CC BY
127
эндопротезами через CD14+HLA-DR оказались связаны II, III и V факторы (вклад в общую дисперсию 47,4%), что подтверждало патогенетическую значимость нарушений экспрессии на моноцитах активационного маркера НЬА-DR при гнойно-воспалительных осложнениях эндопро-тезирования крупных суставов. HLA-DR принадлежит к молекулам главного комплекса тканевой совместимости класса II (МНС класс II), ответственных за представление антигена Т-хелперам. Моноциты у здоровых людей экспрессируют на своей поверхности молекулы НЬА-DR высокой плотности. Моноциты с уменьшенной или отсутствующей экспрессией молекул HLA-DR не могут выполнять свою антигенпредставляющую функцию и не обладают способностью продуцировать воспалительные медиаторы в ответ на соответствующие стимулы, в связи с чем уменьшение экспрессии HLA-DR на моноцитах коррелирует с увеличением риска инфекционных осложнений. Необходимо отметить, что у пациентов с хроническим остеомиелитом в стадии ремиссии факторов, связанных с экспрессией HLA-DR на моноцитах, выявлено не было.
Заключение. Результаты факторного анализа показали, что при гнойно-воспалительных заболеваниях длинных трубчатых костей и суставов основными являются факторы, связанные с регуляторными Т-клетками, участвующими в угнетении Т-клеточного иммунитета в условиях хронической гнойной инфекции. В случае развития свищевой формы остеомиелита важными становятся механизмы, связанные с маркерами активации Т-лимфоцитов. а при инфицировании эндопротеза - с нарушением экспрессии HLA-DR на моноцитах.
Проведенные исследования позволяют сделать выводы о тесной взаимосвязи между особенностями функционирования клеточного иммунитета и клинико-нозологическими характеристиками пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями опорно-двигательной системы, а главные компоненты рассматривать в качестве ключевых интегративных характеристик клеточного иммунитета, которые могут быть использованы для понимания патогенеза, а также диагностики и про-
гнозирования течения заболевания у пациентов с хроническим остеомиелитом и инфицированными эндопротезами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Леонов В.П. Факторный анализ: основные положения и ошибки применения // Международный журнал медицинской практики. - 2005, №1. - С. 14-16.
2. Сарап П.В., Винник Ю.С., Останин А. А. Использование факторного анализа для оценки показателей иммунного статуса больных с хирургической патологией // Современные наукоемкие технологии. - 2009, №3. - С. 84-85.
3. Сарап П.В., Винник Ю.С., Останин А.А. Клинические аспекты патогенетических влияний, определяющих состояние иммунной системы у пациентов с ургентной хирургической патологией // Бюллетень сибирской медицины. - 2011, №1. - С. 162-167.
4. ХайдуковС.В. Иммунофенотипированиеклетокпериферической крови при помощи проточной цитометрии. Стандартизация методов // Медицинская иммунология. - 2007. - Т-9, № 2-3. -С. 342.
5. Genser B., Cooper F., Yazdanbakhsh M., Barreto M., Rodrigues L. // A guide to modern statistical analysis of immunological data. - Immunol. 2007, № 8. - P. 27.
REFERENCES
1. Leonov V.P. Factor analysis: fundamentals and application errors. Mezhdunarodnyj zhurnal medicinskoj praktiki. 2005; 1: 14-6 (in Russian).
2. Sarap P.V., Vinnik J.S., Ostanin A.A. The use of factor analysis to assess the immune status of patients with surgical pathology. Sovre-mennye naukoemkie tehnologii. 2009; 3: 84-5 (in Russian).
3. Sarap P.V., Vinnik J.S., Ostanin A.A. Clinical aspects of pathogenic influences determining the immune status of patients with urgent surgical pathology. Bjulleten' sibirskoj mediciny. 2011; 1: 162-7 (in Russian).
4. Hajdukov S.V. Immunophenotyping of peripheral blood cells with flow cytometry. Standardization of methods. Medicinskaja immu-nologija. 2007; 2-3: 342 (in Russian).
5. Genser B., J Cooper F., Yazdanbakhsh M., Barreto M., Rodrigues L. A guide to modern statistical analysis of immunological data. BMC Immunol. 2007; 8: 27.
Поступила 03.09.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДк 612.112.91.014.2.08
С.Л. Кашутин1, С.И. Данилов2, Е.Н. Верещагина1, С.В. Ключарева2
уровень экспрессии молекул адгезии на нейтрофилах в зависимости от сегментации их ядер
1ГБОУ ВпО Северный государственный медицинский университет, кафедра кожных и венерических болезней, 163045, Архангельск; 2ГБОУ ВпО Северо-западный государственный медицинский университет им. И.И. мечникова, кафедра дерматовенерологии, 195067, Санкт-петербург, Россия
В венозной крови определяли уровень экспрессии молекул адгезии нейтрофилами и сегментацию их ядер. Выявлено, что в условиях отсутствия антигенной стимуляции 53,34% нейтрофилов циркулирующего пула экспрессируют молекулы L-селектина, 65,64% молекулыLFA-1, 40,51% - 1САМ-1, 58,72% - LFA-3, 59,74% - РЕСАМ-1. Наибольшая готовность к реализации фазы скольжения, прочной адгезии и непосредственно самой трансмиграции наблюдается у нейтрофилов с 5 сегментами в ядре.
Ключевые слова: нейтрофилы, молекулы адгезии, сегментация ядер нейтрофилов
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2013
S.L. Kashutin, S.I. Danilov, E.N. Vereschiagina, S.V. Klutchareva
THE EXPRESSION LEVEL OF ADHESION MOLECULES ON NEUTROPHILS DEPENDING AT SEGMENTATION OF THEIR NUCLEI
The northern state medical university, 163045 Archangelsk, Russia; The I.I. Mechnikov Northwestern state medical university, 195067 St. Petersburg, Russia
The article deals with results of detection of expression level of adhesion molecules on neutrophils and segmentation of their nuclei. It is established that in conditions of absence of antigen .stimulation neutrophils of circulating pool express molecules of L-selectin in 53.34%, LFA-1 molecules in 65.64%, ICAM-1 in 40.51%, LFA-3 in 58.72% and PECAM-1 in 59.74%. The full readiness to realization ofphase of sliding, strong adhesion and immediately transmigration itself is detected in neutrophils with five segments in nucleus.
Key words: neutrophil, adhesion molecule, segmentation of neutrophils nuclei
Нейтрофилы традиционно относят к фагоцитирующим клеткам, которые благодаря ряду уникальных свойств рассматриваются как высокопрофессиональные «убийцы», составляющие своеобразный «отряд быстрого реагирования» в системе противоинфекционной защиты организма [1, 2]. Нейтрофилы обладают всеми функциями фагоцитирующих клеток: адгезивностью, подвижностью, способностью к хемотаксису и захвату бактерий и других частиц, способностью убивать захваченные микроорганизмы с помощью кислородзависи-мых и кислороднезависимых механизмов, переваривать захваченные объекты фагоцитоза [3-5]. Имеются свидетельства о роли нейтрофилов в представлении антигенов моноцитам и лимфоцитам, а также возможности регулировать функции иммунокомпетентных клеток через продукцию цитокинов [6].
Общеизвестно, что компартмент нейтрофилов крови включает в себя циркулирующий и маргинальный пулы. Поведение нейтрофилов в крови регулируется несколькими классами мембраносвязанных белков адгезии, в том числе селектинами, интегринами, суперсемейством иммуноглобулинов [7, 8]. Если миграция нейтрофилов в очаг воспаления широко исследована, то данные о миграции нейтрофилов в ткани в условиях отсутствия антигенной нагрузки на организм единичны и разрозненны. Фактически нет сведений о зависимости уровня экспрессии молекул адгезии циркулирующего пула нейтрофилов от морфологических изменений со стороны этих клеток, в частности сегментации их ядра. В связи с этим, цель исследования состояла в определении зависимости уровня экспрессии молекул адгезии циркулирующего пула нейтрофилов от сегментации их ядра.
Материалы и методы. Проведено обследование 50 лиц (22 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих хронической патологии в анамнезе. Венозную кровь для исследования брали утром натощак. На проточном цитометре FC-500 фирмы «Beckman Coulter» определяли экспрессию нейтрофилами молекул L-селектина (CD62L), LFA-1 (CD11a), ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), PECAM-1 (CD31).
В мазке крови, зафиксированном смесью Никифорова и окрашенном по Романовскому-Гимзе, определяли удельный вес нейтрофилов среди других лейкоцитов: эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов. Ци-тоскопическое исследование нейтрофильных лейкоцитов проводили путем подсчета среднего количества фрагментов ядра у 100 клеток [9].
Для корреспонденции:
Кашутин Сергей Леонидович, д-р мед. наук, зав. каф. кожных и венерических болезней
Адрес: 163045, Архангельск, ул. Самойло, 10/61 E-mail: [email protected]
Статистическую обработку результатов проводили с помощью SPSS 13.0 for Windows. Распределение параметров было ненормальным, в связи с чем описание выборок проводили с помощью подсчета медианы (Md) и межквартильного интервала С25С75. Вероятность различий оценивали по непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова. Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение. Общее содержание нейтрофильных лейкоцитов составило 3,9 • 109 кл/л (3,02, 4,78), при этом молекулу L-селектина экспрессировали в среднем 2,08 • 109 кл/л (0,15, 3,05) нейтрофилов. У мужчин наблюдали тенденцию к снижению концентрации нейтрофилов с данной молекулой (2,01 • 109 кл/л (0,17,
3.05) против 2,16 • 109 кл/л (0,08, 3,17); Z = 0,65; р = 0,71). Молекулу LFA-1 экспрессировали 2,56j109 кл/л (1,68,
3.06) нейтрофилов. У мужчин концентрация нейтрофильных лейкоцитов с молекулой LFA-1 составила 2,65 • 109 кл/л (0,91, 3,24), у женщин несколько меньше - 2,47 • 109 кл/л (1,67, 3,11), но статистически значимых различий при этом не зарегистрировано (Z = 0,90; р = 0,32). Среднее содержание нейтрофилов с молекулой ICAM-1 было на уровне 1,58 • 109 кл/л (0,92, 2,23) без существенных различий у мужчин и женщин (1,61 • 109 кл/л (0,26, 1,61) и 1,55 • 109 кл/л (0,97, 2,28)). Уровень нейтрофилов, экс-прессирующих молекулу LFA-3, составил 2,29 • 109 кл/л (1,05, 2,88). У мужчин концентрация нейтрофилов с данной молекулой была существенно ниже (1,86 • 109 кл/л (0,04, 2,79) против 2,42 • 109 кл/л (1,45, 2,42), но без статистического подтверждения (Z = 0,58; р = 0,86). Молекулу PECAM-1 экспрессировали в среднем 2,33 • 109 кл/л (1,54, 3,01) нейтрофилов. Наблюдалась явная тенденцию к снижению концентрации нейтрофильных лейкоцитов с этой молекулой у мужчин, также без статистического подтверждения (2,13 • 109 кл/л (0,35, 3,23) против 2,47 • 109 кл/л (1,67, 3,04); Z = 0,63; р = 0,74).
Анализ сегментограммы показал, что в венозной крови преобладали нейтрофилы с 3-мя 1,37 • 109 кл/л (1,04, 1,81) и 4-мя 1,13 • 109 кл/л (0,9, 1,59) сегментами в ядре. Концентрации нейтрофилов с 1, 2, 5 и более сегментами сравнительно небольшие. У мужчин содержание нейтрофилов с 1 сегментом в 2 раза меньше, чем у женщин (0,12 • 109 кл/л (0,08, 0,21) против 0,24 • 109 кл/л (0,15, 0,34); Z = 1,32; p = 0,03). При этом индекс сегментации нейтрофилов у мужчин выше, чем у женщин 3,42 (3,37, 3,58) против 3,32 (3,15, 3,49); Z = 1,57; p = 0,008). По-видимому, увеличению индекса сегментации нейтрофилов способствовало увеличение, хотя и в виде тенденции, концентрации 4 сегментных форм (1,31 • 109 кл/л (0,89, 1,56) против 1,09 • 109 кл/л (0,9, 1,62); Z = 0,78; p = 0,49).
Корреляционный анализ между уровнем экспрессии молекул адгезии и сегментацией ядер нейтрофилов по-
казал наличие слабых и статистически недостоверных корреляций в случае, когда нейтрофилы содержали 1, 2 и 3 сегмента в ядре. Статистически значимые корреляции были выявлены у 4 сегментных форм нейтрофилов: слабые - с уровнем экспрессии L-селектина (г = 0,28; р = 0,04), средней силы - с уровнем экспрессии молекул LFA-1 (г = 0,37; р = 0,009), LFA-3 (г = 0,49; р = 0,003) и сильная - с уровнем экспрессии нейтрофилами молекулы РЕСАМ-1 (г = 0,52; р = 0,01). В случае с нейтро-филами, содержащими 5 и более сегментов в ядре, все эти корреляции стали сильными: с уровнем экспрессии L-селектина нейтрофилами - г = 0,51; р = 0,003, LFA-1
- г = 0,55; р = 0,0002, LFA-3 - г = 0,62; р = 0,008, РЕ-САМ-1 - г = 0,60; р = 0,002, кроме того, появилась также сильная и достоверная связь с содержанием нейтро-филов, экспрессирующих молекулу ЮАМ-1 (г = 0,53; р = 0,001).
Если учитывать, что в сосудистом русле существуют два почти равных пула нейтрофилов: циркулирующий и пристеночный, и при заборе венозной крови сосчитывается только циркулирующий пул, можно полагать, что в условиях отсутствия антигенной стимуляции 53,34% нейтрофилов циркулирующего пула экспрессируют молекулы L-селектина, 65,64% молекулы LFA-1, 40,51%
- ЮАМ-1, 58,72% - LFA-3, 59,74% - РЕСАМ-1. Если учитывать, что L-селектин участвует в механизме формирования пристеночного пула, обеспечивая роллинг-эффект, можно полагать, что 53,34% циркулирующих нейтрофилов способны пополнить пристеночный пул. Известно, что адгезия, вызванная селектинами обратима, кратковременна и малоэффективна. Более прочную и необратимую адгезию нейтрофилов на эндотелии обусловливают В -интегрины, к которым относится молекула LFA-1 [10]. В соответствии с результатами исследования 65,64% нейтрофилов циркулирующего пула экс-прессировали эту молекулу, что несколько больше, чем удельный вес нейтрофилов, экспрессирующих молекулу L-селектина (53,34%). Учитывая возможность про-теолитического отщепления молекулы L-селектина при экспрессии на нейтрофилах В2-интегринов на клеточной поверхности, что определяется как шеддинг-феномен, можно предполагать, что шеддинг молекул L-селектина проявляется среди нейтрофилов циркулирующего пула достаточно активно [11, 12].
Циркулирующие нейтрофильные лейкоциты имеют на своей поверхности молекулы адгезии - ЮАМ-1, LFA-3, РЕСАМ-1. Учитывая, что трансэндотелиальная миграция нейтрофилов опосредована, в том числе этими молекулами, можно полагать, что уже на уровне нейтро-филов циркулирующего пула имеются все необходимые возможности для трансмиграции [6].
В соответствии с результатами исследования выявлено отсутствие корреляций между уровнем экспрессии молекул адгезии нейтрофилами с содержанием ней-трофилов, имеющих 1, 2 и 3 сегмента в ядре. Наличие корреляций с 4, а тем более с 5 сегментными формами, позволяет предполагать, что при отсутствии антигенной стимуляции молекулы адгезии начинают экспрессиро-ваться на 4-х сегментных формах, тогда как в полной мере этот процесс проявляется у нейтрофилов с 5-ю и более сегментами в ядре.
Заключение. Вероятно, в условиях отсутствия антигенной стимуляции наибольшая готовность к реали-
зации фазы скольжения, прочной адгезии и непосредственно самой трансмиграции наблюдается именно у нейтрофилов с 5 сегментами в ядре. Это подтверждает уже известный факт: сегментация ядра - проявление морфологической адаптации клетки, которая необходима для преодоления довольно узких межклеточных пространств, в частности, между эндотелиоцитами или клетками соединительной ткани [1].
ЛИТЕРАТУРА
1. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург; 2001.
2. Кошевенко Ю.Н. Механизмы клеточного иммунитета в коже. Косметика и медицина. 2001; 3: 15-26.
3. ПинегинБ.В. Нейтрофилы: структура и функция. Иммунология. 2007; 28 (6): 374-82.
4. Цинкернагель Р. Основы иммунологии. Мир; 2008.
5. Ярилин А.А. Кожа и иммунная система. Косметика и медицина. 2001; 2: 5-13.
6. фрейдлин Й.С. Иммунная система и ее дефекты. СПб: НТФФ «Полисан»; 1998.
7. Пальцев М.А. Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина; 1995.
8. фрейдлинИ.С. Клетки иммунной системы. СПб.: Наука; 2001.
9. Тодоров Й.Т. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София; 1968.
10. Smith C.A. CD30 antigen, a marker for Hodgkin lymphoma, is a receptor whose ligand defines an emerging family of cytokines with homology to TNF. Cell. 1993; 73: 1349-60.
11. Rot A. Neutrophil attractant/activation protein-1 (interleukin-8) induces in vitro neutrophil migration by haptotactic mechanism. Eur. J. Immunol. 1993; 23: 303-6.
12. Rot A., Hub E., Middleton J. Some aspects of IL-8 pathophysiology. III Chemokine interaction with endothelial cells. J. Leukocyte Biol. 1996; 5 (9): 3944.
REFERENCES
1. DolgushinI.I., Bukharin O.V. Neutrophils and Homeostasis. Ekaterinburg; 2011 (in Russian).
2. Koshevenko Yu.N. Mechanisms of cellular immunity of the skin. Cosmetics and Medicine. 2001; 3: 15-26 (in Russian).
3. Pinegin B.V. Netrophils: structure and function of. Immunology. 2007; 28 (6): 374-82 (in Russian).
4. Tsinkernagel' R. Fundamentals of Immunology. World; 2008 (in Russian).
5. Yarilin A.A. The skin and the immune system. The Cosmetics and Medicine. 2001; 2: 5-13 (in Russian).
6. Freydlin I.S. The immune system and its defects. St. Petersburg: NTFF "Polysan"; 1998 (in Russian).
7. Pal'tsev M.A. Intercellular interaction. M.: Medicine; 1995 (in Russian).
8. Freydlin I.S., Totolyan A.A. Cells of the immune system. St. Petersburg: Nauka. 2001 (in Russian).
9. Todorov Y.T. Clinical laboratory research in pediatrics. Sofia; 1968 (in Russian).
10. Smith C.A. CD30 antigen, a marker for Hodgkin lymphoma, is a receptor whose ligand defines an emerging family of cytokines with homology to TNF. Cell. 1993; 73: 1349-60.
11. Rot A. Neutrophil attractant/activation protein-1 (interleukin-8) induces in vitro neutrophil migration by haptotactic mechanism. Eur. J. Immunol. 1993; 23: 303-6.
12. Rot A., Hub E., Middleton J. Some aspects of IL-8 pathophysiology. III Chemokine interaction with endothelial cells. J. Leukocyte Biol. 1996; 5 (9): 3944.
Поступила 10.01.13
