CC BY
0
УДК 6l6.36-008.l:6l5.355]-092.4
DOI: l0.3l549/2542-ll74-2024-8-3-5l-6l
Ультраструктурная оценка гепатотоксических эффектов пегилированной гиалуронидазы в экспериментах in vitro
А.М. Швецова1, М.А. Королев1, А.А. Чурин2, Н.А. Бондаренко1, Н.П. Бгатова1, К.И. Ершов1, 3, П.Г. Мадонов1, 3, Ю.Р. Равилова3, С.В. Мишенина3
'Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии - филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия
2НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия
3ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Новосибирск, Россия
АННОТАЦИЯ
Введение . Препараты тестикулярной гиалуронидазы имеют широкое применение в медицинской практике. Модификация нативных биологически активных молекул путем электронно-лучевого пегилирования позволяет усовершенствовать их фармакокинетические свойства, что обусловливает последующее улучшение фармако-динамических эффектов. Создание оригинального перорального лекарственного средства с фармакологически активным ядром, в качестве которого выступает гиалуронидаза, представляется перспективным, однако требует изучения безопасности применения на доклиническом этапе.
Цель исследования . Ультраструктурная оценка гепатотоксических эффектов пегилированной гиалуронидазы in vitro.
Материалы и методы . Объект исследования - пегилированная на полиэтиленоксиде посредством электронно-лучевого синтеза тестикулярная гиалуронидаза (ПЭГ-ГИАЛ). Культуральная среда - перевиваемая культура клеток печени человека Chanq liver. Оценку цитотоксического действия проводили с помощью МТТ-теста. Ультраструктурные изменения оценивали методом электронной микроскопии.
Результаты . Разрабатываемое оригинальное лекарственное средство ПЭГ-ГИАЛ в изучаемых концентрациях 37, 75 и 150 ЕД/мл не оказывает цитотоксического воздействия на культуру клеток печени человека (гепа-тоциты). Жизнеспособность клеток находится практически на уровне контроля при воздействии ПЭГ-ГИАЛ в концентрациях 37 и 75 ЕД/мл, а под влиянием максимальной концентрации 150 ЕД/мл статистически значимо стимулируется пролиферация клеток, о чем свидетельствует повышение их жизнеспособности до 106 %. Результаты оценки ультраструктурных изменений гепатоцитов показали, что воздействие ПЭГ-ГИАЛ во всех концентрациях приводит к усилению обменных процессов в клетках, развитию аутофагии, которая является одним из основных гомеостатических процессов.
Заключение . Исследуемое лекарственное средство ПЭГ-ГИАЛ во всех изучаемых концентрациях не оказывает токсического воздействия на культуру гепатоцитов человека. Полученные результаты могут быть использованы при дальнейшем исследовании при разработке ПЭГ-ГИАЛ.
Ключевые слова: гиалуронидаза, пегилирование, цитотоксичность, культура клеток печени человека.
Образец цитирования: Швецова А.М., Королев М.А., Чурин А.А., Бондаренко Н.А., Богатова Н.П., Ершов К.И., Мадонов П.Г., Равилова Ю.Р., Мишенина С.В. Ультраструктурная оценка гепатотоксических эффектов пегилированной гиалуронидазы в экспериментах in vitro // Journal of Siberian Medical Sciences. 2024;8(з):51-61. DOI: 10.31549/2542-1174-2024-8-3-51-61
Поступила в редакцию 26.03.2024 Прошла рецензирование 13.05.2024 Принята к публикации 30.05.2024
Автор, ответственный за переписку
Швецова Александра Михайловна: НИИ клинической и экспериментальной лимфологии — филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН. 630060, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2. E-mail: [email protected]
Received 26.03.2024 Revised 13.05.2024 Accepted 30.05.2024
Corresponding author
Shvetsova Alexandra M.: Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology — Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 2, Timakova str., Novosibirsk, 630060, Russia. E-mail: [email protected]
Ultrastructural evaluation of hepatotoxic effects of PEGylated hyaluronidase in vitro
A.M. Shvetsova1, M.A. Korolev1, A.A. Churin2, N.A. Bondarenko1, N.P. Bgatova1, K.I. Ershov1' 3, P.G. Madonov1, 3, Yu.R. Ravilova3, S.V. Mishenina3
'Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology — Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia
2Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences, Tomsk, Russia
3Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia ABSTRACT
Introduction. Testicular hyaluronidase preparations are widely used in medical practice. Modification of native biologically active molecules by electron beam PEGylation allows to improve their pharmacokinetic properties, which determines a subsequent improvement of pharmacodynamic effects. The development of an original oral drug with a pharmacologically active core, which is hyaluronidase, is promising, but requires studying the safety of use at the pre-clinical stage.
A i m . Ultrastructural evaluation of hepatotoxic effects of PEGylated hyaluronidase in vitro.
Materials and methods. The object of a study was testicular hyaluronidase PEGylated on polyethylene oxide (PEG-HYAL) using electron beam synthesis. The culture medium is a continous culture of human liver cells Chanq liver. The cytotoxic effect was detected by the MTT assay. Ultrastructural changes were evaluated by electron microscopy.
Results. The original drug PEG-HYAL in the studied concentrations of 37, 75 and 150 U/ml has no cytotoxic effect on the human liver cell culture (hepatocytes). Cell viability is virtually at the control level when PEG-HYAL administration at concentrations of 37 and 75 U/ml, and in the maximum concentration of 150 U/ml, cell proliferation is stimulated significantly, as evidenced by an increase in cell viability up to 106%. The results of evaluation of ultrastructural changes in hepatocytes showed that exposure to PEG-HYAL in all concentrations leads to the enhancement of metabolic processes in cells, development of autophagy, which is one of the main homeostatic processes.
Conclusion. The drug PEG-HYAL in all studied concentrations has no toxic effect on the human hepatocyte culture. The results obtained can be used in further research in the development of PEG-HYAL. Keywords: hyaluronidase, PEGylation, cytotoxicity, human liver cell culture.
C itation example: Shvetsova A.M., Korolev M.A., Churin A.A., Bondarenko N.A., Bgatova N.P., Ershov K.I., Ma-donov P.G., Ravilova Yu.R., Mishenina S.V. Ultrastructural evaluation of hepatotoxic effects of PEGylated hyaluronidase in vitro. Journal of Siberian Medical Sciences. 2024;8(3):51-6i. DOI: 10.31549/2542-1174-2024-8-3-51-61
ВВЕДЕНИЕ
Гиалуронидаза является ферментом, который расщепляет гиалуроновую кислоту. При создании лекарственных препаратов энзимы проявляют ряд недостатков, среди которых низкая стабильность и биодоступность, повышенная способность вызывать различные аллергические реакции, в том числе со стороны иммунной системы. Обширные показания к применению препаратов на основе тестикулярной гиалу-ронидазы позволяют успешно использовать их в различных областях медицины на протяжении нескольких десятков лет. Однако многолетний опыт использования препаратов гиалуронидазы в качестве перспективного средства для лечения
INTRODUCTION
Hyaluronidase is an enzyme that breaks down hyaluronic acid. When developing drugs, enzymes show several disadvantages, including low stability and bioavailability, increased ability to cause various allergic reactions, in particilar from the immune system. A wide range of indications for the use of tes-ticular hyaluronidase preparations allows their successful use in various fields of medicine for several decades. However, many years of experience in using hyaluronidase preparations as a promising drug for the treatment of several diseases has a disadvantage - lack of their oral forms because of low bio-availability in this route of administration. By modifying the active substance on a polymeric carrier by
ряда заболеваний имеет и недостаток - отсутствие у них пероральных форм ввиду низкой биодоступности при данном способе приема. Путем модификации активного вещества на полимерном носителе посредством электроннолучевого воздействия можно получить конъю-гат с устраненными негативными свойствами [1, 2]. Создание оригинального перорального лекарственного средства с фармакологически активным ядром, в качестве которого выступает гиалуронидаза, иммобилизированная на поли-этиленгликоле с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, представляется нам весьма перспективным и требует изучения безопасности применения на доклиническом этапе [3].
Оценка токсичности лекарственных препаратов является неотъемлемой частью регистрационного досье, в частности цитотоксичность представляет собой отдельный этап при разработке нового лекарственного средства [4]. Анализ риска развития гепатотоксичности является важной составляющей доклинических исследований. Наиболее часто развитие нежелательных реакций со стороны органов желудочно-кишечного тракта при применении лекарств происходят именно в печени. Лекарственная гепатотоксичность выступает главенствующей из причин изъятия и отзыва препаратов [5]. В связи с тем, что печень - основной орган детоксикации и метаболических процессов, культуру клеток гепатоцитов можно использовать в качестве модели для токсикологических исследований лекарственных средств [6]. На доклиническом этапе исследования перспективным является проведение экспериментов именно на клеточных культурах. Клетки - первый уровень организации жизни, на котором можно провести оценку нарушений структуры внутриклеточных структурных компонентов, их взаимодействий, что в конечном итоге даст картину механизма повреждающего действия. Оценка цитотоксичности чаще всего используется в качестве скрининга для определения собственной токсичности вещества [7]. Эксперименты in vitro обладают рядом преимуществ наряду с простотой проведения, низкой стоимостью и большим запасом материала, что в последующем позволяет сократить численность экспериментов в ходе доклинических испытаниий in vivo. Кроме того, исследование цитотоксичности на лабораторных животных in vivo бывают нерелевантны ввиду видоспеци-фичных различий с человеком [8].
electron beam exposure, a conjugate with eliminated negative properties can be obtained [1, 2]. Developing an original oral drug with a pharmacologically active core, which is hyaluronidase immobilized on polyethylene glycol (PEG) using electron beam synthesis technology, seems to us very promising and requires studying the safety of use at the preclinical stage [3].
Evaluation of drug toxicity is an integral part of the registration dossier, in particular, cytotoxicity assessment represents a separate stage in the development of a new drug [4]. Analysis of the risk of hepatotoxicity is an important part of preclinical studies. The most frequent of gastrointestinal adverse drug reactions occurs in the liver. Drug hepatotoxicity is the main reason for withdrawal and recall of drugs [5]. Because the liver is the main organ orchestrating the detoxification and metabolic processes, hepatocyte cell culture can be used as a model for toxicological studies of drugs [6]. At the preclinical stage of research, it is promising to conduct experiments on cell cultures. Cells are the first level of life organization, at which it is possible to assess the disorders in the structure of intracellular components, their interactions, which will finally reveal the mechanism of damage. Cytotox-icity assessment is most often used as screening to determine the proper toxicity of a substance [7]. In vitro experiments have several advantages along with ease of conducting, low cost and large stock of material, which subsequently allows for a reduction in the number of experiments during in vivo preclinical experiments. In addition, in vivo cytotoxicity studies on laboratory animals are not relevant because of species-specific differences with humans [8].
AIM OF THE RESEARCH
To evaluate in vitro experiments on human cell culture (hepatocytes) the possible cytotoxic effect of PEGylated hyaluronidase as an original drug.
MATERIALS AND METHODS
Object of the research. Hyaluronate-endo-P-N-acetylhexosaminidase subjected to electron beam immobilization on a polymer carrier polyethylene oxide Macrogol-1500 (PEG-HYAL) by accelerated electron flow at a dose of 1.5 Mrad, which is created by a pulsed linear accelerator ILU-10 (Budker Institute of Nuclear Physics, Novosibirsk, Russia). PEG-HYAL was manufactured at the Siberian Center of Pharmacology and Biotechnology, JSC (Novosibirsk, Russia) and was kindly provided as part of scientific cooperation. PEG-HYAL was studied at concentrations of 37, 75 and 150 U/ml. These dosages, simulating the presence of PEG-HYAL in the
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценить в экспериментах in vitro на культуре гепатоцитов человека возможное цитотоксиче-ское действие пегилированной гиалуронидазы, рассматриваемой в качестве оригинального лекарственного средства.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Гиалуронат-эндо-в-N-ацетилгексозаминидаза, подвергнутая
электронно-лучевой иммобилизации на полимерном носителе полиэтиленоксиде Макро-гол-1500 (ПЭГ-ГИАЛ) потоком ускоренных электронов в дозе 1.5 Мрад, который создается импульсным линейным ускорителем ИЛУ-10 (Институт ядерной физики имени Г.И. Будкера СО РАН, Новосибирск, Россия). ПЭГ-ГИАЛ изготовлена в АО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии» (г. Новосибирск, Россия) и любезно предоставлена в рамках научного сотрудничества. ПЭГ-ГИАЛ изучали в концентрациях 37, 75 и 150 ЕД/мл. Данные дозировки, моделируюющие нахождение ПЭГ-ГИАЛ в системном кровотоке, были рассчитаны с учетом объема циркулирующей крови лабораторных мышей. Степень чистоты препаратов > 97% (измерялась на жидкостном хроматографе АсЙа Purifier 100, GE Healthcare).
Культура клеток. В эксперименте использовали перевиваемую культуру клеток печени человека Chanq liver (ФГБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Россия). Клетки печени Chanq liver культивировали в питательной среде RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, US Origin), 40 мкг/мл гентамицина сульфата (ОАО «Дальхимфарм», Россия) и 2 ммоль L-глутамина (ICN, США) в СО2-инкубаторе при 37 °С и 5% СО2 до образования конфлюэнтного монослоя.
Исследование цитотоксичности. Эксперименты по изучению и оценке цитотоксичности проводили с использованием двух методов:
МТТ-тест - данный метод позволяет определить жизнеспособность клеток. Основан на том, что живые и метаболически активные клетки с помощью митохондриальных дегидрогеназ преобразовывают желтую растворимую соль тет-разолия (з[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифе-нилтетразолия) и восстанавливают ее до фиолетовых нерастворимых кристаллов формазана. При лизисе клеток кристаллы формазана легко переходят в раствор органических растворите-
systemic circulation, were calculated taking into account the volume of circulating blood of laboratory mice. Pharmaceutical grade > 97% (measured using an Ackta Purifier 100 liquid chromatograph, GE Healthcare).
Cell culture. In the experiments, a continuous culture of human liver cells Chanq liver (State Scientific Center of Virology and Biotechnology "Vector", Russia) was used. Chanq liver cells were cultured in a RPMI-1640 medium (BioloT, LLC, Russia) with the addition of 10% fetal bovine serum (FBS) (HyClone, US Origin), 40 ^g/ml gentamicin sulfate (Dalkhim-pharm, JSC, Russia) and 2 mmol L-glutamine (ICN, USA) in a CO2 incubator at 37°C and 5% CO2 until a confluent monolayer is formed.
Cytotoxicity study. Experiments to study and evaluate cytotoxicity were carried out using two methods:
MTT assay - this method allows to determine the viability of cells. It is based on the fact that living and metabolically active cells, using mitochondrial dehy-drogenases, convert the yellow soluble tetrazolium salt (3[4,5-dimethyl-thiazole-2-yl]-2,5-diphenyltet-razolium) and reduce it to purple insoluble forma-zane crystals. During cell lysis, formazane crystals easily pass into a solution of organic solvents such as isopropanol or dimethyl sulfoxide. By measuring the absorbance of the formazane solution, the activity of mitochondrial dehydrogenases and, accordingly, cell viability are determined [9].
To determine the cytotoxicity of PEG-HYAL, cells were cultured in 96-well plates at the rate of 2xi04 cells per well. After 24 hours, the medium was removed, complete medium with 1% FBS and PEG-HYAL at concentrations of 37, 75 and 150 U/ml was added, and cells were cultured for 72 hours. After incubation of cells with drugs in a CO2 incubator at 37°C, the culture medium was removed from the wells, 100 |l of medium with MTT (3[4,5-dimethyl-thiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium, Sigma) was added at an initial concentration of 5 mg/ml and incubated for 4 hours. The absorption of dissolved formazane crystals was measured at a wavelength of 492 nm using a Stat Fax-2100 microplate reader (Awareness Technology Inc., USA) and expressed in units of absorbance (UA). Cell viability was calculated as the ratio of UA in the experiment x 100/UA in the control.
Statistical analysis was performed using STATIS-TICA 10.0 software (StatSoft Inc., USA). The data are presented as the mean value (M) and standard deviation (SD). Significance of differences between the groups was assessed according to the Mann-Whitney
лей, таких как изопропанол или диметилсуль-фоксид. По измерению оптической плотности раствора формазана проводят определение активности митохондриальных дегидрогеназ и, соответственно, жизнеспособности клеток [9].
Для определения цитотоксичности ПЭГ-ГИАЛ клетки высевали в 96-луночные планшеты в количестве 2xio4 клеток на лунку. Через 24 ч культивирования среду удаляли, добавляли полную среду с 1% содержанием ЭТС и ПЭГ-ГИАЛ в концентрациях 37, 75 и 150 ЕД/мл, далее культивировали клетки в течение 72 ч. После инкубации клеток с препаратами в СО2-инкубаторе при 37 °С культуральную среду убирали из лунок, добавляли по 100 мкл среды с МТТ (з[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолия, Sigma) в исходной концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Поглощение растворенных кристаллов формазана измеряли при длине волны 492 нм с использованием планшетного ридера Stat Fax-2100 (Awareness Technology Inc., США) и выражали в единицах оптической плотности (ЕОП). Жизнеспособность клеток рассчитывали как отношение ЕОП в опыте x 100/ЕОП в контроле.
Статистический анализ выполняли с использованием пакета программ STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., США). Данные представлены в виде среднего значения (M) и стандартного отклонения (SD). Достоверность различий между группами оценивали по критерию Манна - Уитни. Различия считались достоверными при p < 0.05.
Электронно-микроскопическое исследование: влияние ПЭГ-ГИАЛ на цитоархитектонику клеток оценивали визуально. Клетки фиксировали в 1% растворе OsO4 на фосфатном буфере (pH 7.4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон (Serva, Германия). Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм на ультратоме Leica UC7/FC7 (Германия/Швейцария), окрашивали толуидиновым синим, изучали под световым микроскопом LEICA DME и выбирали клетки для электронно-микроскопического исследования. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 70-100 нм, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали с помощью электронного микроскопа JEM-1400 (JEOL, Япония) Центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск, Россия).
test. The differences were considered significant at p < 0.05.
Electron microscopic examination. The effect of PEG-HYAL on the cytoarchitectonics of cells was assessed visually. The cells were fixed in a 1% solution of OsO4 using a phosphate buffer (pH 7.4), dehydrated in ethyl alcohol of increasing concentrations and enclosed in EPON (Serva, Germany). Semi-thin 1 |m sections were prepared from the obtained blocks on a Leica UC7/FC7 ultramicrotome (Germany/Switzerland), stained with toluidine blue, studied on a LEICA DME light microscope, and cells were selected for electron microscopic examination. Ultrathin 70-100 nm sections were obtained from the selected samples, contrasted with a saturated aqueous solution of uranyl acetate and lead citrate, and studied using a JEM-1400 electron microscope (JEOL, Japan) of the Center for Collective Microscopic Analysis of Biological Objects of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia).
RESULTS AND DISCUSSION
Cytotoxicity assessment using MTT assay.
The viability of liver cells with the addition of PEG-HYAL at concentrations of 75 and 37 U/ml was at the control level - 99 and 100%, respectively. At the same time, the viability of liver cells in the maximum concentration of PEG-HYAL 150 U/ml significantly stimulated cell proliferation, as evidenced by an increase in cell viability up to 106%. This fact indicates the absence of a dose-dependent effect, as well as the cytotoxic effect of PEG-HYAL on human hepa-tocytes (Fig. 1).
Electron microscopic examination. Incubation of human liver cells, hepatocytes, with PEG-HYAL for 72 hours had some effect on the ultrastructural organization of cells.
Electron microscopic examination of intact hepa-tocytes revealed a small content of microvilli on the cell surface. In the cytoplasm of cells, rounded nuclei with a predominance of euchromatin and a nucleo-lus of granular fibrillar structure were observed. Mitochondria were more often oval or rounded in shape and had well-defined crystae. Glycogen in the form of rosettes was evenly distributed throughout the cytoplasm or formed clusters in certain areas of hepatocytes. Cisterns of the granular endoplasmic reticulum, peroxisomes and lysosomes were well represented. Single autolysosomes and lipid inclusions were found (Fig. 2, A and 3, A).
Ultrastructural analysis of hepatocytes cultured with PEG-HYAL at a dose of 37 U/ml revealed an increase in the electron density of cell cytoplasm and
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка цитотоксичности с использованием МТТ-теста. Жизнеспособность клеток печени при добавлении ПЭГ-ГИАЛ в концентрациях 75 и 37 ЕД/мл находилась на уровне контроля - 99 и 100 % соответственно. При этом жизнеспособность клеток печени под влиянием максимальной концентрации ПЭГ-ГИАЛ 150 ЕД/ мл статистически значимо стимулировала пролиферацию клеток, о чем свидетельствует повышение жизнеспособности клеток до 106 %. Данный факт указывает на отсутствие дозозависи-мого эффекта, а также цитотоксического действия ПЭГ-ГИАЛ на гепатоциты человека (рис. 1).
Электронно-микроскопическое исследование. Инкубация клеток печени человека -гепатоцитов с ПЭГ-ГИАЛ в течение 72 ч оказала некоторое влияние на ультраструктурную организацию клеток.
При электронно-микроскопическом исследовании интактных гепатоцитов отмечали небольшое содержание микроворсинок на поверхности клеток. В цитоплазме клеток наблюдали ядра округлой формы с преобладанием эухроматина и наличием ядрышка гранулярно-фибриллярного строения. Митохондрии имели чаще овальную или округлую форму и хорошо выраженные кри-сты. Гликоген в виде розеток располагался равномерно по цитоплазме или образовывал скопления в отдельных участках гепатоцитов. Были хорошо представлены цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, пероксисомы и лизосомы. Встречались одиночные аутолизо-сомы и липидные включения и (рис. 2, А и 3, А).
При ультраструктурном анализе гепатоцитов, которые культивировали с ПЭГ-ГИАЛ в дозе
a significant increase in the size and number of microvilli on the surface of cells that were often in a budding state (Fig. 2, B). The size of the nucleoli was significantly increased. The cytoplasm of hepatocytes was abundant in organelles. Mitochondria had different shapes and sizes. An increase in the content of cristae and in the electron density of the matrix was noted (Fig. 3, B). A significant increase in the content of free polysomal complexes of ribosomes, autolyso-somes and vesicular structures was observed (Fig. 2, B).
When culturing hepatocytes with PEG-HYAL at a dose of 75 U/ml, an increased content and size of microvilli on the cell surface were noted (Fig. 2, C). The electron density of the cytoplasm of cells and mitochondria was similar compared to the control. Mitochondria were arranged in groups, and most of them had clearly defined membrane boundaries with poorly visualized crystae. Well-defined cisterns of the granular endoplasmic reticulum and an increased content of free polysomal ribosome complexes were found. A significant accumulation of autophagosomes and autolysosomes was observed (Fig. 3, C).
When PEG-HYAL was added at a dose of 150 U/ml, numerous and enlarged microvilli on the cell surface were noted. Heterochromatin discrete masses were often observed in the structure of the nuclei, located throughout the whole organelle volume. Heterogeneity in the structure of mitochondria was noted, which had different sizes, shapes, electron density and content of cristae. An increased content of the cisterns of the granular endoplasmic reticulum, well-defined vacuoles of the Golgi complex, presence of small vesicular structures, moderate content of autophagosomes, autolysosomes and
s к
<D №
CD 0х C »
И —
o tu Н о S I-
5 в и >
л н
££ О ГЦ О J^
о а с
о í>
<D
К
ГГ
S
140
120
100
80
60
40
20
Контроль / Control 150 ЕД/мл (U/ml) 75 ЕД/мл (U/ml) 37 ЕД/мл (U/ml)
Рис. 1. Жизнеспособность клеток печени под влиянием ПЭГ-ГИАЛ в различных концентрациях (* достоверность различий в сравнении с контролем p = 0.04) Fig. 1. Viability of liver cells in the use of PEG-HYAL in different concentrations (* significance of differences compared with the control p = 0.04)
*
0
А В
Рис. 2. Ультраструктура гепатоцитов при добавлении в культуральную среду ПЭГ-ГИАЛ в изучаемых дозах: А -контроль; В - ПЭГ-ГИАЛ в дозе 37 ЕД/мл; С - ПЭГ-ГИАЛ в дозе 75 ЕД/мл; D - ПЭГ-ГИАЛ в дозе 150 ЕД/мл Fig. 2. The ultrastructure of hepatocytes when PEG-HYAL is added to the culture medium in the studied doses: А -control; В - PEG-HYAL at a dose of 37 U/ml; С - PEG-HYAL at a dose of 75 U/ml; D - PEG-HYAL at a dose of 150 U/ml
37 ЕД/мл, было выявлено увеличение электронной плотности цитоплазмы клеток и значительное возрастание размеров и содержания микроворсинок на поверхности клеток, которые часто находились в состоянии почкования (рис. 2, В). Были значительно увеличены размеры ядрышек. Цитоплазма гепатоцитов была насыщена органеллами. Митохондрии имели различные формы и размеры. Отмечали рост содержания крист и увеличение электронной плотности матрикса (рис. 3, В). Наблюдали значительное возрастание содержания свободных полисомаль-ных комплексов рибосом, аутолизосом и везикулярных структур (рис. 2, В).
При культивировании гепатоцитов с ПЭГ-ГИАЛ в дозе 75 ЕД/мл отмечали повышенное содержание и увеличенные размеры микроворсинок на поверхности клеток (рис. 2, С). Электронная плотность цитоплазмы клеток и митохондрий была сходной с соответствующими
lysosomes, single lipid inclusions and a small content of glycogen granules were revealed (Fig. 2, D and 3, D).
The morphological examination data showed that the addition of PEG-HYAL to the culture medium in all studied doses led to an increase in the number and size of microvilli on the outer membrane of hepatocytes, in the content of protein synthesis structures of cells - free polysomal complexes of ribosomes or membranes of the granular endoplas-mic reticulum; change in the shape, size, electron density and number of mitochondrial crystae, and also the content of autophagic structures.
The structural changes observed in hepatocytes during cultivation with PEG-HYAL indicate that in all doses the drug does not have a toxic effect and contributes to the enhancement of metabolic processes and the development of autophagy in cells as one of the main homeostatic processes. Activation of autophagy helps to maintain an adaptive cellular
Рис. 3. Ультраструктура и цитоархтектоника гепатоцитов при воздействии ПЭГ-ГИАЛ в изучаемых дозах (MV - микроворсинки; Mit - митохондрии; Lis - аутолизосомы; Fag - аутофагосомы; Rib - рибосомы; GER - гранулярный эндоплазаматический ретикулум): А - контроль; В - ПЭГ-ГИАЛ в дозе 37 ЕД/мл; С - ПЭГ-ГИАЛ в дозе 75 ЕД/мл; D - ПЭГ-ГИАЛ в дозе 150 ЕД/мл Fig. 3. The ultrastructure and cytoarchtectonics of hepatocytes when PEG-HYAL is added in the studied doses (MV - microvilli; Mit - mitochondria; Lis - autolysosomes; Fag - autophagosomes; Rib - ribosomes;
GER - granular endoplasmic reticulum): А - control; В - PEG-HYAL at a dose of 37 U/ml; С - PEG-HYAL at a dose of 75 U/ml; D - PEG-HYAL at a dose of 150 U/ml
структурами в контроле. Митохондрии располагались группами, и большинство их имело четко очерченные границы мембран со слабо визуализируемыми кристами. Отмечали хорошо выраженные цистерны гранулярного эндоплазмати-ческого ретикулума и повышенное содержание свободных полисомальных комплексов рибосом. Наблюдали значительное накопление аутофаго-сом и аутолизосом (рис. 3, С).
При добавлении ПЭГ-ГИАЛ в дозе 150 ЕД/мл отмечали многочисленные и увеличенные в размере микроворсинки на поверхности клеток. В структуре ядер часто наблюдали глыбки гете-рохроматина, расположенные по всему объему органеллы. Отмечали гетерогенность в структуре митохондрий, которые имели различные размеры, форму, электронную плотность и содержа-
response in changes of the intracellular and extracellular environment, protects the cell from the formation of cytotoxic components, and is also one of the mechanisms for overcoming possible stress reactions [10].
CONCLUSION
As part of the experimental study, it was shown that PEG-HYAL does not have a cytotoxic effect on human hepatocytes. The studied concentrations of PEG-HYAL did not cause a cytodestructive effect. The data obtained can be used in the further development of PEG-HYAL as an original drug.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
ние крист. Выявляли повышенное содержание цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, хорошо выраженные вакуоли комплекса Гольджи, наличие мелких везикулярных структур, умеренное содержание аутофагосом, аутолизосом и лизосом, единичные липидные включения и небольшое содержание гранул гликогена (рис. 2, D и 3, D).
Полученные данные морфологического исследования показали, что добавление в культу-ральную среду ПЭГ-ГИАЛ во всех изучаемых дозах приводило к возрастанию содержания и размеров микроворсинок на наружной мембране гепатоцитов, увеличению содержания структур белкового синтеза клеток - свободных полисо-мальных комплексов рибосом или мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума, изменению формы, размеров, электронной плотности и содержания крист митохондрий, а также содержания аутофагических структур.
Наблюдаемые структурные изменения гепа-тоцитов при культивировании с ПЭГ-ГИАЛ свидетельствуют о том, что во всех изучаемых дозах средство не оказывает токсического дей-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Фармакологические свойства пегилированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011;з(5):14б-150.
2. Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Гепа-топротекторные эффекты иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы и механизмы их развития // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011;151(1):86-90.
3. Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И. и др. Средство, увеличивающее резерв стволовых клеток в организме: Патент РФ № 2405822; опубл. 10.12.2010.
4. Данченко Е.О. Оценка цитотоксичности фармацевтических субстанций с использованием клеточных культур // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012;2:22-31.
5. Onakpoya I.J., Heneghan C.J., Aronson J.K. Postmarketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature // BMC Med. 2016;14:10. DOI: 10.1186/s12916-016-0553-2.
6. Бгатова Н.П., Досымбекова Р.С., Таскаева Ю.С. и др. Аутофагия как маркер жизнеобеспечения изолированных гепатоцитов // Морфология. 2021;159(1):5-12. DOI: 10.17816/1026-3543-2021-159-1-5-12.
7. Мазеркина И.А. Оценка лекарственной гепа-тотоксичности in vitro на клеточных моделях (обзор) // Безопасность и риск фармакотерапии.
ствия и способствует усилению обменных процессов и развитию аутофагии в клетках как одного из основных гомеостатических процессов. Активация аутофагии способствует поддержанию адаптивного клеточного ответа в условиях изменения внутри- и внеклеточной среды, защите клетки от образования цитоток-сических компонентов, а также является одним из механизмов преодоления возможных стрессовых реакций [10].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В рамках проведенного экспериментального исследования показано, что ПЭГ-ГИАЛ не оказывает цитотоксического воздействия на гепато-циты человека. Исследуемые концентрации ПЭГ-ГИАЛ не вызывали цитодеструктивного эффекта. Полученные данные можно использовать при дальнейшей разработке ПЭГ-ГИАЛ как оригинального лекарственного средства.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
REFERENCES
1. Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V. et al. Pharmacological properties of granulocytic colony-stimulating factor pegylated using electron beam synthesis nano-technologies. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011;152:133-137. DOI: 10.1007^10517-011-1472-z.
2. Dygai A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V. et al. Mechanism for hepatoprotective effects of hyaluronidase immobilized by the nanotechnology method of electron beam synthesis. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011;151(1):74-78. DOI: 10.1007^10517-011-1263-6.
3. Artamonov A.V., Bekarev A.A., Vereshchagin E.I. et al.. A product that increases the reserve of stem cells in the body. RF Patent No. 2405822. Published: 10.12.2010. (In Russ.)
4. Danchenko E.O. Evaluation of cytotoxicity of pharmaceutical substances with cell cultures. Immunopathol-ogy, allergology, infectology. 2012;2:22-31. (In Russ.)
5. Onakpoya I.J., Heneghan C.J., Aronson J.K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Med. 2016;14:10. DOI: 10.1186/ s12916-016-0553-2.
6. Bgatova N.P., Dosymbekova R.S., Taskaeva Y.S. et al. Autophagy as a life support marker of isolated hepatocytes. Morphology. 2021;159(1):5-12. DOI: 10.17816/1026-3543-2021-159-1-5-12. (In Russ.)
7. Mazerkina I.A. In vitro assessment of drug-induced liver injury using cell-based models: a review. Safety and Risk of Pharmacotherapy. 2023;11(2):131-144. DOI: 10.30895/2312-7821- 2023-11-2-351. (In Russ.)
2023;11(2):131-144. DOI: 10.30895/2312-7821- 202311-2-351.
8. Довнар А.Г., Свирчевская Е.Ю., Ржеусский С.Э., Самойлович Е.О. Оценка цитотоксичности субстанции повиаргол in vitro // Медицинские новости. 2016;9:62-64.
9. Методы исследования цитотоксичности при скрининге лекарственных препаратов: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по курсу «Методы скрининга физиологически активных веществ» / А.Г. Иксанова, О.В. Бондарь, К.В. Балакин. Казань: Казанский университет, 2016. 40 с.
10. Пупышев А.Б. Репаративная аутофагия и аутофаго-вая гибель клетки. Функциональные и регулятор-ные аспекты // Цитология. 2014;56(3):179-196.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Швецова Александра Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной и клинической фармакологии Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия. ORCID: 0009-0002-7735-6032.
Королев Максим Александрович — д-р мед. наук, руководитель Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия. ORCID: 0000-0002-0471-652X.
Чурин Алексей Александрович — д-р мед. наук, главный научный сотрудник, заведующий отделом лекарственной токсикологии НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия. ORCID: 00000002-6088-7286.
Бондаренко Наталья Анатольевна - канд. биол. наук, заведующий лабораторией экспериментальной и клинической фармакологии Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия. ORCID: 0000-0002-8443-656Х.
Бгатова Наталия Петровна - д-р биол. наук, профессор, заведующий лабораторией ультраструктурных исследований Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия. ORCID: 0000-0002-4507-093Х
Ершов Константин Игоревич — канд. биол. наук, доцент кафедры фармакологии, клинической фар-
8. Dounar H.G., Svircheuskaya E.Y., Rzheussky S.E., Samailovich E.O. Cytotoxicity assessment of poviargol substance in vitro. Meditsinskie novosti. 2016;9:62-64. (In Russ.)
9. Iksanova A.G., Bondar O.V., Balakin K.V. (2016). Methods of Cytotoxicity Research in Drug Screening: a teaching guide to practical classes for the course "Methods of screening physiologically active substances". Kazan: Kazan University. 40 p. (In Russ.)
10. Pupyshev A.B. Reparative autophagy and autophagy death of cells. Functional and regulatory aspects. Tsi-tologiya. 2014;56(3):179-196. (In Russ.)
ABOUT THE AUTHORS
Alexandra M. Shvetsova - Junior Researcher, Laboratory of Experimental and Clinical Pharmacology, Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0009-00027735-6032.
Maxim A. Korolev - Dr. Sci. (Med.), Head, Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology -Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-0471-652X.
Alexey A. Churin - Dr. Sci. (Med.), Chief Researcher, Head, Department of Drug Toxicology, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences, Tomsk, Russia. ORCID: 0000-0002-6088-7286.
Natalia A. Bondarenko - Cand. Sci. (Bio.), Head, Laboratory of Experimental and Clinical Pharmacology, Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-8443-656X
Natalia P. Bgatova - Dr. Sci. (Bio.), Professor, Head, Laboratory of Ultrastructural Studies, Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology -Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-4507-09зХ.
Konstantin I. Ershov - Cand. Sci. (Bio.), Associate Professor, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University; Senior Researcher, Laboratory of Pharmaceutical Technology, Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0003-41399-036x.
Pavel G. Madonov - Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Head, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University; Head, Department of Experimental Pharmacology, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-1093-8938.
макологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; старший научный сотрудник лаборатории фармацевтических технологий Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии -филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-0003-41399-036Х.
Мадонов Павел Геннадьевич - д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; руководитель отдела экспериментальной фармакологии Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии - филиала ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-00021093-8938.
Равилова Юлия Равильевна — канд. мед наук, доцент кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-0002-4611-165Х.
Мишенина Светлана Владимировна — д-р мед. наук, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Новосибирск, Россия. ОИСГО: 0000-0001-83777648.
Yulia R. Ravilova - Cand. Sci. (Med.), Associate Professor, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia. ORCID: 0000-0002-4611-165X.
Svetlana V. Mishenina - Dr. Sci. (Med.), Professor, Department of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Evidence-Based Medicine, Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia. ORCID: 00000001-8377-7648.
