CC BY
13
Биомедицина • № 2, 2016, С. 45-53
Биоматериал Аллоплант при регенерации миометрия рога матки экспериментальных животных - стимулятор макрофагов мезенхимного происхождения
А.И. Лебедева
ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава России, Уфа Контактная информация: к.б.н. ЛебедеваАннаИвановна, [email protected]
В дефект миометрия рога матки крысы был имплантирован биоматериал Аллоплант (БМА). В результате формировался полноценный структурный регенерат, состоящий из кластеров лейомиоци-тов и прослоек волокнистой соединительной ткани. Регенерация происходила с привлечением макрофагов М1 мезенхимного происхождения, содержащих гликозаминогликаны. В контрольной группе в зоне дефекта без применения БМА выявлялся дефицит макрофагов, происходило формирование грубого рубца. Морфологическое исследование проводили с применением гистологических (окраска гематоксилином и эозином, по Ван Гизону), гистохимических (окраска по Хейлу) и иммуногистохи-мических (угтепйп, СБ68,1Ы, РОР1, ТОРр1) методов.
Ключевые слова: биоматериал Аллоплант, макрофаги, миометрий рога матки, регенерация.
Введение
В ранее опубликованных статьях были освещены аспекты регенерации миометрия рога матки самок кроликов, индуцированных биоматериалом Аллоплант (БМА) [5, 4]. Выявлено, что после имплантации БМА происходила резорбция частиц биоматериала и замещение их рыхлой соединительной тканью с высокой степенью васкуляриза-ции. Происходила пролиферация малых гладкомышечных клеток - лейомиоци-тов. В миометрии экспериментальной группы доля паренхимы доминировала над стромальным компонентом. В контрольной группе животных без применения биоматериала на фоне дефицита макрофагов наблюдалась активация фибробластических клеток, накопление коллагеновых волокон и формирование грубого рубца.
БМА стимулирует миграцию макрофагов М1 системы активации в соединительной и скелетной мышечной ткани, что способствует эффективному и полноценному очищению раны от раневого дебриса, ингибированию фиброза и приводит к адекватной полноценной регенерации [12, 7, 6]. Известно, что макрофаги являются ключевым звеном, определяющим течение и исход регенерации [13].
Целью данного исследования явилось выявление морфофункциональных характеристик и цитокинового профиля макрофагов миометрия рога матки экспериментальных животных. Т.к. данное исследование связано с использованием ряда моноклональных антител, имеющих видо-специфичный резидуальный аффинитет к антигенам крыс, были проведены аналогичные эксперименты на самках крыс.
Материалы и методы
Эксперименты были проведены на 25-ти самках крыс Wistar массой 200-250 г. Животных содержали в соответствии с требованиями ГОСТ РФ от 02.12.2009 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)». Животные находились в стационарных клетках индивидуально. В качестве корма применялся стандартный комбикорм гранулированный полнорационный ПЗК-92. Кормление животных осуществлялось по нормативам в соответствии с видом животных. Водопроводную очищенную воду всем животным давали без ограничений в поилках.
БМА разработан в ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Минздрава России» (руководитель - проф. Э.Р. Мулдашев). Указанный биоматериал изготавливается согласно ТУ 42-2-537-87, сертифицирован и разрешен к применению в клинической практике приказом МЗ СССР № 87 901-87 от 22.07.1987 г. Он представляет собой трансплантат с объемно-волокнистой структурой, приготовленный в данном случае из сухожилий крыс и обработанный по технологии Аллоплант®.
Под внутримышечным наркозом с применением раствора кетамина продольный разрез маточного рога производили фокусированным лучом СО2-лазера в режиме мощности 40-60 Вт «коагуляция» с помощью установки Coherent 3000L (Coherent Inc., США). В первой серии экспериментов у 10-ти животных (контрольная группа) делали разрез лазером, дефект ушивали ви-крилом. У 15-ти крыс (опытная группа) делали разрез лазером и заполняли дефект стенки маточного рога алло-
генным биоматериалом для замещения объемных дефектов. Переднюю брюшную стенку ушивали непрерывным двуслойным викриловым швом 6/0 (Ethicon, США). Животных выводили из опыта через 7, 14, 30, 60, 120 суток после операции путем инсуфляции летальной дозы паров фторотана. Гистологические срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Ги-зону. Гистохимические исследования для определения суммарной фракции кислых гликозаминогликанов проводили по методу Хейла [2].
Иммуногистохимические исследования проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 4-5 мкм с минимальной площадью 1 см2. Для этого аутопсийный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы готовили на микротоме LEICA RM 2145 (Германия). Использовали непрямой стрептавидин-био-тиновый метод с применением моно-клональных антител к PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) (клон PC 10, 1:300), vimentin (клон C 20, 1:300), CD 68 (клон ED 1, 1:300), TGFB1 (трансформирующий фактор роста бетта) (клон ТВ 21, 1:300), FGF 1 (фактор роста фибробластов) (клон С 19, 1: 300) (Santa Cruz Biotechnology, США). Для демаскировки использовали непрямую стрептавидин-биоти-новую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первых антител. Микроскопические исследования проводились с использованием све-
тового микроскопа со специализиро- женным центрально. Цитоплазма в
ванным программным обеспечением виде тонкого ободка располагалась
управления настройками и захватом вокруг ядра и образовывала короткие
изображения Leica DMD 108 (Герма- выросты (рис. 1).
ния). Максимальная численность клеток нарастала в период 14-30 суток. В
Результаты исследований данное время частицы трансплантата
После имплантации БМА в мы- практически не определялись. В зоне
шечный слой рога матки в начальные операции обнаруживалось массивное
сроки (7 суток) наблюдалась умерен- скопление макрофагальных клеток.
ная макрофагально-фибробластиче- Макрофаги были увеличены в раз-
ская инфильтрация частиц биома- мере. В широком ободке цитоплазмы
териала клетками, за счет которых прослеживались разнокалиберные
происходили изменения тинктори- фагоцитарные вакуоли, которые при-
альных свойств. Частицы набухали, давали клетке пенистый вид. Тем не
проявляли признаки пикринофилии и менее, признаков гранулематозного
резорбировались клетками макрофа- воспаления, выражающегося в нали-
гального ряда. Среди инфильтриру- чии гигантоклеточных форм макро-
ющих клеток выявлялись макрофаги, фагов, не было. Окружающая ткань
которые постепенно мигрировали к была представлена тяжами гладко-
фрагментам биоматериала. Макро- мышечных клеток одновекторного
фаги были овальной или вытянутой направления. Признаков грубого руб-
формы с округлым ядром, располо- цевания не наблюдалось (рис. 2а).
Рис. 1. Умеренная инфильтрация макрофагами, набухание и лизис частиц БМА в миоме-трии рога матки крысы через 7 суток. Окраска по Ван Гизону.
47 Бюте&ете • № 2, 2016
Рис. 2. Серийные срезы ткани рога матки крысы через 30 суток после введения БМА. А - интенсивная макрофагальная реакция, окраска гематоксилином и эозином; Б - гликоза-миногликаны в цитоплазме макрофагов, окраска по Хейлу с докраской эозином; В - утеп-йп+; Г - СБ 68+; Д - РСКА+; Е - РОБ1-; Ж - ТОБМ-; 3 - 1Ь1+ непрямой иммунопероксидаз-ный метод выявления антител с докраской гематоксилином.
В начальные сроки эксперимента (7 суток) макрофагальные клетки при выявлении РСКА антигена не окрашивались, спустя 30 суток макрофаги были РСКА+ позитивны (рис. 2д). На серийных срезах аутопсийного материала выявлялись следующие фенотипические характеристики: в цитоплазме макрофагов определялись гликозаминогликаны (рис. 2б), определялся белок промежуточных филаментов утепйп (рис. 2в), противовоспалительные цитокины - РОР1, ТОРВ1 - отсутствовали, либо реакция была слабо выражена (рис. 2е, ж), провоспалительные цитокины 1Ь1, тем не менее, выявлялись (рис. 2з). Все макрофаги были СБ 68-позитив-ны (рис. 2г).
Спустя 60 суток в миометрии рога матки крыс происходила полноценная
регенерация ткани. Она была представлена разновекторными кластерами лейомиоцитов в окружении тонких соединительнотканных прослоек. Частиц биоматериала и скоплений макрофагов в данный период не обнаруживалось (рис. 3).
В контрольной группе животных без использования биоматериала в процессе заживления дефектов наблюдался дефицит СБ 68+ клеток и признаки их функциональной незрелости. Количество ТОРВ1+ макрофагов (М2) значительно превосходило долю макрофагов с провоспалительной направленностью, в результате чего происходило формирование грубого рубца с дальнейшим перерождением в жировую ткань. УтепйП и Хейл+ макрофагов в очаге заживления не зафиксировано.
Рис. 3. Миометрий рога матки крысы после имплантации БМА через 60 суток. Окраска гематоксилином и эозином.
49
ВюшеШсте • № 2, 2016
Обсуждение результатов
Известно, что макрофаги являются гетероморфной клеточной популяцией. Они могут проявлять как секреторную активность, так и фагоцитарную, выраженную в той или иной степени. В зависимости от условий микроокружения макрофаги проявляют цитоки-новую антагонистическую полярность Ml и М2. Взаимодействие и выраженность цитокиновых фаз определяет течение и исход патологического процесса [19].
При регенерации миометрия рога матки крыс с использованием БМА происходила усиленная миграция макрофагов CD68+, которые становились доминирующими клетками гистиона в пролиферативной стадии воспаления. Макрофаги CD68+ проявляют яркое интенсивное окрашивание, что свидетельствует о наличии большого количества микросиалина. Микросиалин - высоко-гликозилированный трансмембранный гликопротеин члена семейства LAMP (лизосом-ассоциированных мембранных протеинов). Он локализован преимущественно в мембране поздних эн-досом [18]. Кроме того, показано, что данная молекула процессирует антиген путем постепенного ферментного расщепления фагоцитируемых клеткой объектов [17]. Это свидетельствует об активной фагоцитарной деятельности клеток и полноценном очищении раны от раневого детрита и самого биоматериала, который к 30-ти суткам полностью резорбируется.
Классическое представление о происхождении макрофагов - это происхождение из костномозговых предшественников [13]. Однако в опытной группе нами были зафиксированы
утепйп4" позитивные макрофаги, содержащие цитоплазматические белки промежуточных филаментов, характерные для клеток мезенхимального происхождения. Данные макрофаги имели Хейл-положительную окраску, т.е. секретировали гликозаминоглика-ны, которые являются компонентом межклеточного матрикса. Признано, что за их выработку ответственны, как правило, клетки фибробластического ряда [13].
Макрофаги мезенхимного происхождения широко распространены в тканях различных органов. Так, наряду с костномозговыми макрофагами, в головном мозге млекопитающих определяются микроглиальные клетки, являющиеся производными желточного мешка [16]. В стекловидном теле ги-алоциты, помимо фагоцитарной функции в патологических условиях, также способны к секреции компонентов межклеточного матрикса [1, 20]. Известно, что плацентарные макрофаги (клетки Кащенко-Гофбауэра) происходят из мезенхимальных стволовых клеток внезародышевой мезенхимы до начала циркуляции моноцитов [8]. Локализуются они в ворсинках хориона. Стромальные плацентарные макрофаги возникают из мезенхимы одновременно с местным ангиогенезом и являются самовозобновляющейся митотически активной популяцией клеток, независимой от эмбриональных моноцитов. Характерной чертой данных клеток является наличие многочисленных крупных вакуолей, содержащих гликозаминогликаны [9, 15]. Клетки Кащенко-Гофбауэра, обладая фагоцитарной деятельностью, участвуют во многих процессах ре-
моделяции ворсинок хориона - ткани, представленной рыхлой соединительной тканью с большим содержанием гликозаминогликанов, заполняющих интерцеллюлярное пространство [8].
Ранее в наших работах отмечались «матриксформирующие» макрофаги, обнаруженные при имплантации БМА в соединительной ткани и имеющие морфологические характеристики подобные таковым плацентарных макрофагов [11]. Предположение о причислении утепйп4" макрофагов к категории клеток Кащенко-Гоффба-уэра закрепляется фактом выявления в их цитоплазме большого количества гликозаминогликанов, интенсивно окрашивающихся в синий цвет при проведении гистохимической реакции по методу Хейла. Полное раскрытие механизмов действия У1тепйп+/Хейл+/ СБ68+ макрофагов после применения аллогенных биоматериалов требует дополнительных исследований. Можно предположить, что их наличие в зоне регенерации связано с синтезом углеводного компонента внеклеточного матрикса, определяющего зрелость коллагеновых волокон соединительнотканных прослоек, создание гоме-остаза в очаге замещения реактивной зоны при адекватной полноценной регенерации мышечных тканей, и играть структурно-информативную роль для клеточных коопераций.
Т.к. в начальные сроки эксперимента РСМА+ макрофаги не выявлялись, следовательно, на этой стадии эксперимента в зоне имплантации БМА накопление макрофагов происходило за счет миграции резидентов и костномозговых предшественников, а в более отдаленные сроки популяция кле-
ток поддерживалась за счет деления утепйп4" макрофагов. Известно, что протеогликаны, высвобождающиеся при деградации и лизисе БМА, являются хемоаттрактантами макрофагальных клеток [10]. В случае, когда резервные клеточные возможности истощаются, или их недостаточно для полноценной утилизации биоматериала, в зону поражения рекрутируются дополнительные источники.
Наши исследования показали, что окончательный итог регенерации гладкой мышечной ткани зависит от фенотипа макрофагов и их секреторной активности, которая носит дуалистический характер. Заживление дефекта рога матки с использованием аллогенного биоматериала может быть обусловлено низкой степенью коллагеногенеза, регуляция которого осуществляется в т.ч. макрофагами [3]. Так, антигены РОР1 и ТОРр1 в макрофагах миометрия практически не определялись или их количество было минимальным. Классически активированные макрофаги, содержащие провоспалительные монокины (1Ы), подавляли экспрессию противовоспалительных, т.к. они являются антагонистами по отношению друг к другу [14]. Это обуславливало полноценный фагоцитоз самого биоматериала и раневого детрита, обладающего антигенностью, и снижение скорости коллагеногенеза.
Заключение
В процессе регенерации мышечного слоя рога матки, индуцированного аллогенным биоматериалом, наряду с костномозговыми макрофагами участвуют мезенхимные аналоги с активной фагоцитарной функцией и с провоспа-лительным цитокиновым спектром М1.
51
Вюше&сте • № 2, 2016
Список литературы
1. Вит В.В. Строение зрительной системы человека: уч. пособ. - Одесса: Астропринт. 2010. 220 с.
2. Кононский А.И. Гистохимия. - Киев: «Вища школа». 1976. С. 146-147.
3. Лебедева А.И. Аллогенный губчатый биоматериал - ингибитор фиброза поврежденной скелетной мышечной ткани // Российский биотерапевтический журнал. 2014. № 4. Т. 13. С. 37-44.
4. Лебедева А.И. Посттравматический гистогенез миометрия рога матки кролика, индуцированный аллогенным биоматериалом // Технологии живых систем. 2015. № 1. С. 34-40.
5. Лебедева А.И., Муслимов С.А., МусинаЛ.А.
Регенерация гладкой мышечной ткани рога матки кролика после разреза лучом лазера и применения аллогенного биоматериала // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. 2013. № 4. Т. 28. С. 41-45.
6. Лебедева А.И., Муслимов С.А., Мусина Л.А., Гареев Е.М. Роль резидентных макрофагов в регенерации скелетной мышечной ткани, индуцированной биоматериалом Ал-лоплант // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4350.
7. Лебедева А.И., Муслимов С.А., Мусина Л.А., Щербаков Д.А. Изучение активности макрофагов и их цитокинового спектра при регенерации скелетной мышечной ткани, индуцированной аллогенным биоматериалом // Российский иммунологический журнал. 2013. № 2-3. Т. 7(16). С. 305.
8. Милованов А.П. Патология системы мать-плацента-плод: рук-во для врачей. - М.: Медицина. 1999. 448 с.
9. Милованов А.П., Шатилова И.Г., Кадыров М. Гистофизиология плацентарно-маточной области // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. 1997. № 2. С. 38-44.
10. Муслимов С.А. Морфологические аспекты регенеративной хирургии - Уфа: Башкортостан -.168 с., 2000.
11. Мусина Л.А., Муслимов С.А., Лебедева А.И., Волгарева Е.А. Ультраструктура макрофагов, выявляемых при имплантации аллогенного биоматериала Аллоплант // Морфология. 2006. № 1. С. 53-56.
12. МусинаЛ.А.,Муслимов С.А.,ЛебедеваА.И., Зыков О.В. Роль макрофагов в регенерации соединительной ткани при имплантации биоматериалов // Здравоохранение Башкортостана. Актуальные вопросы патологии. 2004. № 4. С. 146-149.
13. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань. - М.: Медицина. 1981. 312 с.
14. Abraham D.J., Хи S., Black С.М., et al. Tumor necrosis factor a-suppresses the induction of connective tissue growth factor by transforming growth factor-P in normal and scleroderma fibroblasts // J. Biol. ^em. 2000. Vol. 275. Is. 20. Р. 15220-15225.
15. Castelluci М., Celona A., Bartels H., et al. Mitosis of the Hofbaur cells: possible implications for a fetal macrophage // Placenta. 1987. Vol. 8. No. 1. P. 65-76.
16. Ginhoux F., Greter М., Leboeuf М., Nandi S., See P., Gokhan S., Mehler M.F., Conway S.J., Ng L.G., Stanley E.R., Samokhvalov I.M., Merad M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages // Science. 2010. No. 5. Vol. 330(6005). P. 841-845. doi: 10.1126/sci-ence.1194637.
17. Holness C.L., da Silva R.P., Fawcett J., Gordon S., Simmons D.L. Macrosialin, a mouse macrophage-restricted glycoprotein, is a member of the lamp/lgp family // J. Biol. chem. 1993. Vol. 268. P. 9661-9666.
18. Linehan S.A. The mannose receptor is expressed by subsets of APC in non-lymphoid organs // BMC Immunol. 2005. Vol. 6. P. 1471-1477.
19. Mantovani A., SicaA., LocatiM. Macrophage polarization comes of age // OJRM. 2005. Vol. 23. Is. 4. P. 344-346. doi:10.1016/j.immu-ni.2005.10.001.
20. Yamada H., Obata H., Kaji Y., Yamashita H. Expression of transforming growth factor su-perfamily receptors in developing rat eyes // Jpn. J. Ophthalmol. 1999. No. 43. P. 290-294.
Alloplant biomaterial when used in myometrium regeneration of the experimental animal uterine horn is a macrophage stimulator of the mesenchymal origin
A.I. Lebedeva
Alloplant biomaterial (ABM) was implanted into the myometrium defect of the rat's uterine horn. As a result of that procedure full-blown structural regenerate consisting of leiomycyte clusters and interlayers of the fibrous connective tissue was being formed. Regeneration invoking M 1 macrophages of the mesenchymal origin containing glyscosaminoglycanes was taking place. In the control group there was revealed a deficit of macrophages with the formation of the rough scar in the defect zone when ABM hadn't been used. The morphological investigation was carried out with the use of histological (hematoxylin and eosin stain as per van Gieson), histochemical (Hale's stain) and immunohistochemical (vimentin, CD68, IL1, FGF1, TGFP1) methods.
Key words: Alloplant biomaterial, macrophages, myometrium uterine horn, regeneration.
53
Biomedicine • № 2, 2016
