CC BY
38
реакций. В настоящее время отмечается тенденция к внедрению протоколов культивирования ММСК, основанных на замене ксеногенной сыворотки человеческой.
Цель работы — доказать возможность эффективной экспансии ММСК при использовании ABCIVl-сыворотки человека для культивирования in vitro.
Материал и методы. АВ(1\/)-сыворотка получена от здоровых доноров крови (пул от 21 донора).
Протокол 1 (контрольный вариант). Мононуклеары, полученные из пунктата костного мозга центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографин, высевали в культуральные флаконы Т25 (Sarstedt, Германия) в концентрации 0,5 млн/см2 в полной питательной среде (ППО: —-МЕМ с глутамаксом (Invitrogen, GIBCO, США), 5% АВ (1У)-сыворотки, пенициллин/ стрептомицин и помещали в С02 инкубатор при 37°С на 48 ч. Затем удаляли неадгезировавшиеся клетки и проводили замену среды. При достижении 80—90% конфлюентности клетки снимали с подложки 0,25% раствором трипсин-ЗДТА. Полученную первичную культуру высаживали во флаконы в концентрации 5 тыс/см2 и инкубировали в С02 инкубаторе до достижения 80— 90% конфлюентности. Таким способом провели три пассажа. Замену среды проводили каждые сут.
Протокол 2 отличался от контрольного получением первичной культуры и посевной концентрацией при пассажах. Пунктат костного мозга разводили средой —-МЕМ без сыворотки в соотношении 1:4, вносили в культуральные флаконы. Через 48 ч удаляли неадгезировавшиеся клетки и далее вели культуру в ППС по протоколу 1. При пассажах использовали посевную концентрация 1 тыс/см2.
Протокол 3. Получение первичной культуры, наращивание и пассажирование ММСК проводились по регламенту протокола 1 с заменой ППС на среду следующего состава: среда для культуры клеток IMDM (Invitrogen, GIBCO, США), сыворотка крови группы АВ(IV) 5%, 10~4 М 2-меркаптоэтанола, пенициллин/ стрептомицин.
Результаты. Исследование каждого протокола проведены на трех образцах костного мозга со значениями теста КОЕ-Ф 25,0; 4,7и 11,3 колонии на 1x10s мононуклеаров.
Получение первичной культуры ММСК из цельного костного мозга было менее эффективно по сравнению с получением клеток из популяции выделенных мононуклеаров. Добавление в среду культивирования 2-меркаптоэтанола стимулировало пролиферацию ММСК — количество клеток в первичной культуре в 2,3 раза превышало значения контрольного протокола. Период наращивания первичной культуры был одинаковым и составлял 10—11 сут.
В дальнейшем, при пассировании клеток в посевной концентрации 1 тыс/см2, была установлена наиболее высокая пролиферативная активность ММСК на протяжении всего периода субкультивирования, что позволило получить количество клеток, значительно превышающее контрольные показатели. Напротив, клетки в среде IMDM с 2-меркаптоэтанолом демонстрировали слабую пролиферативную активность. Всего за 3 пассажа из 1 мл костного мозга по протоколу 1 xx xx xx ния клеток относительно первоначально внесенного количества КОЕ-Ф (в расчете на 1 мл костного мозга)
x
xx раза. Продолжительность наращивания культуры составила 29; 31; 31 сут.
Число удвоения клеток культуры было самым высоким в период первого пассажа и постепенно снижалось к третьему пассажу. При этом число генераций ММСК, высеваемых в концентрации 1 тыс/см2, на первом и третьем пассажах в 2,6 раза превосходило значения контрольного протокола, а число генераций культуры ММСК по протоколу 3 было ниже контроля в 2,2 и 3,6 раза соответственно. Общее число генераций ММСК в течение 3-х пассажей по протоколам 1, 2 и 3 составило 12,3; 16,3; 9,7.
Таким образом, проведенные исследования показали, что применение 5% сыворотки АВ(IV) в качестве добавки к питательной среде, позволяет получить количество ММСК, необходимое для клинических целей. Оптимальными условиями для наращивания ММСК являются: получение первичной культуры из суспензии мононуклеаров, применение полной пита—
рации 3+1 тыс./см2 при пассировании.
Т.С. Йылмаз, А.А. Гумерова, А.П. Киясов,
А.В. Табанакова, Д.И. Андреева, И.М. Газизов,
М.С. Калигин
Участие гемопоэтических С034(+)-клеток в репаративной регенерации почки
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия [email protected]
T.S. Yilmaz, А.А. Gumerova, А.Р. Kiassov, A.V. Tabanakova,
□.I. Andreeva, I.M. Gazizov, M.S. Kaligin
Study of CD34-positive haematopoietic cells in kidney
regeneration
Проблема хронического гломерулонефрита (ХГН) занимает одно из центральных мест в нефрологии. Актуальность этого заболевания обусловлена его высокой распространенностью, поражением в основном работоспособной части населения и неизбежным развитием хронической почечной недостаточности. Кроме того, крайне проблематичной остается терапия ХГН. Так, медикаментозное лечение малоэффективно и сопряжено с многочисленными побочными эффектами, гемодиализ является лишь методом паллиативной терапии, а трансплантация почки часто невозможна. В связи с этим необходимым является поиск новых методов лечения, одним из которых может стать клеточная терапия с использованием гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).
К сожалению, на сегодняшний день ничего не известно об участии ГСК в регенерации клубочков при ХГН, и соответственно, чтобы установить целесообразность трансплантации ГСК при ХГН, необходимо получить ответ на этот вопрос. Кроме того, перед тем как трансплантировать стволовые клетки с целью лечения какого-либо заболевания, необходимо знать, как ведут они себя в здоровой почке, мигрируют ли трансплантированные клетки в почку, и если мигрируют, то в какие отделы встраиваются.
Цель исследования: изучить возможность участия гемопоэтических С034( + )-клеток в процессах восстановления клубочков у больных ХГН, а также хоуминг и дифференцировку трансплантированных мононуклеаров пуповинной крови человека в интактных почках крыс.
Материалы и методы. Изучение участия стволовых клеток в процессах репаративной регенерации почки проведены на 64 нефробиоптатах больных различными клинико-морфологическими формами первичного гломерулонефрита. Для выявления гемопоэтических С034( + )-клеток в клубочках использовали иммуно-гистохимическое окрашивание к С031 (маркёру эндотелиальных клеток) и С034 (маркёру эндотелиальных и гемопоэтических стволовых клеток). Преобладание экспрессии С034 над С031 клетками клубочков свидетельствовало о наличии в них гемопоэтических С034( + )-клеток. Для каждого нефробиопата проводили гистоморфологическую оценку индекса воспалительной активности ХГН и индекса склероза клубочков, а также иммуногистохимическим методом изучали пролиферативную активность клеток клубочков (окрашивание к РСЫА) и их миофибробластическую транс-дифференцировку (окрашивание к б-ГМА).
Изучение участия стволовых клеток в процессах физиологической регенерации почки проведено на 15 белых беспородных крысах, которым в хвостовую вену вводили фракцию мононуклеаров пуповинной крови человека, выделенную на градиенте плотности фикол-ла. Через 2, 5, 7 и 14 сут. проводили иммуногистохи-мическое окрашивание антителами к лейкоцитарному антигену человека (ША-АВС) для изучения миграции и дифференцировки введенных клеток.
Результаты. Сравнительный анализ показал, что в 34% нефробиоптатов гемопоэтические С034( + )-клет-ки обнаруживались в клубочках. На основании того, что столовые клетки — это дополнительный регенераторный резерв, а ХГН — это хроническое иммуновос-палительное повреждение почки, мы решили изучить взаимосвязь между появлением гемопоэтических С034( + )-клеток в клубочках и морфологической активностью заболевания (индексом воспалительной активности и индексом склероза клубочков) и сопоставить это с наиболее изученными механизмами регенерации — пролиферацией клеток клубочков и их миофибробластической трансдифференцировкой. Установлено, что максимальное число нефробиоптатов с наличием гемопоэтических С034( + )-клеток обнаруживается при индексе воспалительной активности ХГН до 4 баллов и индексе склероза клубочков до 2 баллов. В то же время, значительно чаще нефро-биоптаты с повышенной пролиферативной активностью клеток клубочков и их миофибробластической трансдифференцировкой встречались у больных с индексом воспалительной активности более 4 и индексом склероза клубочков более 7 баллов.
Результатом иммуногистохимического окрашивания почек крыс антителами к НЬА-АВС после трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека стало обнаружение Н1_А-АВС( + )-клеток в эпителиальной выстилке дистальных канальцев нефрона на всех экспериментальных сроках — 2, 5, 7 и 14 сут. Причём НЬА-АВС экспрессировался не во всех дистальных канальцах и не всеми клетками.
Выводы.
1. Гемопоэтические С034( + )-клетки участвуют в регенерации клубочков при ХГН, и это участие максимально при минимальной и умеренной воспалительной активности заболевания (1—4 балла) и минимальном склерозе клубочка (1—2 балла). При более выраженном воспалении и склерозе основную роль в регенерации играют процессы пролиферации и миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочка.
2. Мононуклеары пуповинной крови человека, трансплантированные в системный кровоток крыс, мигрируют в неповрежденную почку и встраиваются в эпителиальные клетки дистальных канальцев нефрона, на основании чего дистальные канальцы можно рассматривать как «нишу» стволовых клеток.
М.З. Кауламбаева \ М.К. Амиргазиева \
Г.С. Стабаева \ К.С. Бименов1, А.М. Орекешова а Применение клеточных технологий для профилактики несостоятельности легочных швов в эксперименте
1 НПП «Антиген», Алматы, Казахстан
2 Национальный научный медицинский центр,
Астана, Казахстан [email protected]
M.Z. Kaulambayeva, М.К. Amirgaziyeva, G.S. Stabayeva,
K.S. Bimenov, A.M. Orekeshova
Application of cell technologies for the prevention of pulmonary failure seams in the experiment
В хирургии нет более важной проблемы, чем предупреждение и борьба с послеоперационными осложнениями. Особую опасность представляет собой ранняя и поздняя несостоятельность легочных и бронхиальных швов, которая влечет за собой тяжелые последствия в виде развития гнойно-воспалительных процессов, бронхоплевральных свищей, обусловливающих высокую инвалидность и послеоперационную летальность. По данным научной литературы частота осложнений при операциях на легких с формированием легочно-бронхильно-плевральных свищей наблюдается в 7,3% случаях.
Цель работы: экспериментальное обоснование применения культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека и клеток диплоидного штамма фибробластов человека ЗФЧ 01/05 на коллагеновом матриксе для профилактики несостоятельности легочных швов.
Работу проводили на кроликах весом 3—4 кг, возрастом 10—12 мес. в количестве 36 шт. Подопытные животные были разделены на 4 группы (одна контрольная и три испытуемые). Подопытным животным после введения наркоза и обработки операционного поля произведена правосторонняя торакотомия, пневмоторакс. После иссечения легочной ткани на рану были наложены швы. На поверхность швов у животных испытуемых групп была нанесена суспензия клеток (ММСК или ЗФЧ 01/05) в коллагеновом геле и наложена коллагеновая мембрана.
На 3, 7 и 14 сут. после операции животных выводили из опыта. Производили вскрытие плевральной полости. Проводили осмотр плевральной полости на предмет содержания патологической жидкости и состоятельности легочных швов. Проводили обследование легких на герметичность швов (водные пробы). Взяты кусочки легочной ткани в области шва для патоморфологических исследований.
У животных первой контрольной группы — на 3 сут. швы не состоятельны, на 7 и 14 сут. после операции швы состоятельны, но не герметичны. Во второй испытуемой группе (наложение на шов только коллагеновой мембраны) — на 3 и 7 сут. швы состоятельны, но не герметичны, на 14 сут. шов состоятелен и герметичен. В третьей испытуемой группе (с нанесением суспензии клеток ЗФЧ 01/05 с наложением коллагено-
