CC BY
57
УДК 579.61
УЛЬТРАЗВУКОВАЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ БИОПЛЕНОК ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ VIBRIO FISHERI К ВОЗДЕЙСТВИЮ ХЛОРАМФЕНИКОЛА
© 2011 г. В.И. Чистяков1, В.С. Лысенко2, М.А. Сазыкина1, И.С. Сазыкин1, Т.В. Вардуни1, М.И. Сазыкина1
Исследована кинетика люминесценции бактерий Vibrio fisheri, способных к образованию биопленок, контролируемого генами кворум-сенсинга (quorum sensing — QS) в условиях воздействия ультразвука (УЗ) и хлорамфеникола. Выявлено как ингибирующее, так и стимулирующее их влияние на люминесценцию и пленкообразование QS-бактерий V. fischeri, зависящее от мощности ультразвука и концентрации антибиотика. Полученные результаты могут быть применены при разработке методов ультразвуковой терапии инфекций, вызываемых пленкообразующими QS-бактериями.
1Институт биологии Южного федерального университета, пр. Стачки 194/1, г. Ростов-на-Дону, 344104, [email protected]
1Biological Scientific Research Institute of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090, [email protected]
2 Педагогический институт Южного федерального университета, ул. Садовая, 33, г. Ростов-на-Дону, 344042, [email protected]. ги
2■
'Pedagogical Institute of Southern Federal University, Sadovaya St., 33, Rostov-on-Don, 344082, [email protected]. ru
Ключевые слова: биопленки, люминесцирующие бактерии, кворум-сенсинг, ультразвук, хлорамфеникол, Vibrio fisheri.
The kinetics of luminescence Vibrio fisheri bacteria controlled by quorum sensing (QS) genes was studied in conditions of ultrasonic and chloramphenicol treatment. There were revealed both their inhibitory and stimulatory action on V. fisheri luminescence and biomembrane formation depending on ultrasound unit power and antibiotic concentration. The obtained results can be used for development of ultrasonic therapy methods applied for QS— dependent bacterial infection.
Keywords: biomembrane, luminescent bacteria, quorum sensing, ultrasound, chloramphenicol, Vibrio fisheri.
Результаты современных исследований патогенеза ряда инфекционных заболеваний показывают, что этиология многих из них определяется формированием бактериальных пленок - агрегатов бактерий, соединяющихся между собой при помощи вырабатываемого ими защитного адгезивного матрикса. Биопленка -защищенная ниша для бактерий и грибов, где они в безопасности от антибиотиков и антимикотиков могут создать источник рецидивирующей инфекции [1].
Сигналом для образования биопленки могут служить различные химические факторы, вырабатываемые специализированными сенсорными системами, реагирующими на условия внешней среды. Центральным звеном механизма, обеспечивающего кооперативное поведение бактерий в процессе образования биопленки, является кворум-сенсинг QS-фактор. QS-гены имеют многие патогенные микроорганизмы Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides, Yersinia, Burkholderia и Enterococcus spp., а также ряд клинически значимых возбудителей стафилококковых и стрептококковых инфекций. QS-системы контролируют формирование биопленок, кинетику роста бактериальных популяций, споруляцию, экспрессию генов устойчивости к антибиотикам и генов вирулентности, аутолиз, устойчивость к оксидативному стрессу, метаболитическую активность, подвижность, доминирование свободных (планктонных) или иммобилизованных в биопленках бактериальных форм [2-7].
QS-фактор впервые обнаружен Нельсоном, Платтом и Гастингсом [8] в исследованиях симбиоза между галофильной бактерией Vibrio fischeri и гавайским кальмаром Euprymna scolopes. Биолюминесценция V. fischeri «подсвечивает» участки внешней поверхности кальмара. Когда концентрация бактерий на них достигает порогового значения, V. fischeri продуцирует сигнальные QS-молекулы (N-ацил-гомосерин-лак-тон), активирующие транскрипцию бактериального люциферазного оперона, работа которого и приводит к излучению видимого света [9, 10]. В настоящее время V. fischeri широко используется как удобный модельный объект изучения бактериального пленкооб-разования в биомедицинских целях.
Значительный интерес могут представлять исследования биолюминесценции V. fischeri в условиях воздействия терапевтических факторов, направленных на разрушение бактериальных биопленок. К таким факторам относится, в частности, ультразвуковое воздействие низкой интенсивности (0,03^1 Вт/см3, 22^44 кГц), способное увеличивать чувствительность ряда патогенных пленкообразующих микроорганизмов к обработке антибиотиками [11-13]. В этой связи ценную информацию, характеризующую кинетику разрушения биопленки, может дать длительное наблюдение биолюминесценции QS-бактерий, в том
числе в период непосредственного воздействия ультразвука. Задачей настоящей работы является изучение кинетики интенсивности люминесценции V. fischeri в условиях обработки бактериальной биопленки хло-рамфениколом, ультразвуком, а также их одновременного воздействия.
Объект и методы
Объект. Использовали штамм бактерий V. fischeri NB 15, выделенный из акватории прибрежной зоны Черного моря. Правами на данный штамм обладает Южный федеральный университет. Штамм выращивали на жидкой среде Луриа-Бертани (LB) (пептон -10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, рН - 7.0) в присутствии 3%-го NaCl. В случае использования агаризован-ной среды LB в ее состав добавлялся микробиологический агар в количестве 20 г/л. Выращивание бактерий проводили при температуре 25 оС.
Обработка бактериальной культуры антибиотиками, ультразвуком и видеорегистрация люминесценции. Выращивали ночную культуру V. fischeri NB 15 на жидкой питательной среде LB с 3 % NaCl при температуре 25 °С. Готовили суспензию штамма с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток 1 млрд на 1 мл) и 4 последовательных 10-кратных разведений полученной суспензии в жидкой питательной среде LB с 3 % NaCl. В дальнейшей работе использовали 4-е разведение (105 КОЕ/мл).
К бактериальной суспензии объемом 2 мл добавляли хлорамфеникол до необходимой концентрации в 5 мкл этанола. В соответствующие контрольные образцы вводили 5 мкл чистого этанола. Полученные пробы бактериальной суспензии помещали в пробирки 20 мл, установленные наклонно в 12-гнездных кассетах, закрепленных перед видеокамерой с погружением в сосуд 500 мл, заполненный водой (ультразвуковая ванна), также установленный в поле зрения камеры. УЗ-генератор включали в установленное время на 60 мин или на постоянную работу, не прерывая видеорегистрацию.
Для исследований люминесценции бактерий применяли черно-белую CCD-видеокамеру VNC-748-H3 («ЭВС», Санкт-Петербург), имеющую чувствительность до 0,0004 лк на объекте и функции ручного управления. На камере устанавливали объектив Avenir (относительное отверстие - 1,2, фокусное расстояние - 6 мм).
Видеосъемку длительностью до 4 сут производили с частотой 1 кадр/с. Видеозахват осуществлялся программой VDub 1.8.1. C ее помощью ^avi-файл преобразовывали в последовательность изображений (серия файлов *.bmp). Последовательность открывали в про-
грамме ImageJ. На одном из кадров выделяли интересующие области изображения: поверхность жидкой среды с суспензией светящихся бактерий в отдельно взятых пробирках. Для каждого такого участка получали численный временной ряд - зависимость средней яркости от номера кадра инструментами Analyse ^ Tools ^ ROI manager ^ More ^ MultiMeasure, преобразуемый стандартными программными средствами Exel или Origin в кинетическую кривую.
Эксперименты выполнялись в 8-кратной повтор-ности. Относительная ошибка, рассчитанная для уровня значимости р=0,05, не превышала 7 %.
Результаты и обсуждение
Результаты видеорегистрации кинетики люминесценции проб V.fischeri NB15, подвергшихся 60-минутной обработке ультразвуком. Кинетические кривые люминесценции бактериальных культур в норме и подвергшихся 60-минутной обработке ультразвуком (0,080 Вт/см3) непосредственно в установке видеорегистрации представлены на рис. 1, 2. Исследованы суспензионная культура бактерий в жидкой среде, влажная бактериальная биопленка на поверхности стекла.
Проба в жидкой среде достигала максимума свечения быстрее, чем на поверхности стекла (рис. 1).
1800-, 1600« 1400 g 1200
я 1000 -^ .
8 800л
н ■
° 600-ск .
Ч
400200-
10
15
20
25
30
35
40
45 t, ч
Аналогичные результаты получены для проб, обработанных при меньшей интенсивности ультразвука -0,035 Вт/см3 (рис. 3). С целью ее снижения при той же мощности ультразвукового генератора использовали ванну большего объема (1 л).
1100-, 1000 -tj 900-
и
Е 800-
о
к 700-
¡5 .
jg 600-О _
§ 500-о .
400300200-
t УЗ I
Время, ч
Рис. 1. Кинетическая кривая люминесценции бактериальных культур V. fischeri N815 в норме. Проба 1 - суспензионная культура бактерий в жидкой среде, проба 2 - влажная бактериальная биопленка на поверхности стекла
Включение генератора ультразвука приводило к быстрому (1, 2 мин) снижению люминесценции в обеих пробах (рис. 2), однако проба в жидкой среде (1) снижала люминесценцию на 9 %, тогда как проба 2 -на 92. Для обеих проб за периодом быстрого спада люминесценции следовал период медленного ее роста с максимумом через 20 мин после включения ультразвука, причем проба 2 обнаруживала более выраженную стимуляцию. Преобладание стимулирующего эффекта над ингибирующим для пробы 2 связано, по-видимому, с меньшей интенсивностью воздействия на нее ультразвука, так как эта проба погружена в жидкость, тогда как проба 1 иммобилизована на поверхности стекла.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Время, мин
Рис. 2. Кинетическая кривая люминесценции бактериальных культур V. fischeri N815, подвергшихся 60-минутной обработке ультразвуком мощностью 0,080 Вт/см3. Проба 1 -суспензионная культура бактерий в жидкой среде (в фазе спада люминесценции), проба 2 - влажная бактериальная биопленка на поверхности стекла (фаза роста люминесценции). Туз, ¿уз - включение и выключение генератора ультразвука
Обработка ультразвуком меньшей мощности в проведенном эксперименте (по сравнению с предыдущим) показала практически полное отсутствие первоначального быстрого спада светимости и более мощный ее медленный рост с 20-минутным максимумом. В условиях эксперимента проба в жидкой среде и проба, иммобилизованная на поверхности стекла, обнаруживали сходную кинетику (рис. 3).
1800-, 1600-
3 1400-к ■ О 1200-
g 1000-^ .
§ 800л ■ g 600-W .
4 400200-
10
12
14
16
Время, ч
Рис. 3. Кинетическая кривая люминесценции бактериальных культур, V. fischeri N815, подвергшихся 60-минутной
обработке ультразвуком мощностью 0,035 Вт/см2 . Проба 1 - суспензионная культура бактерий в жидкой среде, проба 2 - влажная бактериальная биопленка на поверхности стекла. Туз, ¿уз - включение и выключение генератора ультразвука
Результаты непрерывной видеорегистрации кинетики люминесценции проб V. /ш^еп ЫВ15, подверг-
2
5
0
2
4
6
8
шихся комбинированному воздействию ультразвука и подпороговых доз антибиотика. Доза антибиотика, использованная в эксперименте, предварительно подбиралась как подпороговая по влиянию на кинетику люминесценции таким образом, чтобы его воздействие не влияло на уровень люминесценции ни на одном из этапов контрольного опыта без ультразвука.
Эксперимент (рис. 4) проводился при длительном включении ультразвука - с 18 ч от момента начала инкубации и до конца наблюдения - более 8 ч. Наблюдение начинали через 15 ч инкубации.
1800-,
1600-
£ 1400-
S 1200-
1000-
800-
600
t УЗ
14 16
20 22
Время, ч
24
26
28
люминесценцию и пленкообразование. Фактически происходит сенсибилизация бактерий к действию антибиотика.
В целом проведенные эксперименты показали, что ультразвук может оказывать как ингибирующее, так и стимулирующее влияние на люминесценцию и плен-кообразование QS-бактерий V. /^сИгп N315, зависящее от мощности ультразвука и концентрации антибиотика. Полученные результаты необходимо учитывать при разработке методов ультразвуковой терапии инфекций, вызываемых пленкообразующими QS-бактериями.
1300-, 1200ч 1100£ 1000-
0 .
g" 900-
я .
s 800-
аа .
£ 700-
1 600£ ■
500400300-
УЗ t 1
10
12
14
0
2
4
6
8
Рис. 4. Кинетика люминесценции бактерий V./искеп N815, подвергшихся комбинированному воздействию ультразвука (длительное воздействие) и подпороговых доз антибиотика.
1 - без антибиотика, 2 - 0,15 мкг/мл хлорамфеникола
После включения ультразвука рост свечения пробы без антибиотика на протяжении 30 мин существенно опережал пробу с антибиотиком. Дальнейшая кинетика люминесценции проб обнаруживала спад до фоновых значений без последующего восстановления. Таким образом, введение подпороговой дозы антибиотика в пробы позволяет снизить индуцируемую ультразвуком стимуляцию люминесценции.
На рис. 5 представлены результаты исследований влияния 60-минутной обработки ультразвуком на кинетику люминесценции 3 проб: влажной бактериальной пленки, иммобилизованнаой на поверхности стеклянной стенки пробирки и обработанной антибиотиком (1); бактериальной суспензии в жидкой питательной среде без антибиотика (2) и бактериальной суспензии в жидкой питательной среде с антибиотиком (3 Проба 1 наиболее быстро восстанавливалась после падения интенсивности люминесценции, вызванного ультразвуком, до исходного уровня. Пробы бактериальных суспензий в жидкой питательной среде проявляли медленное и неполное восстановление уровня свечения, причем это восстановление происходило быстрее в пробе с антибиотиком (3) в подпо-роговой концентрации.
Таким образом, подпороговые концентрации хло-рамфеникола, не способные в норме влиять на бактерии V. /искеп N315, в условиях воздействия ультразвука обнаруживают стимулирующий эффект на их
Время, ч
Рис. 5. Влияние 60-минутной обработки ультразвуком на кинетику люминесценции бактерий V. fischeri NB15, обработанных и необработанных подпороговыми дозами антибиотика (0,15 мкг/мл хлорамфеникол); 1 - влажная бактериальная биопленка на стекле, обработанная антибиотиком;
2 - проба в жидкой питательной среде без антибиотика;
3 - проба в жидкой питательной среде с антибиотиком).
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (гранты «Развитие научного потенциала высшей школы (20092010 годы)» № 2.1.1/5028; 5630).
Литература
1. Candida biofilm: a well-designed protected environment
/ P. Mukherjee [et al.] // Medical Mycology. 2005. Vol. 43. № 3. P. 191-208.
2. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // An-
nual Review of Microbiology. 2001. Vol. 55. P. 165-199.
3. Williams P. Quorum sensing, communication and cross-kingdom signaling in the bacterial world // Microbiology. 2007. Vol. 153. P. 3923-3928.
4. Kendall M.M., Sperandio V. Quorum sensing by enteric
pathogens // Current Opinion in Gastroenterology. 2007. Vol. 23. P. 10-15.
5. Yarwood J.M., Schlievert P.M. Quorum sensing in Staphy-
lococcus infections // The J. of Clinical Investigation. 2003. Vol. 112. P. 1620-1625.
6. Kong K.F., Vuong C., Otto M. Staphylococcus quorum sens-
ing in biofilm formation and infection // International J. of Medical Microbiology. 2006. Vol. 296. P. 133-139.
7. The application of biofilm science to the study and control
of chronic bacterial infections / W. Costerton [et al.] // The J. of Clinical Investigation. 2003. Vol. 112. Р. 1466-1477.
8. Nealson K.H., Platt T., Hastings J. W. Cellular control of the
synthesis and activity of the bacterial luminescence system // The J. of Bacteriology. 1970. Vol. 104. P. 313-322.
9. Fuqua C., Greenberg E.P. Listening in on bacteria: acyl-
homoserine lactone signaling // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. P. 685-695.
10. Parsek M.R., Greenberg E.P. Sociomicrobiology: the con-
nections between quorum sensing and biofilms // Trends in Microbiology. 2005. Vol. 13. P. 27-33.
Поступила в редакцию_
11. Ultrasound enhancement of antibiotic action on several spe-
cies of bacteria / A.M. Rediske [et al.] // The J. of General and Applied Microbiology. 1998. Vol. 44. P. 283-8.
12. Carmen J.C., Nelson J.L., Beckstead B.L. Ultrasonic-
enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeroginosa and Escherichia coli // The J. of Antimicrobial Chemotherapy. 2004. Vol. 10. P.193-199.
13. Ultrasonically enhanced vancomycin activity against Staphylococcus epidermidis biofilms in vivo / J.C. Carmen [et al.] // J. of Biomaterials Applications. 2004. Vol. 18. P. 237-245.
19 февраля 2010 г.
