CC BY
8
УДК 577.15
УПРАВЛЕНИЕ БИОКАТАЛИЗОМ ПАРЫ а-ХИМОТРИПСИН - ИНГИБИТОР БАУМАНА-БИРКА, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ГИБРИДНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ МАГНЕТИТ-ЗОЛОТО, С ПОМОЩЬЮ НЕГРЕЮЩЕГО НИЗКОЧАСТОТНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ
М.М. Веселов1*, Н.И. Коломоец1, А.Р. Блинова1, М.В. Ефремова1,2, Ю. Чудосай1, А.Н. Прусов3, А.О. Жигачев4, Ю.И. Головин 14, Н.Л. Клячко1,4*
(1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; 2Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», Москва; 3 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова; 4Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина; *e-mail: klyachko@enzyme. chem.msu.ru; [email protected])
Гибридные магнитные наночастицы магнетит-золото типа гантель были использованы для иммобилизации двух белков: а-химотрипсина и ингибитора Баумана-Бир-ка. Показано, что под влиянием низкочастотного магнитного поля (50 Гц) активность химотрипсина, связанного в комплекс с ингибитором, резко снижается в зависимости от индукции магнитного поля. Нами высказано предположение, что этот эффект связан с агрегацией магнитных наночастиц под действием магнитного поля.
Ключевые слова: магнитные наночастицы, иммобилизация ферментов, низкочастотное магнитное поле, агрегация наночастиц, управление биокатализом.
Используемые сокращения: МНЧ - магнитные наночастицы, ПМП - переменное магнитное поле, НЧ - низкочастотное, N-DOPA - нитро-дофамин, EDC - N-(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимида гидрохлорид, S-NHS - 4-сульфо-^ гидроксисукцинимид; СТ - а-химотрипсин; BBI - ингибитор Баумана-Бирка, NSAAP-FPNA - N-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил-паранитроанилид, PDAM -пиринилдиазометан, PEG - полиэтиленгликоль, NTA - анализ траектории наночастиц, ТЕМ - просвечивающая электронная микроскопия.
Магнитные наночастицы крайне интересны в качестве носителей для иммобилизации ферментов. Они обладают большой удельной поверхностю, легко осуществляют массопере-нос субстрата к поверхности (что свойственно большинству наноразмерных носителей для иммобилизации ферментов), а кроме того, реагируют на внешнее магнитное поле. Благодаря перечисленным свойствам их можно использовать для выделения ферментов из культуральной среды [1], создания биосенсоров [2] и управления процессами биокатализа [3-5]. Магнитные наночастицы трансформируют энергию внешнего переменного магнитного поля в физические или химические изменения, которые происходят в биомолекулярных структурах, взаимодействующих с ними. Эти изменения могут быть активированы магнитной гипертермией [3, 6], колебательно-вращательными движениями МНЧ [7-9], а также процессами их агрегации-
дезагрегации [4, 10]. Магнитная гипертермия, основанная на трансформации энергии высокочастотного магнитного поля (f = 200-600 кГц) в тепловую энергию вследствие релаксации магнитных моментов МНЧ в ПМП, обычно приводит к частичной или полной инактивации ферментов ввиду их крайне низкой температурной стабильности. С помощью магнито-наномеха-нического подхода, основанного на приведении МНЧ в колебательно-вращательное движение под действием ПМП, удалось увеличить активность химотрипсина, связанного в комплекс с ингибитором трипсина [11]. Однако в качестве примеров управления биокаталитическими процессами в присутствии МНЧ наиболее интересны работы, в которых магнитное поле приводит к агрегации или дезагрегации МНЧ, в результате чего происходит увеличение скорости ферментативной реакции. Так, в [4] было показано, что стимулируемая магнитным полем агрегация
двух популяций МНЧ, на поверхности одной из которых был иммобилизован фермент, а на поверхности другой - субстрат, приводит к их колокализации и активации ферментативной реакции. В работе [10] продемонстрировано, что во вращающемся магнитном поле активность липазы, иммобилизованной на агрегатах МНЧ, увеличивается в зависимости от его частоты. Авторы [10] связывают данный эффект с дезагрегацией наночастиц, в результате чего активный центр фермента становится более доступным для субстрата. Однако не следует исключать и того, что в результате вращения на-ночастиц увеличивается частота столкновений фермента с субстратом.
В настоящей работе представлена биокаталитическая система, управляемая с помощью низкочастотного ПМП (f < 1 кГц). Мы синтезировали два типа гибридных наночастиц магнетит-золото типа гантель с иммобилизованным а-химотрипсином или ингибитором Баумана-Бирка на их поверхности.
Цель работы - изучение влияния НЧ ПМП на эффективность работы фермента в составе ком -плекса с ингибитором в нананочастицах.
Экспериментальная часть
Материалы
В работе использовали следующие реагенты: пентакарбонил железа (Fe(CO)5), олеиламин, окта-децен-1, олеиновую кислоту, золотохлорводород-ную кислоту трехводную (HAuCl43H2O), 1,2-гек-садекандиол, липоевую кислоту, 4-N-DOPA, EDC, S-NHS, а-химотрипсин из поджелудочной железы быка, BBI, NSAAPFpNA, лимонную кислоту, цитрат натрия, трис(гидроксиметил)амино-метан (TRIS), тетрагидрат тартрата калия-натрия (KNaC4H4O6 4H2O), реагент Фолина-Чокальтеу (2 M раствор), PDAM - все производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Применяли также метокси-полиэтиленгликоль-сукцинимид с молекулярной массой 5 кДа («Nanocs», США). Соляную кислоту (HCl) «ос.ч.» («Сигма Тек», Россия). Гидроксид натрия (NaOH) «х.ч.» (Россия), ацето-нитрил «ос.ч.» («Химмед», Россия), 1,4-диоксан («Химмед», Россия). Для всех экспериментов использовали деионизованную воду (18.2 MQ/см Werner EASYpure II).
Методы
Синтез гибридных МНЧ магнетит-золото.
В трехгорлой колбе объемом 250 мл, снабженной обратным холодильником и термометром,
смешивали 20 мл октадецена, 2 мл олеиламина, 1,9 мл олеиновой кислоты и 2,384 г гексадеканди-ола. Смесь нагревали до 120 °С и выдерживали при этой температуре 30 мин в токе аргона. Затем добавляли 0,3 мл Ре(СО)5, перемешивали 3 мин и добавляли смесь, содержащую 40 мг НАиС143Н2О в 5 мл октадецена и 0,5 мл оле-иламина. Затем реакционную смесь нагревали до 300 °С и выдерживали при этой температуре 45 мин, после чего охлаждали до комнатной температуры и перемешивали на воздухе в течение 1 ч. Для очистки синтезированных гибридных МНЧ в колбу добавляли 50 мл изо-пропилового спирта и центрифугировали 10 мин при 4300 g три раза. Гибридные МНЧ ресуспен-дировали в гексане.
Функционализация золотой поверхности гибридных МНЧ. Для функционализации поверхности МНЧ был выбран тиолсодержащий лиганд - липоевая кислота. Для этого к суспензии гибридных МНЧ в гексане добавляли раствор липоевой кислоты в изо-пропаноле (1 мг/мл). Смесь перемешивали в течение суток при комнатной температуре, после чего декантировали с помощью магнита. Осадок дважды промывали гексаном, удаляли растворитель и высушивали в токе аргона.
Получение водорастворимых гибридных МНЧ. Для получения водорастворимых гибридных МНЧ их было необходимо модифицировать гидрофильным полимером. Для этого на первом этапе синтезировали конъюгат Н-ООРА-РБО: 33 мг шРЕО-ЫШ, 1,65 мг Н-ЭОРА и 13 мг К2СО3 растворили в смеси 2 мл хлороформа и 1 мл дихлорметана. Смесь перемешивали 2 ч, после чего добавляли к сухим функционализи-рованным гибридным МНЧ. Смесь перемешивали 12 ч, после чего проводили трехкратный диализ относительно воды в диализных мешках 8рес1га/Рог с порами 12-14 кДа.
Определение количества карбоксильных групп на поверхности гибридных МНЧ. Для определения числа карбоксильных групп на поверхности гибридных МНЧ использовали флуо-ресцентый агент РЭАМ. Эксперимент проводили следующим образом (рис. 1): суспензию гибридных МНЧ смешивали с РБАМ, растворенном в смеси воды и диоксана (1:1). Для очистки от непрореагировавшего РБАМ через 90 мин МНЧ осаждали с помощью магнита. Затем к ре-суспендированному конъюгату МНЧ-РЭАМ добавляли раствор цианида калия (для того, чтобы растворить золото) и снова осаждали МНЧ с
Рис. 1. Схема определения карбоксильных групп на поверхности гибридных МНЧ
помощью магнита. После этого измеряли интенсивность флуоресценции оставшегося в растворе пиренилметиленового эфира липоевой кислоты (^возб = 340 нм, Хэм = 395 нм). Концентрацию карбоксильных групп определяли по градуиро-вочной кривой стандартных образцов липоевой кислоты в концентрации 0,1-1,0 мкМ.
Иммобилизация СТ и BBI на поверхности МНЧ. Для иммобилизации белков на поверхности МНЧ использовали карбодиимидный метод. Для этого функционализированные наночастицы смешивали с цитратным буфером (20 мМ, рН 4,5), добавляли EDC, S-NHS и белок (количество добавляемых веществ приведено в таблице). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Очистку от «непришитого» фермента и низкомолекулярных соединений проводили трехкратной магнитной декантацией. Полученные на-ночастицы растворяли в цитратном буфере. В результате были синтезированы образцы наночастиц МНЧ-СТ и МНЧ-BBI с иммобилизованными на их поверхности СТ и BBI соответственно.
Определение концентрации иммобилизованных белков. Концентрацию иммобилизованных на поверхности гибридных МНЧ белков определяли с помощью метода Лоури. Для этого к 1 мл реактива Лоури (49 мл 2%-го №2С03 в 0,1 М НаОИ; 0,5 мл 1%-го водного раствора Си804-5И20 и 0,5 мл 2%-го водного раствора КНаС4Ы406-4И20) добавляли 0,1 мл стандартных растворов или исследуемых образцов. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре, после чего добавляли 0,1 мл реактива Фолина-Чокальтеу (1 М). Смесь перемешивали 40 мин при комнатной температуре, после чего переносили в лунки микропланшета и регистрировали оптическую плотность на длине волны 750 нм. Измерения проводили в трех повторах. Концентрацию исследуемых образцов определяли по калибровочной кривой стандартных образцов
Влияние НЧ ПМП на кинетику ферментативной реакции иммобилизованного СТ. За ферментативной активностью иммобилизо-
Условия иммобилизации СТ и BBI на поверхности гибридных МНЧ
Образец МНЧ, мл Цитратный буфер, мл EDC, мг S-NHS, мг СТ, мг BBI, мкг
МНЧ-СТ 1,0 1,50 0,250 0,250 0,5 -
МНЧ-BBI 0,3 0,45 0,125 0,125 - 43
ванного СТ следили спектрофотометрически, изучая реакцию ферментативного гидролиза субстрата NSAAPFPNA по образованию окрашенного продукта (пара-нитроанилина) на длине волны 405 нм. Для этого в кювету на 0,5 мл добавляли буферный раствор TRIS-HCl (20 мМ, рН 8,2) и суспензии МНЧ-СТ и МНЧ-BBI. Смесь инкубировали 5 мин до полного связывания фермента с ингибитором. Реакцию запускали добавлением раствора субстрата в смеси ацетонитрила и ди-оксана (1:1). Конечная концентрация субстрата в кювете составляла 80 мкМ. Кювету помещали в генератор «НЧ ПМП AstraM-Sp» (ООО «На-нодиагностика», Тамбов, Россия), снабженный спектрофотометром «AvaSpec 2048» («Avantes», Нидерланды), что позволило регистрировать кинетические кривые реакции in situ при периодическом включении и выключении магнитного поля. Регулируемый по частоте и величине индуктивности генератор ПМП позволял создавать в термостатируемом рабочем объеме поле частотой от 20 до 400 Гц с индукцией от 5 до 300 мТл.
Характеризация образцов. Образцы функцио-нализированных МНЧ и образцов с иммобилизованными белками были охарактеризованы методами NTA и ТЕМ. Анализ NTA проводили на приборе «NanoSight NS500» («Malvern», Великобритания), оснащенном лазером с длиной волны 532 нм и мощностью 80 мВт. Образцы для NTA растворяли в деионизованной воде, предварительно профильтрованной через фильтр 0,22 мкм. Распределение МНЧ по размерам определяли по пяти видео длительностью 90 с, TEM проводили на приборе «JEM-2010» («JEOL», Япония) с ускоряющим напряжением 200 кВ. Образцы для ТЕМ были приготовлены высушиванием капли образца на медной сетке (200 mesh). Средний диаметр МНЧ определяли по фотографиям ТЕМ, анализируя не менее 300 частиц с помощью прибора «ImageJ software» («National Institutes of Health», США).
Результаты и их обсуждение
Гибридные МНЧ (ГМНЧ) типа гантель синтезированы методом высокотемпературного разложения Fe(CO)5 на поверхности наночастиц золота в высококипящих растворителях с последующим охлаждением и окислением на воздухе согласно нашей методике [12]. При этом нано-частицы золота, используемые в качестве зародышей, получены in situ в процессе синтеза.
Размер и морфология гибридных МНЧ оха-рактеризированы методом ТЕМ. На рис. 2, А
показано, что синтезированные МНЧ имеют гибридное строение. Они представляют собой сросшиеся частицы магнетита октаэдрической формы с наибольшим размером 25 ± 2 нм и сферические частицы золота диаметром 9 ± 1 нм. При этом на каждое зерно магнетита приходится лишь один зародыш золота. Такое соотношение достигается в результате того, что предварительно синтезированные наночастицы золота выступают в качестве зародышей для роста кристаллов железа на их гранях.
Модификация поверхности ГМНЧ. На первом этапе работы было необходимо модифицировать поверхность МНЧ в целях придания им водорастворимых свойств и введения функциональных групп для последующей иммобилизации белков. Для этого поверхность золота сначала была функционализирована липоевой кислотой. Связывание липоевой кислоты с золотом происходит за счет образования крайне прочной связи S-Au (энергия связи ~40 кДж/моль). Кроме того, липоевая кислота содержит в своем составе карбоксильную группу, с помощью ко -торой в дальнейшем можно легко иммобилизовать белки. Чтобы перевести функционализиро-ванные МНЧ из органической фазы в водную, поверхность магнетита модифицировали конъ-югатом N-DOPA-PEG. Связывание происходит за счет замещения гидроксильных групп на поверхности магнетита гидроксильными группами дофамина. ГМНЧ приобретают водорастворимые свойства благодаря наличию PEG на их поверхности.
Анализ синтезированных водных суспензий ГМНЧ методом NTA показал (рис. 2, Б), что в водном растворе ГМНЧ имеют средний размер 166 ± 5нм, а концентрация ГМНЧ составляет 1,7 1013частиц/мл.
Определение числа карбоксильных групп на поверхности гибридных МНЧ. Химическая иммобилизация белков на поверхности носителя подразумевает образование ковалентной связи между функциональными группами на поверхности носителя и группами на поверхности белка. Таким образом, важной характеристикой носителя служит число функциональных групп. Обычно для определения этого показателя используют флуоресцентные метки, которые селективно связываются с функциональными группами на поверхности носителя. Однако рассеяние света наночастицами может мешать правильному определению интенсивности флуоресценции. В связи с этим нами был разработан
модифицированный метод определения карбоксильных групп на поверхности ГМНЧ с помощью флуоресцентой метки PDAM [13]. Он заключается в связывании метки с карбоксильными группами липоевой кислоты на поверхности МНЧ, после чего кристаллы золота переводятся в раствор в присутствии цианид-иона. В результате получается раствор, содержащий конъюгат липоевой кислоты с PDAM и не содержащий наночастицы. Далее мы измеряли флуоресценцию PDAM и определяли число карбоксильных групп по калибровочной кривой. В этих целях использовали PDAM, не модифицированный липоевой кислотой, поскольку образование конъюгата PDAM с липоевой кислотой не приводит к изменению его флуоресценции. Калибровочная кривая имела линейный вид в диапазоне от 110-7 до 110-6 М. Измеренная концентрация карбоксильных групп составила 8,8 10-5 ± 0,9 М.
Проведенная нами теоретическая оценка полученного результата показала следующее. На одну гибридную МНЧ приходится 3200 ± 300 молекул липоевой кислоты. Если принять золотую часть гибридной МНЧ за сферу с диаметром 9 нм, площадь ее поверхности составит 243 нм2. Возможны два предельных случая покрытия золотой наночастицы липоевой кислотой, когда одна молекула связана двумя или одним атомом серы. Таким образом, число молекул липоевой кислоты, приходящихся на одну наночастицу, лежит в диапазоне 2000-8000 при условии покрытия поверхности золотой наночастицы монослоем липоевой кислоты. Оцененное нами количество липоевой кислоты на поверхности ГМНЧ укладывается в данный диапазон.
Иммобилизация СТ и ВВ1 на поверхности гибридных МНЧ. Для иммобилизации белков на поверхности МНЧ был выбран карбодиимидный
А
Гидродинамический размер, нм
Рис. 2. Микрофотография ТЭМ (А) и анализ распределения по размерам методом ЭТА (Б) гибридных МНЧ
метод. Карбоксильные группы липоевой кислоты на поверхности ГМНЧ образуют амидную связь с аминогруппами лизинов на поверхности белков (рис. 3). Гидродинамический размер синтезированных наноконъюгатов определяли методом NTA. Из рис. 4, А видно, что в результате иммобилизации размер наночастиц с иммобилизованным белком не меняется, а концентрация частиц уменьшается. Это связано с тем, что в ходе очистки далеко не все ГМНЧ осаждаются магнитом. На микрофотографиях ТЕМ (рис. 4, Б, В) видно, что частицы собраны в агрегаты. Однако это не может свидетельствовать об агрегации образцов, так как при высыхании на медной сетке для микроскопии МНЧ свойственна агрегация.
Мы определили количество иммобилизованных на поверхности МНЧ белков с помощью метода Лоури, где аналитическим сигналом служит светопоглощение на длине волны 750 нм, а в этой области спектра наночастицы меньше всего рассеивают свет. Концентрация иммоби-
лизованного СТ составила 102 мкг/мл, а BBI -25 мкг/мл. Мы исследовали количество белков, оставшихся в надосадочной жидкости после очистки на стадии иммобилизации. Суммарная масса иммобилизованных и неиммобилизован-ных белков была равна их массе, взятой для иммобилизации.
Влияние НЧ ПМП на кинетику ферментативной реакции иммобилизованного СТ. За активностью иммобилизованного СТ следили, изучая реакцию ферментативного гидролиза субстрата NSAAPFFNA, по образованию окрашенного продукта пара-нитроанилина. На первом этапе мы подобрали оптимальное соотношение ингибитора по отношению к ферменту, для того чтобы остаточная активность СТ составила 10%. На рис. 5, А видно, что при увеличении соотношения CI/CE наблюдается резкое снижение активности фермента и при соотношении 1/6 она достигает 10% от активности фермента без ингибитора. Таким образом, для дальнейшего
ж /'""-СООН /Оелок)
JÊB
^FeToT^^ EDC, S-NHS
-^ ШЦРЛ
^^^^ Белок
Рис. 3. Схема иммобилизации СТ и BBI на поверхности ГМНЧ
Гидродинамический размер, нм
Рис. 4. Характеризация препаратов иммобилизованных ферментов. Гидродинамический размер МНЧ (1), МНЧ-СТ (2) и МНЧ-ББ1 (3), исследованный методом ОТА (А). Микрофотографии ПЭМ МНЧ-СТ (Б)
и МНЧ-ББ1 (В)
Время, с
—1-1-1-1-Г~
20 100 275
Интенсивность поля, мТл
Рис. 5. Кинетика ферменативной реакции гидролиза NSAAPFPNA под действием НЧ ПМП частотой 50 Гц. А - зависимость остаточной активность МНЧ-СТ от соотношения МНЧ-БЫ/МНЧ-СТ (CI/ CE). Б - кинетическая кривая реакции с МНЧ-СТ. В - изменение наклона кинетической кривой при воздействии НЧ ПМП: 1 - до включения, 2 - во время действия, 3 - по окончании действия f = 50 Гц; B = 20 мТл, B = 100 мТл, B = 275 мТл) при CI/CE = 6. Буфер TRIS-HCl (20 мМ; pH 8,2; 25 °С). На кинетических кривых закрашенные кружки соответствуют моментам без действия поля, пустые кружки соответствуют моментам, когда поле включено
эксперимента нами было выбрано соотношение CI/CE, равное 6.
В работе изучено влияние НЧ ПМП (f = 50 Гц, В = 20-275 мТл) на активность иммобилизован-
ного СТ. Так, активность МНЧ-СТ в отсутствие ингибитора не изменялась в результате воздействия поля (рис. 5, Б). Вместе с тем активность пары МНЧ-СТ - МНЧ-ВВ1 резко снижается под
Рис. 6. Схематическое представление влияния НЧ ПМП на МНЧ-СТ (А) и комплекс МНЧ-СТ - МНЧ-BBI (Б)
действием НЧ ПМП (рис. 5, В). Степень этого влияния зависит от индукции ПМП. Так, при низкой интенсивности поля, равной 20 мТл, сразу после включения поля уменьшается в два раза тангенс угла наклона на кинетической кривой. При интенсивности поля, равной 100 мТл, тангенс угла наклона становится практически равным нулю, что означает полную остановку ферментативной реакции. При самой высокой интенсивности поля, равной 275 мТл, наблюдается резкое снижение оптической плотности. Этот процесс обратим, и при выключении НЧ ПМП наблюдается мгновенное восстановление тангенса угла наклона до исходных значений. Рассмотренный эффект можно объяснить следующим образом. В результате взаимодействия МНЧ-СТ и МНЧ-ВВ1 образуется фермент-инги-биторная пара. В суспензии образуются димер-ные наночастицы (рис. 6). В магнитном поле МНЧ склонны к агрегации в результате действия магнитостатических сил, величина которых тем больше, чем больше магнитный момент частицы. При образовании димерного комплекса МНЧ-СТ - МНЧ-ВВ1 его суммарный магнитный момент возрастает, а следовательно, увеличивается и склонность к агрегации в магнитном
поле. Сила магнитного воздействия также зависит от интенсивности поля и возрастает при его увеличении. При отключении магнитного поля сила магнитного воздействия исчезает и происходит дезагрегация наночастиц.
Заключение
Таким образом, в работе продемонстрирована возможность управления биокатализом за счет агрегации-дезагрегации магнитно-золотых наночастиц типа гантель, содержащих фермент и его ингибитор, под действием низкочастотного магнитного поля, что перспективно для использования в разных областях, например в биомедицине.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 17-54-33027, № 18-2909154 и № 18-33-01232 мол_а), Госрегистра-ционной темы АААА-А16-116052010081-5, Договора с ООО «Наноматериалы», а также с использованием оборудования, закупленного по Программе развития МГУ имени М.В. Ломоносова ПНР 5-13. Конфликта интересов нет. Дополнительных материалов нет.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Safarik I., Safarikova M. // BioMagnetic Research and Technology. 2004. Vol. 2. Р. 1.
2. Katz E, Willner I. // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. Vol. 43. N 45. P. 6042.
3. Armenia I., Valeria GrazuBonavia M., de Matteis L., et. al. // J. Colloid Interface Sci. 2018. Vol. 573. P. 615.
4. Zakharchenko A., Guz N., Laradji A. M., et. al. // Nature Catalysis. 2017. 1. N 1. P. 73.
5. Klyachko N. L., Sokolsky-Papkov M., Pothayee N., et. al. // Angew. Chem. Intern. Ed. 2012. Vol. 51. N 48. P. 12016.
6. Seino S., Yoshida K., Watanabe K. // J. Magn. Soc. Jpn. 2014 Vol. 38. P. 98.
7. Golovin Yu.I., Gribanovsky S.L., Golovin D.Y., Klyachko N.L., Majouga A.G., Master A.M., Sokolsky M., Kabanov A.V. // J. Control. Release. 2015. Vol. 219. P. 43.
8. Golovin Yu.I., Klyachko N.L., Majouga A.G., Sokolsky M.,
KabanovA.V. // J. Nanopart. Res. 2017. Vol. 19. P. 63.
9. Le-Deygen I.M., Vlasova K.Yu., Kutsenok E.O., et.al. // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2019. Vol. 21. P. 102065.
10. Mizuki T., Sawai M., Nagaoka Y., et. al. // PLoS ONE. 2013 Vol. 8. N 6. P. 66528.
11. Efremova, M. V., Veselov, M. M., Barulin, A. V., et. al. // ACS Nano. 2018. Vol. 12. N 4. 3. P. 190.
12. Efremova, M.V., Naumenko, V.A., Spasova, M., et. al. // Sci. Reports. 2018. Vol. 8. P. 11295.
13. NimuraN., Kinoshita T., Yoshida T., et. al. // Anal. Chem. 1988. Vol. 60. P. 2067.
Поступила в редакцию 10.01.2020 Получена после доработки 12.01.2020 Принята к публикации 20.01.2020
BIOCATALYSIS OF A-CHYMOTRYPSIN - BOWMAN-BIRK INHIBITOR PAIR IMMOBILIZED ONTO HYBRID MAGNETITE-GOLD NANOPARTICLES MANAGEMENT UNDER EXPOSURE OF LOW-FREQUENCY MAGNETIC FIELD
M.M. Veselov1*, N.I. Kolomoec1, A.R. Blinova \ M.V. Efremova1'2, Yu.V. Chudosay 1, A.N. Prusov3, A.O. Zhigachev4, Y.I. Golovin1,4, N.L. Klyachko1,4*
(1 Department of Chemical Enzymology, School of Chemistry, LomonosovMoscow State University; 2National Research Technical University MISIS, Moscow; 3A.N.Belozersky Research Institute of Physical Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University; 4G.R. Derzhavin Tambov State University, Tambov; *e-mail: [email protected]. msu.ru; [email protected])
Dumbbell-like hybrid magnetite-gold magnetic nanoparticles was used to immobilize two proteins: a-chymotrypsin and Bowman-Birk inhibitor. It was shown that under exposure of low-frequency 50 Hz magnetic field the activity of chymotrypsin bounded to inhibitor dramatically decrease depending on magnetic field strength. This effect is supposed to be the consequence of aggregation of magnetic nanoparticles under magnetic field action.
Key words: magnetic nanoparticles, enzyme immobilization, low-frequency magnetic field, nanoparticles aggregation, biocatalysis regulation.
Сведения об авторах: Веселов Максим Михайлович - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Коломоец Никита Иванович - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Блинова Анастасия Романовна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Ефремова Мария Владимировна - науч. сотр. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук ([email protected]); Чудосай Юлия Викторовна - студентка факультета наук о материалах МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Прусов Андрей Николаевич - ст. науч. сотр. НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук (prusov@genebee. msu.su); Жигачев Александр Олегович - аспирант ТГУ ([email protected]); Головин Юрий Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, директор Центра нанотехнологий и наноматериалов ТГУ, докт. физ-матем. наук ([email protected]); Клячко Наталья Львовна - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук ([email protected]).
