CC BY
19УДК 611.41+611.068
УЛЬТРАСТРУКТУРА СЕЛЕЗЕНКИ КРЫС РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТОВ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ КСЕНОГЕННОЙ СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ
Макалиш Т. П.1, Шаланин В. В.2
1 ЦНИЛ
2 Кафедра патологической анатомии с секционным курсом Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, г. Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Макалиш Татьяна Павловна, младший научный сотрудник ЦНИЛ, аспирант кафедры нормальной анатомии Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», e-mail: [email protected]
For correspondence: Tatyana P. Makalish, junior researcher, post-graduate student of the Human Anatomy Department of Medical Academy named after S. I. Georgievcky of Vernadsky CFU, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Makalish T. P., http://orcid.org/0000-0003-1884-2620 Shalanin V. V., http://orcid.org/0000-0001-5380-2048
РЕЗЮМЕ
В статье описана ультраструктура селезенки крыс в норме и изменения в строении клеток, возникшие вследствие введения животным ксеногенной спинномозговой жидкости. Эксперимент проведен на 72 крысах линии Вистар обоих полов. Ликвор (или 0,9% раствор NaCl в группе контроля) вводили внутримышечно в дозе 2 мл/кг живого веса каждые третьи сутки 3 и 10 раз. У животных молодого и зрелого возрастов структура клеток селезенки после введения ликвора не имеет признаков патологических изменений независимо от схемы введения и отражает нормальную реакцию организма на антиген. Заметны признаки макрофагальной активности, бласттрансформации лимфоцитов. На поздних сроках эксперимента часто встречаются плазматические клетки с признаками активного синтеза белка. У крыс предстарческого возраста после трехкратного введения спинномозговой жидкости структура клеток не имеет каких-либо признаков возрастной инволюции, тогда как после десятикратного введения вещества наблюдаются признаки деструкции лимфоцитов, большое количество клеточного детрита и активных макрофагов.
Ключевые слова: селезенка; спинномозговая жидкость; ультраструктура.
AGE-RELATED ULTRASTRUCTURE OF RAT SPLEEN AFTER INTRODUCTION OF XENOGENIC CEREBROSPINAL FLUID
Makalish T. P.1, Shalanin V. V.2
1Central research laboratory
2Department of Pathological Anatomy with the Course of Dissection of Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
The article describes ultrastructure of the rat spleen in norm and changes in the spleen cells after xenogeneic cerebrospinal fluid administration. The experiment was performed on 72 Wistar rats, male and female. The saline or liquor was injected 3 or 10 times each 3 days with a doze of 2 ml/kg. No signs of pathological changes in the spleen cells after liquor injection in adolescent and adult animals were observed. There were signs of macrophage's activity and lymphocyte's blast transformations that are the characteristic features of antigen response. At late terms of the experiment, plasma cells at the stage of active protein synthesis were often observed. There were no signs of age involution in the spleen cells after three-time injection of cerebrospinal fluid into aging rats, whereas after ten-time injection, the signs of lymphocyte destruction, a large number of cellular detritus and active macrophages were observed.
Key words: spleen; cerebrospinal fluid; ultrastructure.
Растущее антропогенное загрязнение окружающей среды, в том числе и биологическими агентами, требует поиска новых иммуно-тропных препаратов для защиты организма от вредного воздействия экзогенных факторов на здоровье населения. Одним из перспективных направлений является использование спинномозговой жидкости (СМЖ) лактирующих коров в качестве субстрата для изготовления препарата, обладающего иммуностимулиру-
ющими свойствами благодаря высокому содержанию в ней факторов роста, гормонов и других биологически активных веществ [1-3]. Не имея конкретного органа-мишени, эти вещества оказывают влияние на функционально активные клетки различных тканей. Общими являются реакции усиления пролиферации клеток, увеличения количества капилляров в тканях и т. п. [4]. Селезенка, будучи крупнейшим вторичным органом иммуногенеза, од-
ной из первых реагирует на поступление антигенов в организм [5]. Изучение изменений ее структуры в ответ на парентеральное введение ликвора представляет теоретический и практический интерес. Целью нашей работы было изучить на субклеточном уровне особенности строения селезенки крыс после парентерального введения ксеногенной СМЖ (КСМЖ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент проведен на 72 крысах линии Вистар обоих полов трех возрастных групп: неполовозрелые (молодые, возраст 30-60 дней), половозрелые (возраст 5-6 мес.), периода предстарческих изменений (19-20 мес.). Всех животных одного возраста разделили на контрольных и экспериментальных. Контрольным крысам вводили 0,9% раствор №С1, а экспериментальным - КСМЖ, полученную от лактиру-ющих коров породы Красная степная по методу В. В. Ткача [6] в дозировке 2 мл/кг живого веса. Инъекции делали каждые третьи сутки 3-х и 10-ти кратно (острый и хронический эксперимент). Через сутки после последней инъекции животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Для анализа субклеточных изменений с помощью электронной микроскопии получали фрагмент селезенки размером 1 мм3, фиксировали в 2,5 % растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере с рН 7,2-7,4, заключали в смесь эпоксидных смол в капсулы. Готовили ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома иЬТКЛСиТ с последующим контрастированием уранилацетатом и цитратом свинца. Просмотр и фотографирование срезов производили на электронном микроскопе ПЕМ-106.
Соблюдение основных биоэтических норм при проведении исследования подтверждены заключением комитета по этике ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского» (выписка из протокола № 14 от 03.10.2017).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клеточный состав селезенки крыс был представлен различными видами лейкоцитов, а также эритроцитами, тромбоцитами.
Белая пульпа сформирована преимущественно из лимфоцитов на различных стадиях созревания. Малые лимфоциты - зрелые клетки с крупным ядром округлой или овальной формы (может сильно искажаться в зависимости от плотности клеток) с гетерохроматином, прилегающим к кариолемме, одним или двумя ядрышками, немногочисленными и неглубокими инвагинациями. Цитоплазма узким ободком окружает ядро и содержит небольшое количе-
ство органелл, преимущественно рибосом и митохондрий. Аппарат Гольджи и эндоплаз-матический ретикулум (ЭПР) развиты слабо.
Встречаются средние и крупные лимфоциты (преимущественно в герминативных центрах), у которых ободок цитоплазмы вокруг ядра шире и содержит значительно большее количество органелл. Ядро крупное, четко очерченное, содержит преимущественно эухроматин.
В маргинальной зоне лимфоидных узелков, а также в красной пульпе селезенки, хорошо различимы плазматические клетки на разных стадиях созревания и функциональной активности. Небольшое округлое ядро таких клеток оттеснено к краю развитым аппаратом Голь-джи, образующим светлый дворик перед ядром. Глыбки гетерохроматина располагаются по периферии ядра. Цитоплазма богата органеллами, в первую очередь хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть, присутствуют свободные рибосомы, митохондрии. В зависимости от стадии созревания клетки цистерны ЭПР имеют различные размеры: у молодых плазмоцитов они значительно расширены, у зрелых - более компактны, но заполнены белковым содержимым.
В этих же зонах часто встречаются макрофаги, отличающиеся крупными размерами, светлым ядром неправильной формы и многочисленными выростами клеточной оболочки. Их цитоплазма содержит митохондрии, рибосомы, умеренно выраженный аппарат Гольджи, а также большое количество вакуолей небольших размеров. Многие из них являются фагосомами и содержат электрон-ноплотное вещество апоптотических телец.
Красная пульпа также богата эритроцитами. Нередко рядом с ними располагаются сидерофаги, имеющие в своей цитоплазме фагосомы, заполненные гемосидерином. Также в красной пульпе встречаются тромбоциты, мигрировавшие сюда лимфоциты, эозинофилы, нейтрофилы и ретикулярные клетки, формирующие строму органа.
На ультраструкутрном уровне клетки селезенки крыс подопытной группы не имеют каких-либо патологических изменений, однако выявлен ряд особенностей.
У крыс неполовозрелого возраста наблюдаются признаки макрофагальной активности, а также активации бласттрансформации лимфоцитов (рис. 1). Об этом говорит большое количество плазматических клеток, лимфобластов с признаками повышенной активности. Макрофаги имеют большое количество макро- и микровыростов цитолеммы, ядро содержит хроматин, представленный преимущественно
эу-формой. В его цитоплазме небольшое количество фагосом и пиноцитозных пузырьков.
После десятикратного введения КСМЖ в маргинальной зоне лимфоидных узелков наблюдается большое скопление лимфоцитов и лимфобластов с большим количеством гранул в цитоплазме, а также небольшое количество умеренно-активных макрофагов с различной величиной фагосом (рис. 2). Подобное увеличение плотности клеток может быть связано с активной миграцией лимфоцитов из центральных органов иммунитета вследствие продолжительного действия ликвора.
Рис. 1. Электронограмма селезенки крысы неполовозрелого возраста после трехкратного введения ликвора. Л - лимфоциты, лб - лимфобласт, м - макрофаг, п - плазмоцит, э - эритроцит. Ув. х2400.
Трехкратное введение ликвора половозрелым крысам привело к гиперплазии белой пульпы за счет увеличения количества и размеров лимфоидных узелков. Увеличилось и количество вторичных узелков с герминативными центрами. Подтверждением тому является большое количество лимфобластов. Встречаются также и плазматические клетки в стадии умеренного синтеза антител. В их цитоплазме хорошо различимы расширенные цистерны гранулярного ЭПР и характерный «светлый дворик» перед ядром. Макрофаги содержат умеренное количество фагосом (рис. 3).
Десятикратное введение ликвора половозрелым крысам не повлекло за собой патологических изменений в ультраструктуре иммунокомпетентых клеток. В белой пульпе селезенки наблюдается большое количество малых лимфоцитов, узкий ободок цитоплаз-
Рис. 2. Маргинальная зона ЛУ селезенки юве-нильной крысы, получавшей ликвор десятикратно. Л - лимфоцит, лб - лимфобласт, м - макрофаг,
р - ретикулоцит. Ядро ретикулярной клетки с неровным контуром за счет образования втяже-ний и выпячиваний, хроматин конденсирован по ядерной мембране, видно ядрышко. В цитоплазме большое скопление пиноцитозных пузырьков. Ув. 2400.
Рис. 3. Электронограмма селезенки половозрелых крыс, получавших ликвор трехкратно.
Л - лимфоциты, лб - лимфобласт, м - макрофаг, п - плазмоцит. Ув. 2400.
мы которых содержит некоторое количество гранул и митохондрий. Значительная часть гетерохроматина сконцентрирована по периферии ядра, мембрана которого имеет небольшие выступы и инвагинации (рис. 4.).
В возрасте предстарческих изменений структура селезенки приобретает признаки возрастной инволюции. Однако после трехкратного введения ликвора в ультраструктуре клеток та-
Рис. 4. Маргинальная зона ЛУ половозрелой крысы после десятикратного введения ликвора. мЛ - малый лимфоцит. Ув. 6400.
ких признаков не обнаружено. В белой пульпе присутствует большое количество лимфоцитов как светлых, так и темных, с ядрами правильной формы. В центральной зоне ядра виден эухроматин, а по периферии - гетерохроматин. В цитоплазме большое количество гранул (рибосом, полисом) (рис. 5). Ретикулярные клетки также содержат большое количество органелл, в цитоплазме видны вакуоли. Встречаются плазматические клетки с признаками умеренной синтетической активности, лимфобласты.
Рис. 5. Маргинальная зона ЛУ селезенки крысы предстарческого возраста, получавшей ликвор трехкратно. Р - ретикулоцит, стрелками указаны лимфоциты. Ув. 4000.
Десятикратное введение КСМЖ животным предстарческого возраста негативно отразилось на состоянии спленоцитов. Встречаются плазматические клетки с резко расширенными
цистернами ЭПР, большое количество клеточного детрита и как следствие повышенная активность макрофагов, содержащих большое количество фагосом (рис. 6.). Лимфоциты проявляют признаки деструкции (лапчатое ядро, вакуолизация цитоплазмы). Все это говорит о срыве адаптационных процессов в селезенке крыс предстарческого возраста. Аналогичные изменения ультраструктуры селезенки крыс, получавших иммунотропные препараты, были получены ранее и другими исследователями [7].
Б
Рис. 6. Маргинальная зона ЛУ крыс предстарческого возраста после десятикратного введения ликвора. М - макрофаг, П - плазмоцит, стрелками указаны лимфоциты с признаками деструкции. Ув. 3200.
Введение СМЖ «в обход» гематоэнцефаличе-ского барьера приводит к естественной реакции иммунитета реципиента на антиген. Выявленные изменения ультраструктуры лейкоцитов селезенки крыс молодого и половозрелого возрастов после введения КСМЖ подтверждают это на субклеточном уровне. Согласно литературным данным [8, 9], введение иммунотропных препаратов приводит к аналогичной картине ультраструктуры селезенки крыс, а именно умеренной макрофагальной и лимфоцитарной активности, увеличению количества плазматических клеток и усилению синтеза ими белка. Аналогичной оказалась адаптационная реакция спленоцитов крыс предстарческого возраста на трехкратное введение ликвора. Это повлекло за собой временное замедление инволютивных процессов в селезенке, характерных для данной возрастной группы. Десятикратное же введение СМЖ животным пред-старческого возраста приводит к срыву адаптационных процессов вследствие возрастной инволюции как центральных, так и периферических органов иммуногенеза.10 сравнение с литературой
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, можно заключить, что введение ликвора молодым и половозрелым животным не вызывают патологических изменений селезенки на ультраструктурном уровне, а признаки повышенной активности макрофагов и бласттрансформации умеренно выражены и объясняются нормальной реакцией организма на введение чужеродного вещества. Трехкратное введение цереброспинальной жидкости крысам предстарческого возраста приводит к замедлению возрастной инволюции селезенки. В то же время многократное введение СМЖ усиливает деструктивные изменения клеток селезёнки в этой группе, что связано с перенапряжением адаптационных процессов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors have no conflict of interest to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Souza-Moreira L., Campos-Salinas J., Caro M. [at al.]. Neuropeptides as pleiotropic modulators of the immune response. Neuroendocrinology. 2011;94 (2):89-100.
2. Richards S. M. Use of human prolactin as a therapeutic protein to potentiate immunohematopoietic function. J Neuroimmunol.2000;109:56-62.
3. Gaillard R. C. Cytokines in the neuroendocrine system. Int Rev Immunol.1998;17:181-216.
4. Ликвор как гуморальная среда организма.Сим-ферополь: ИТ «АРИАЛ», 2010:192.
5. Cesta M. F. Normal Structure, Function, and Histology of the Spleen. Toxicologic Pathology.2006;34:455-465.
6. Декларацшний патент на винахщ «Споаб одер-жання цтьного лкворного препарату» Ткач В. В., Ада-мень Ф. Ф., Лисенко В. В., Макаров О. I., Сушко А. I., Ткач В. В. (мл). Заявл. № 2003087810, от 02. 09. 2003.
7. Бобрышева И. В. Ультрамикроскопическое исследование селезенки крыс разных периодов пост-натального онтогенеза после введения иммунофана. Журнал Гродненского государственного медицинского университета.2013;4:56-60.
8. Нужная Е. К., Стаценко Е. А., Cкрябина Е. Н., Санькова Л. Ю., Солодкая Е. С. Ультраструктура селезенки половозрелых крыс при введении бисфосфоната «зомета» и иммуностимулятора тимогена. Украшський медичний альманах. 2011;14, № 4:107-109.
9. Золотаревская М. В. Особенности ультраструктуры селезенки после введения иммунотропных препаратов в эксперименте. КлУчна анатомiя та оперативна хiрургiя. 2011;10, №4:23-28.
10. Кузнецова Е. П., Линькова Н. С., Дудков А. В., Войцеховская М. А. Селезенка: онтогенез и старение. Геронтология. 2013; № 2:2-16.
REFERENCES
1. Souza-Moreira L., Campos-Salinas J., Caro M. [at al.]. Neuropeptides as pleiotropic modulators of the immune response. Neuroendocrinology. 2011;94 (2):89 - 100.
2. Richards S. M. Use of human prolactin as a therapeutic protein to potentiate immunohematopoietic function. J Neuroimmunol.2000;109:56 - 62.
3. Gaillard R. C. Cytokines in the neuroendocrine system. Int Rev Immunol.1998;17:181 - 216.
4. Likvor kak gumoral'naya sreda organizma. Simferopol': IT «ARIAL», 2010:192.
5. Cesta M. F. Normal Structure, Function, and Histology of the Spleen. Toxicologic Pathology.2006;34:455-465.
6. Deklaratsiinii patent na vinakhid „Sposib oderzhannya tsil'nogo likvornogo preparatu" Tkach V.V., Adamen' F.F., Lisenko V.V., Makarov O.I, Sushko A.I., Tkach V.V. (ml). Zayavl. № 2003087810, ot 02. 09. 2003.
7. Bobrysheva I. V. Ul'tramikroskopicheskoe issledovanie selezenki krys raznykh periodov postnatal'nogo ontogeneza posle vvedeniya immunofana. Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta.2013;4:56-60.
8. Nuzhnaya E.K., Statsenko E.A., Ckryabina E.N., San'kova L.Yu., Solodkaya E.S. Ul'trastruktura selezenki polovozrelykh krys pri vvedenii bisfosfonata «zometa» i immunostimulyatora timogena. Ukrains'kii medichnii al'manakh. 2011;14, № 4:107-109.
9. Zolotarevskaya M. V. Osobennosti ul'trastruktury selezenki posle vvedeniya immunotropnykh preparatov v eksperimente. Klinichna anatomiya ta operativna khirurgiya. 2011;10, №4:23-28.
10. Kuznetsova E. P., Lin'kova N. S., Dudkov A. V., Voitsekhovskaya M. A. Selezenka: ontogenez i starenie. Gerontologiya. 2013; № 2:2-16.
