполнении анализа со второго раунда с применением только внутренних праймеров значительно сокращается время анализа, однако снижается чувствительность. Так как в объектах окружающей среды возбудители лептоспироза часто присутствуют в низкой концентрации, для индикации которых целесообразно использовать метод с высокой чувствительностью [11]. Таким образом гнездовая ПЦР благодаря высокой чувствительности больше подходит для обнаружения патогенных лептоспир в образцах объектов внешней среды: воды, кормов, почвы [12]. Для исследования же биологического материала от подозрительных в заболевании лептоспирозом животных и для определения возбудителей лептоспироза в образцах, полученных от диких мелких млекопитающих, а также для обнаружения животных-лептоспироносителей больше подходит ПРЦ-РВ, которая дает возможность в более короткие сроки получить результаты [13].
Заключение. В данной работе была проведена индикация патогенных лептоспир с применением методов гнездовой ПЦР-РВ и ПЦР-РВ. Сравнивания полученные результаты установлено, что гнездовой вариант ПЦР-РВ имел более высокую чувствительность. Минимальное пороговое число Ct при разведении образцов ДНК возбудителя лептоспироза в 10-2, IQ-^, 10-4 iq-s гнездовой ПЦР-РВ составило 2,04; 4,34; 6,55; 7,55 соответственно, тогда как тот же показатель при использовании аналогичных разведений ДНК патогенных лептоспир в ПЦР-РВ равнялся 31,75; 34,01; 34,29 и 31,79. Таким образом способ гнездовой ПЦР-РВ из-за более высокой чувствительности более целесообразен для исследования образцов из объектов внешней среды, так как в них часто патогенные лептоспиры присут
77
ствуют в низкой концентрации, а для индикации возбудителей лептоспироза в биологическом материале, полученном от подозрительного в заболевании животных - ПЦР-РВ. Оценку специфичности применяемых способов ПЦР проводили с использованием образцов ДНК Leptospira interrogans (серо-группа Tarassovi) и ДНК гетерогенных микроорганизмов. В результате амплификации исследуемых образцов с представленными способами на основе метода ПЦР-РВ положительный результат установлен лишь с ДНК L. interrogans (серогруппа Tarassovi), что подтверждает высокую специфичность используемых олигонуклеотидов.
Финансирование исследования. Работа выполнена в соответствии с Государственным заданием по теме: 06.17.2021.01/01.6-4 «Разработка ПЦР тест-системы для индикации патогенных лептоспир», номер гос. регистрации: 2024115668/10(035189).
Список источников
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Типирование штаммов Leptospira spp. на основе 16S рРНК / Ю.В. Останкова [и др.] // Жур. микроб эпидем и иммунол. - 2016. - № 1. С. 35-39.
Обзор эпизоотической ситуации по лептоспирозу в Российской Федерации за период 2013-2023 гг. / Р.И. Шангараев [и др.] // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2024. -№ 10(240). - С. 65-72. doi: 10.53083/1996-4277-2024-240-10-65-72.
Соболева Г.Л., Ананьина Ю.В., Непоклонова И.В. Актуальные вопросы лептоспироза людей и животных // Российский ветеринарный журнал. - 2017. - № 8. - С. 14-18.
Корякина Л.П., Никитина А.А. Особенности проявления лептоспироза у свиней и других видов животных в Якутии // Вестник АГАТУ. - 2022. - № 1(5). - С. 1-7.
Самсонова А.П., Ананьина Ю.В. Применение ПЦР-анализа при исследовании лептоспирозов в регионах Сибири и Дальнего Востока // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - № 3 (55). - С. 165-167.
Post-translational Modification of LipL32 during Leptospira interrogans Infection / D. Timothy [et all.] // Pios. Neglected Tropical Diseases. - 2014. - Vol 8(10). - P. 1-9. doi: 10.1371/joumal.pntd.0003280.
Shien Y eoh T., Hock Tang Th., Citartan M. Isolation of a novel DNA aptamer against LipL32 as a potential diagnostic agent for the detection of pathogenic Leptospira // Biotechnol. J. - 2023. - Vol. 18(3). - P. 1-18. doi: 10.1002/biot.202200418.
Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза / Е.А.
Громова [и др.] // Ветеринарный врач. 698Х 2024 3 34.
2024.
№ 3.
С. 34-40. doi: 10.33632/1998-
9.
Конструирование специфических праймеров для ПЦР- диагностики классической чумы свиней / Н.И. Хаммадов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2024. - № 3. - С. 41-46. doi: 10.33632/1998-698Х 2024 3 41.
10. Общая фармокопейная статья ОФС. 1.7.2.0008.15 Определение концентрации микробных клеток: утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018. № 749: сайт. URL: https://phar-macopoeia.ru/wp-content/uploads/2016/09/OFS. 1.7.2.0008.15-Opredelenie-kontsentratsii-mikrobnyh-kletok.pdf?yschd=m53i8awhbq512819315 (дата обращения: 26.09.2024).
11. Leptospirosis diagnosis using Nested-PCR // F. Nassi [et all.] // Brazilian Journal of Microbiology. - 2003. -Vol. 34.-P. 90-92.
12. Nested polymerase chain reaction for detection of pathogenic leptospires / S.D. Jouglard [et all.] // Can. J. Microbiol. - 2006. - Vol. 52(8). - P. 747-52.
13. Diagnosis of human leptospirosis: systematic review and meta-analysis of the diagnostic accuracy of the Leptospira microscopic agglutination test, PCR targeting LJbl, and IgM ELISA to Leptospira fainei serovar Hurstbridge / M. Valente [et all.] // BMC Infect Dis. - 2024. - Vol. 24(1). - P. 168. doi: 10.1186/S12879-023-08935-0.
References
1. Typing of strains of Leptospira spp. based on 16S rRNA / Yu.V. Ostankova [et al.] // Journal of Microbiology and Immunology. - 2016. - No. 1. - P. 35-39.
2. Review of the epizootic situation of leptospirosis in the Russian Federation from 2013 through 2023 / R.I. Shangaraev [et al.] // Bulletin of the Altai State Agrarian University. - 2024. - No. 10(240). - P. 65-72. doi: 10.53083/1996-4277-2024-240-10-65-72.
78
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Soboleva G.L., Ananyina Yu.V., Nepoklonova I.V. Actual issues of human and animal leptospirosis // Russian Veterinary Journal. - 2017. - No. 8. - P. 14-18.
Koryakina L.P., Nikitina A.A. Features of the manifestation of leptospirosis in pigs and other animal species in Yakutia // Bulletin of AGATU. - 2022. - No. 1(5). - P. 1-7.
Samsonova A.P., Ananyina Yu.V. Application of PCR analysis in the study of leptospirosis in the regions of Siberia and the Far East // Bulletin of the All-Russian Scientific Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences. - 2007. - № 3 (55). - P. 165-167.
Post-translational Modification of LipL32 during Eeptospira interrogans Infection / D. Timothy [et all.] // Pios. Neglected Tropical Diseases. - 2014. - Vol 8(10). - P. 1-9. doi: 10.1371/joumal.pntd.0003280.
Shien Y eoh T., Hock Tang Th., Citartan M. Isolation of a novel DNA aptamer against LipL32 as a potential diagnostic agent for the detection of pathogenic Eeptospira // Biotechnol. J. - 2023. - Vol. 18(3). - P. 1-18. doi: 10.1002/biot.202200418.
Development of a multiplex RT-PCR test system for detecting the causative agent of brucellosis / E.A. Gromova [et al.] // The Veterinarian. - 2024. - No. 3. - P. 34-40. doi: 10.33632/1998-698X_2024_3_34. Design of specific primers for PCR diagnosis of classical swine fever / N.I. Hammadov [et al.] // The Veterinarian. - 2024. - No. 3. - P. 41-46. doi: 10.33632/1998-698X_2024_3_41.
General pharmacopoeial article OFS. 1.7.2.0008.15 Determination of the concentration of microbial cells: approved and put into effect by the Order of the Ministry of Health of Russia dated 31.10.2018. No. 749: website. URE: https://pharmacopoeia.ru/wp-content/uploads/2016/09/OFS. 1.7.2.0008.15-Opredelenie-kontsentratsii-mikrobnyh-kletok.pdf?yschd=m53i8awhbq512819315 (date of access: 26.09.2024).
Eeptospirosis diagnosis using Nested-PCR// F. Nassi [et all.] // Brazilian Journal of Microbiology. - 2003. -Vol. 34.-P. 90-92.
12. Nested polymerase chain reaction for detection of pathogenic leptospires / S.D. Jouglard [et all.] // Can. J. Microbiol. - 2006. - Vol. 52(8). - P. 747-52.
13. Diagnosis of human leptospirosis: systematic review and meta-analysis of the diagnostic accuracy of the Eeptospira microscopic agglutination test, PCR targeting LJbl, and IgM EEISA to Leptospira fainei serovar Hurstbridge / M. Valente [et all.] // BMC Infect Dis. - 2024. - Vol. 24(1). - P. 168. doi: 10.1186/S12879-023-08935-0.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
АП authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 26. 12. 2024;
© Усольцев К. В., Шангараев Р. И., Хасртынов К. С., Горбунова М. Е., Красовская Ю. В., Хаммадов Н. И., Осянин К. А. 2025
