CC BY
25
2003 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 3 (№19)
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОФИЗИКА, БИОХИМИЯ
' УДК 612.117.7+616.155.392
В. Б. Матюшичев, В. Г. Шамратова, А. Р. Ахунова УЧАСТИЕ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ
В КОНТРОЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
Изучение механизмов регуляции электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) — жизненно важного параметра внутренней среды организма, определяющего суспензионную устойчивость этих клеток в циркуляции, существенно для понимания особенностей контроля реологических свойств крови. Ранее, в опытах по адаптации животных к холодовой нагрузке, нами было показано [2], что у интактных крыс соотношение субпопуляций эритроцитов с различной подвижностью в электрическом поле не отличается от аналогичных характеристик крови человека, но модулирующее действие строфантина (ингибитора натриевого насоса) на форму эритрограмм проявляется у крыс отчетливей, когда в крови преобладают клетки с пониженным электрокинетическим потенциалом. В ходе холодовой адаптации крыс происходили перестройка структуры эритроцитарных популяций и сглаживание видовых различий эффектов строфантина. Известно, что охлаждение стимулирует выход в сосудистое русло эндогенных ти-реоидных гормонов [1], участвующих в приспособлении организма к воздействию низкой температуры [5], а дополнительная инъекция таковых животным ускоряет процесс формирования состояния адаптированности к холоду [4]? В связи с этим представляло интерес изучение поведения эритроцитарных популяций при хроническом охлаждении животных, сочетающемся с действием тиреоидина — комбинированного препарата, содержащего тироксин и трийодтиронин.
Материал и методика. Опыты проведены на 24 беспородных белых крысах-самцах с исходной массой 150-160 г, которые испытывали воздействие пониженной температуры среды в течение 6 недель; 36 крыс подвергались аналогичной процедуре 2 недели; столько же интактных животных составили контрольную группу. Подопытных животных помещали в холодильную камеру с температурой воздуха -4°С. Начальная термоэкспозиция крыс равнялась 15 мин, в дальнейшем длительность сеанса охлаждения ежесуточно возрастала на 10 мин. Тиреоидин вводили крысам, проходящим курс 6-недельного холодового воздействия, ^ на протяжении всего срока адаптации, 2 раза в неделю перед сеансом охлаждения, внутрижелудочно, в дозе 100 мг/100 г массы животного. Кровь для анализа отбирали из хвостовой вены. Для определения электрофоретической подвижности 0,02 мл крови разводили 0,1 моль/л фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1:200. При изучении влияния строфантина его добавляли в аликво-
. © В. Б. Матюшичев, В. Г. Шамратова, А. Р. Ахунова, 2003
ты крови до конечной концентрации Ю-5 моль/л. Электрофоретическую подвижность эритроцитов измеряли перед внесением этого биологически активного агента в пробу и через 10 мин экспозиции. Микроэлектрофорез проводили при 5°С и при 25 °С на установке «Пармоквант-2» в автоматическом режиме. На основе показаний индивидуальной подвижности 500 клеток вычисляли ее средние значения, а также производили расчеты коэффициента асимметрии (Аэ) распределения электрофоретической подвижности эритроцитов в каждой пробе крови и в целом по группам крыс. Кроме того, находили коэффициенты корреляции параллельных рядов данных. Достоверные различия выявляли с применением критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Поскольку активность Ка+, К+-АТФазы как мем-бранносвязанного фермента при низкой температуре уменьшается и даже полностью подавляется, а так называемая холодовая инактивация фермента сопровождается частичной деполяризацией мембраны [3], нас заинтересовала реакция ЭФПЭ на понижение температуры самой среды инкубации и особенности поведения ЭФПЭ при разных способах ингибирования натриевого насоса: строфантином и низкой температурой среды. С этой целью одни и те же аликвоты крови интактных животных анализировались в обычных условиях (при 25°С), после внесения в пробы строфантина (при 25°С) и при 5° С, без внесения в пробы строфантина.
Выяснилось, что, согласно картине поведения критических интервалов варьирования Ав [2], строфантин наиболее эффективен в отношении субпопуляций клеток, включающих эритроциты с пониженным электрокинетическим потенциалом. Коэффициенты же Аэ распределений для проб крови, исследованных при 5 °С, близки к нулю, т. е. сами распределения ЭФПЭ нормализуются. При этом корреляции между Аэ распределений исходных проб и их значениями после понижения температуры среды статистически недостоверны, тогда как корреляция между Аэ исходных проб и величиной индивидуальных отклонений показателя (ААб) достоверна по «нейтральному» интервалу (г = -0,58). Следовательно, здесь характер распределения предопределяет величину и направленность его изменения в случае, если оно мало отличается от нормального.,что практически не проявляется при действии строфантина.
Сопоставление средних ЭФПЭ, измеренных при 5°С, свидетельствует о том, что они снижаются практически до одной и той же величины" независимо от исходных средних величин и Аэ распределений (в среднем до 0,69 ± 0,01). Очевидно, при этой температуре эритроцит ведет себя в электрическом поле как частица, заряд которой определяется исключительно поверхностными структурами, а вклад активности переносчиков катионов сквозь плазматическую мембрану здесь минимален. При этом исчезает расслоение популяции эритроцитов на отдельные субпопуляции, исходное наличие которых, по-видимому, обусловлено различным уровнем активности метаболизма составляющих их клеток. Другими словами, в отличие от строфантина, проявляющего модулирующие свойства в зависимости от исходного состояния эритроцитарной популяции, последствия температурной инактивации Ма+, К+-АТФазы проявляются снижением подвижности эритроцитов и ростом однородности совокупности.
Аналогичный анализ был проведен нами по данным электрофоретических исследований крови крыс, подвергнутных кратковременной холодовой адаптации (2 недели). В этом случае конечный результат влияния строфантина во всех интервалах варьирования Ав выражался в нормализации распределения, а величина индивидуальных отклонений коэффициента в крайних интервалах была практически идентична по модулю. При снижении температуры среды инкубации до 5° С-распределения нормализовались во всех трех диапазонах. То есть изменения ЭФПЭ в присутствии специфического ин-
гибитора натриевого насоса и вследствие понижения температуры среды инкубации у адаптированных к холоду животных носят однонаправленный характер.
«Электрокинетические» итоги процесса длительной холодовой адаптации крыс (6 недель) на фоне систематического внутрижелудочного введения им тиреоидина отражены в табл.1, где приведены данные, иллюстрирующие особенности распределения эритроцитов по ЭФП в исследуемой группе. .Средняя As распределения ЭФПЭ для нее составила 0,51±0,02 до и -0,11±0,02 после внесения in vitro строфантина. Соотношение частоты встречаемости различных типов распределений, а также средняя по группе As в исходных пробах имеют существенные отличия от результатов по интактным животным,что в конечном счете находит отражение в положительно-асимметричном распределении суммарной выборки. При анализе средних ЭФПЭ в этом случае можно отметить снижение строфантином подвижности клеток в совокупностях, характеризующихся нормальным распределением, и ее отчетливое увеличение в субпопуляциях с относительным преобладанием клеток, имеющих низкий электрокинетический потенциал.
Таблица 1. Средние величины As ЭФПЭ у крыс на фоне действия тиреоидина, Asimos
Интервал варьирования As ЭФПЭ
Условия опыта « отрицательный » « нейтральный » «положительный»
. п - 6 71 = 10 п = 8
До строфантина -0,39±0,04 -0,01±0,03л 0,74±0,04Л
После строфантина -0,17±0,04* -0.14±0,03* -0,05±0,04*л
ДАs 0,22±0,03* -0,13±0,02*л -0,79±0,03*л
* Достоверное отличие от показателя до внесения строфантина, р<0,05; «А» — достоверное различие по интервалам (то же для табл.2).
Как следует из табл.2, нормализация распределения.в «положительном» диапазоне сочетается с резким повышением средней ЭФПЭ. Причем здесь выявляется тесная коррреляция степени асимметричности кривой исходных проб крови с уровнем средней ЭФПЭ после внесения в них строфантина (г = 0,95) и ДМ (г = 0,91). Слабее эти связи проявляются в «нейтральном» диапазоне и вовсе не обнаруживаются в «отрицательном». В «положительном» классе, кроме того, выявляется достоверная корреляция между величиной индивидуальных изменений Ав и М в присутствии строфантина (г = -0,73).
Таблица 2. Средние ЭФПЭ крови крыс на фоне действия тиреоидина,
мкм см/с-В (М±гп)
Интервал варьирования As ЭФПЭ
Условия опыта « отрицательный » «нейтральный» « положительный»
п = 6 п = 10 п = 8
До строфантина 1,21±0,01 1,19±0,01 0,98±0,02Л
После строфантина 1,19±0,01 1,15±0,02*Л 1,08±0,03* л
ДМ -0,02±0,02 -0,04±0,02 0,10±0,03л
Анализ показывает, что у животных, подвергнутых длительному ступенчатому охлаждению на фоне введения в организм высоких доз тиреоидина (при пересчете на единицу массы тела она в 50 раз превышала «среднетерапевтическую» дозу для людей), изменяется соотношение субпопуляций эритроцитов. Увеличивается встречаемость субпопуляций с преобладанием клеток, имеющих низкую ЭФП. Эти субпопуляции наиболее активно реагируют на экзогенный строфантин (в отличие от аналогичной
контрольной группы — без внесения гормона), о чем свидетельствуют рассмотренные корреляции и возросшая средняя величина ЭФПЭ.
То, что наблюдаемые эффекты связаны с действием именно высоких концентраций тиреоидина, подтверждается и анализом показателей ЭФПЭ, отмеченных нами через 1 ч после одноразового введения гормона интактным крысам (100 мг/100 г массы). Тиреоидин in vivo в целом увеличивал ЭФП клеток (в среднем на 6,4%) и вызывал перераспределение в общем пуле эритроцитов с различной подвижностью. При этом в сосудистом русле несколько возрастала относительная доля клеток, имеющих более низкий, чем в среднем по совокупности, электрокинетический потенциал. Такое расслоение сопровождалось, судя по уменьшению коэффициента Ех (-0,51±0,04) и дисперсии общего распределения, ростом функциональной неоднородности клеток. Причем введенный в пробы крови in vitro строфантин не вызывал снижения средней ЭФПЭ (оно недостоверно), но нормализовал профиль кривых распределения.
Таким образом, бесспорно можно констатировать, что в условиях проведенных нами опытов экзогенный тиреоидин изменял структуру эритроцитарных популяций по электрокинетическим свойствам составляющих их клеток. Вместе с тем говорить о непосредственном участии тиреоидных гормонов в регуляции уровня ЭФПЭ, а тем более о каком-либо аналогичном влиянии in situ (в циркуляции), достаточных оснований пока нет. Возможно, контроль ЭФПЭ в данном случае осуществляется путем активации эритроидного ряда гемопоэза, поскольку известно,что гормоны щитовидной железы способствуют образованию молодых форм эритроцитов. Тиреоидные гормоны также активируют мембранную Na+, К+-АТФазу [7] и Са2+-АТФазу плазматических мембран [8]. В то же время при их действии наряду со стимуляцией уабаин-ингибированного входа К+ усиливается пассивный вход Na+ и выход К+ из клеток [6]. Вполне возможно, что увеличение пассивной проницаемости эритроцитарных мембран при гипертиреои-дизме обусловлено энергетическим истощением части клеток.
Судя по нашим данным, механизмы влияния тиреоидных гормонов на эритроци-тарную мембрану действительно многообразны, а их эффекты на различные клетки популяции неоднозначны. У большей части эритроцитов активация энергообмена под действием тиреоидина способствует повышению их энергетического потенциала и ЭФП, при этом строфантин оказывает на эти параметры угнетающее действие (что можно пронаблюдать по снижению средней ЭФПЭ в «нейтральном» диапазоне). У другой же части клеток энергетические ресурсы, видимо, быстро истощаются и клетки отвечают на введение строфантина повышением ЭФП. Впрочем, очевидно, что для конкретиза- • ции рассмотренных вариантов развития событий необходимы эксперименты с использованием не столь массированных, а более щадящих доз, близких к физиологическому уровню гормонов щитовидной железы.
Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковым. Summary
Matyushichev V. В., Shamratova V. G., АкНцпоьа A. R. Involvment of thyroid hormones in control of electrophoretic mobility of erythrocytes.
It was studied the changes of blood erythrocyte electrophoretic mobility under chronic 6-weeks cooling against the background of systematic introduction into organism of a thyreoidine in high doses. It was ascertained that the structure of erythrocyte populations by electrokinetic properties of the cells they consist is modified under coercion of thyreoidine: the relative quantity of individuals with cells prevalence have lower mobility in comparison with its average level increase. In contrast to the control group, without hormone brought in, these erythrocyte subpopulations most actively reacted upon exogenous strophanthin.
Литература
1. Куликов В. Ю., СеменюкА. В., Колесникова Л. И. Перекисное окисление липидов и холодовой фактор. Новосибирск, 1988. 2. Матюшичев В. Б., Шамратова В. Г., АхуноваА. Р. Влияние строфантина на электрофоретическую подвижность эритроцитов крови крыс в норме и при адаптации животных к холодовой нагрузке // Вести. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 2 (№11). С. 85-92. 3. Пост-нов Ю. В., Орлов С. Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. М., 1987. 4. Соболев В. И.,Анохин В. А. Влияние трииодтиронина и катехоламинов на стойкость следовых эффектов холодовой адаптации у крыс // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1989. №1. С. 110-116. 5. Теппер-мен Дж.., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М., 1989. 6. Faramarz L, Richard S., Haber J. Stimulation of active Na+ and K+ transport by thyroid hormone in a rat liver cell line: role of enhanced Na+ entry // Endocrinology. 1986. Vol. 119, N6. P. 2527-2536. 7. Kjeldsen K. Regulation of the concentration of 3H-ouabain binding sites in mammalian skeletal muscle. Effect of age, K-depletion, thyroid status and hypertension // Dan. Med. Bull. 1987. Vol.34, N. 1. P. 15-46. 8. Lawrence W., Osawa Y., Davis P., Bias S."Structure — activity relationships of sex steroid analogs determined in vitro a thyroid hormone — responsive membrane Ca2+-ATPase model // Endocrinology. 1986. Vol. 119, N6. P. 2803-2808.
Статья поступила в редакцию 17 марта 2003 г.
