CC BY
142
I I I I I
Ш
Новости клеточных технологий
уровни пролиферации и клоногенный потенциал мутантных мультипотентных клеток-предшественниц в сравнении с ГСК. Уровень пролиферации мутантных клеток-предше-ственниц и ГСК несущественно отличался от уровней пролиферации клеток дикого типа, в то время как в случае тройной мутации заметно снижалось число апоптотических клеток, что было показано окрашиванием аннексином-У. Способность же формировать гемопоэтические колонии у мутантных клеток была существенно повышена в сравнении с клетками дикого типа. Было дополнительно показано, что мутантные Sca-1+/c-kit+/CD150-/CD48-/Lin- клетки способны отвечать на стимуляцию Flt-3-лигандом. Это доказывает, что в связи с мутацией они не приобретают свойств ГСК, которые не способны реагировать на Flt-3-лиганд.
Мутация Тф53--/-/р'161пк4а-/'-/р'19Аг^/'- не приводит к приобретению другими, более дифференцированными клетками способности к длительному восстановлению костного мозга. Авторы показали это, трансплантируя облученным реципиентам мутантные клетки-предшественницы ми-елоидного либо гранулоцитарно-макрофагального ряда.
Возможно, иерархическая система клеток-предше-ственниц разных уровней дифференцировки возникла в эволюции как защита от накопления пролиферирующими популяциями клеток онкогенных мутаций. Действительно, утрата генов, отвечающих за подавление самообновления популяции ГСК, приводила к восстановлению этого свойства у их потомства. Однако более дифференцированные клетки с такой же мутацией все равно имели ограниченный срок жизни, не приобретая онкогенного потенциала. Это свидетельствует о том, что существуют другие генетические пути озлокачествления как гемопоэтических, так и прочих камбиальных клеток тканей организма. Результаты этой работы весьма интересны и объясняют, по какой причине при развитии некоторых онкологических заболеваний нарушается экспрессия генов Тгр53 и Cdkn2a [8-11]. Авторы считают, что они могут быть использованы в разработке генной терапии онкозаболеваний. В то же время, требуются дальнейшие исследования в данном направлении, так как полная картина генетического контроля свойств ГСК и их потомства остается неясной.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Morrison S.J., Weissman I.L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity 1994; 1: 661-73.
2. Clarke M.F., Fuller M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell 2006; 124: 1111-5.
3. Morrison S.J. A genetic determinant that specifically regulates the frequency of hematopoietic stem cells. J. Immunol. 2002; 168: 635-42.
4. Park I., Qian D., Kiel M. et al. Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells. Nature 2003; 423: 302-5.
5. Jacobs J.J., Kieboom K., Marino S. et. al. The oncogene and Polycomb-group gene bmi-1 regulates cell proliferation and senescence through the ink4a locus. Nature 1999; 397: 164-8.
6. Molofsky A., Pardal R., Iwashita T. et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell selfrenewal from progenitor proliferation. Nature 2003; 425: 962-7.
7. Molofsky A.V., He S., Bydon M. et. al. Bmi-1 promotes neural stem cell
self-renewal and neural development but not mouse growth and survival by repressing the p16Ink4a and p19Arf senescence pathways. Genes Dev. 2005; 19: 1432-7.
8. Berggren P., Kumar R., Sakano S. et al. Detecting homozygous deletions in the CDKN2A(p16INK4a)/ARF(p14ARF) gene in urinary bladder cancer using real-time quantitative PCR. Clin. Cancer Res. 2003; 9: 235-42.
9. Esteller M., Guo M., Moreno V. et al. Hypermethylation-associated inactivation of p14ARF is independent of p16INK4a methylation and p53 mutational status. Cancer Res. 2000; 60: 129-33.
10. Weber A., Bellmann U., Bootz F. et. al. INK4a-ARF alterations and p53 mutations in primary and consecutive squamous cell carcinoma of the head and neck. Virchows Arch. 2002; 441: 133-42.
11. Burke L., Flieder D., Guinee D. et al. Prognostic implications of molecular and immunohistochemical profiles of the Rb and p53 cell cycle regulatory pathways in primary non-small cell lung carcinoma. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 232-41.
Подготовила A.C. Григорян
По материалам: Akala O.O., Park I.-K, Qian D. et al. Long-term haematopoietic reconstitution by Trp53-/-/p16Ink4a-/-/p19Art/- multipotent progenitors. Nature 2008; 453(7192): 228-32
uPA и uPAR опосредуют тропизм стволовых клеток к злокачественным новообразованиям
Детализация механизмов, контролирующих процессы миграции клеток-предшественниц в организме, является важной теоретической предпосылкой для успешного применения клеточных технологий в медицине. Установлено, что как мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки [ММСК], так и гемопоэтические стволовые клетки [ГСК] находятся не в стационарном, а в постоянном динамическом состоянии - мигрируют между основным депо - костным мозгом - и периферическими тканями [1, 2]. В этой связи, управление механизмами хемотаксиса стволовых клеток и клеток-предшественниц может являться эффективным подходом для оптимизации лечения пациентов с различными дегенеративно-дистрофическими заболеваниями, травматическими повреждениями и новообразованиями.
Способность стволовых клеток к направленному хемотаксису в область локализации патологического очага, такого как
воспаление или новообразование, называется патотропизмом и характерна для нейральных [3, 4] и гемопоэтических стволовых клеток [5], ММСК [6], клеток-предшественниц эндотелия [7]. Единого представления о биологической значимости этого процесса нет, однако показано участие мигрирующих недифференцированных клеток в процессах регенерации [8], ангиогенеза [7], а также в формировании стромы опухолей [9].
В настоящее время активно проводятся исследования, нацеленные на идентификацию биохимических механизмов, регулирующих хемотаксис стволовых клеток и клеток-пред-шественниц. Например, для ГСК установлены оси хемотаксиса SDF-1/CXCR4, SCF/c-Kit, VEGF/VEGFR, HGF/c-Met, вовлеченные в процессы миграции к очагам воспаления. Особый интерес представляет тропность ММСК и нейральных стволовых клеток к новообразованиям. В частности, ис-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
4- I ■■ тп
Новости клеточных технологий
следуется идея адресной доставки лекарственных веществ, «нагруженных» на клетки-предшественницы, к новообразованиям [см. рис.] [10]. В этой связи, активно выявляются биохимические механизмы, обуславливающие явление патотропизма.
В настоящий момент установлено, что хемоаттрактанта-ми предшественниц клеток нервной ткани являются VEGF, SDF-1, SCF, которые продуцируются опухолевыми клетками [10-12]. Дальнейшее развитие представлений о механизмах патотропизма стволовых клеток связано с материалами исследования M. Gutova с соавт., опубликованными в журнале Stem Cell [2008]. В работе показана роль уроки-назного активатора плазминогена [urokinase plasminogen activator, uPA) и его рецептора как индукторов миграции фетальных мезенхимных и иммортализированных нейральных стволовых клеток. Рецептор uPA [CD 87] через G-белок связан с витронектином; взаимодействует с интегринами, что обусловливает его участие в процессах хоуминга, адгезии, пролиферации и апоптоза [13].
На первом этапе исследователи методом проточной цитометрии определили уровень экспрессии рецептора uPA в разных опухолях. К первой группе отнесли агрессивные
новообразования, у 20% клеток которых наблюдалась положительная реакция на CD87 [мультиформная глиобласто-ма, нейробластома, карцинома молочной железы, простаты, крупноклеточный рак легкого], ко второй - опухоли с низким уровнем экспрессии рецептора uPA - около 5 % [карцинома толстой кишки, метастатическая нейробластома, мелкоклеточный рак легкого]. In vitro оценивали миграцию клеток-предшественниц с помощью двухкамерной культуральной системы. Кондиционированная среда, в которой ранее инкубировались опухолевые клетки, секретирующие uPA и растворимую фракцию его рецептора, добавлялась в нижнюю камеру, а исследуемые клетки высевались на пористую перегородку, разделявшую отделы системы. Наибольшее количество стволовых клеток переместилось в нижнюю камеру в эксперименте со средой от линий малигнизированных клеток, высоко экспрессирующих CD87. Интересно, что большое количество клеток, отреагировавших на присутствие хемоаттрактанта, определялось среди популяции нейральных клеток-предшественниц.
Для подтверждения основной роли uPA и его рецептора в хоуминге авторы определяли содержание исследуемых хемоаттрактантов в культуральной среде. Было выявлено
Адресное воздействие противоопухолевого лекарственного препарата, обусловленное хемотаксисом генетически модифицированных стволовых клеток, экспрессирующих фермент, который участвует в метаболизме лекарственного вещества
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
■ И I II II
ш
Новости клеточных технологий
практически полное соответствие величины концентрации uPA и его рецептора в среде с уровнем экспрессии CD87 опухолевыми клетками. Исключение составляла линия клеток нейробластомы, высоко экспрессирующая рецептор uPA, но в среде которой наблюдалось низкое содержание соответствующих хемокинов. Однако было выявлено значительное содержание HGF и MCP-1, ранее признанных хемоаттрактантами стволовых клеток [14, 15].
Во второй части исследования авторы стремились подтвердить определяющую роль uPA и его рецептора в мобилизации стволовых клеток и клеток-предшественниц. С этой целью они трансфецировали клетки метастатической нейробластомы (низкий уровень экспрессии CD87) вирусными векторами, содержащими гены, ответственные за синтез uPA и его рецептора. Это привело к сверхэкспрессии хемокинов,
подтвержденной с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, и к трех- и двухкратному усилению миграции нейральных и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток соответственно.
Таким образом, была выявлена еще одна лиганд-рецеп-торная ось, ответственная за тропность стволовых клеток к опухолям - uPA/uPAR. Экспрессия CD87 также характерна для гранулоцитов, моноцитов, NK-клеток, ГСК которые вместе с клетками-предшественницами мигрируют в область локализации новообразований. С учетом сходной роли описанных в более ранних работах хемоаттрактантов (VEGF, SDF-1, SCF, HGF, MCP-1) можно заключить, что нет единого механизма, обусловливающего патотропизм к опухолям. По всей видимости, процесс контролируется множеством факторов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Ozaki Y., Nishimura M., Sekiya K. Comprehensive analysis of chemotactic factors for bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2007; 16[1]: 119-29.
2. Wright D.E., Wagers A.J., Gulati A.P. Physiological Migration of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Science 2001; 294[5548]: 1933-6.
3. Gutova M., Najbauer J., Frank R. uPA and uPAR Mediate Human Stem Cell Tropism to Malignant Solid Tumors. Stem Cells 2008; 26[6]: 1406-13
4. Fodde R. Stem Cells and Metastatic Cancer: Fatal Attraction? PLoS Med. 2006; 3[12]: 482.
5. Selleri C., Montuori N., Ricci P. et al. Involvement of the urokinase-type plasminogen activator receptor in hematopoietic stem cell mobilization. Blood 2005; 105[5]: 2198-205.
6. Nakamizo A., Marini F., Amano T. Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Gliomas. Cancer Res. 2005; 65[8]: 3307-18.
7. Moore X.L., Lu J., Sun L. et al. Endothelial progenitor cells «homing» specificity to brain tumors. Gene Ther. 2004; 11[10]: 811-8.
8. Goldman S. Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system. Nat. Biotechnol. 2005; 23[7]: 862-71.
9. Studeny M., Marini F.C., Dembinski J.L. Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents. Journal of the National Cancer Institute 2004; 96(21): 1593-603.
10. Aboody K.S., Najbauer J., Schmidt N.O. Targeting of melanoma brain metastases using engineered neural stem/progenitor cells. Neur. Oncol. 2006; 8(2): 119-26.
11. Imitola J., Raddassi K., Park K.I. et al. Directed migration of neural stem cells to sites of CNS injury by the stromal cell-derived factor 1alpha/CXC chemokine receptor 4 pathway. PNAS 2004; 101(52): 18117-22.
12. Schmidt N.O., Przylecki W., Yang W. et al. Brain tumor tropism of transplanted human neural stem cells is induced by vascular endothelial growth factor. Neoplasia 2005; 7(6): 623-9.
13. Alfano D., Franco P., Vocca I. et al. The urokinase plasminogen activator and its receptor: role in cell growth and apoptosis. Thromb. Haemost. 2005; 93(2): 205-11.
14. Palumbo R., Bianchi M.E. High mobility group box 1 protein, a cue for stem cell recruitment. Biochem. Pharmacol. 2004; 68(6): 1165-70.
15. Widera D., Holtkamp W., Entschladen F. et al. MCP-1 induces migration of adult neural stem cells. Eur. J. Cell Biol. 2004; 83(8): 381-7.
Подготовил И.Я. Бозо
По материалам: Gutova M., Najbauer J., Frank R. uPA and uPAR mediate human stem cell tropism to malignant solid tumors. Stem Cells 2008; 26(6): 1406-13
Изменения в классической модели гемопоэза -обнаружен миелоидный потенциал ранних предшественниц Т-клеток
Несмотря на то, что дифференцировка T-лимфоцитов считается хорошо изученной, относительно этого процесса в литературе остается немало противоречий. Т-лимфоциты дифференцируются в тимусе из ETP-клеток (от earliest thymic progenitors), которые также называют DNI-клетки (от double-negative cell), мигрирующих в тимус из красного костного мозга (ККМ). Дифференцировочный потенциал ETP-клеток до настоящего времени не был известен. Было показано, что ETP-клетки обладают способностью дифференцироваться в Т-лимфоциты и NK-клетки, а их отдельные субпопуляции также могут давать В-лимфоциты [1]. Однако окончательного ответа на вопрос, обладают ли ранние предшественницы Т-клеток миелоидным потенциалом, и в какой очередности утрачиваются способности ранних клеток-предшественниц дифференцироваться в различные типы клеток, до настоящего времени получено не было.
Развитие Т-клеток в тимусе - весьма сложный процесс, включающий в себя по крайней мере шесть этапов, которые характеризуются сменой спектра экспрессируемых клетками поверхностных маркеров [2]. ETP/DNI-клетки дифференцируются в DN2 и DN3-клетки, которые имеют еще более ограниченный дифференцировочный потенциал. Затем образуются CD4+/CD8+ клетки (double-positive cells), и они в свою очередь дают начало CD4+ либо CD8+ Т-лимфоцитам. Все эти стадии находятся в жесткой зависимости от микроокружения в тимусе [1]. На какой из них предшественники зрелых Т-лимфоцитов теряют способность дифференцироваться в другие типы иммунных клеток?
Известно, что при блокировании ключевого регулятора Т-клеток Notchl в ETP-клетках тимуса мышей возрастает процент дифференцирующихся из них В-лимфоцитов, но не миелоидных клеток. Было также показано, что ранние
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
