CC BY
69
УДК 616-002.72+576.851.4+615.372
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ НЕКРОТИЗИРУЮЩИЙ ФАКТОР YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS, ВОЗБУДИТЕЛЯ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ СКАРЛАТИНОПОДОБНОЙ ЛИХОРАДКИ
Елена Викторовна ПЕРСИЯНОВА1, Руслан Ренатович АДГАМОВ2, Алексей Константинович СУРИН3,4, Екатерина Константиновна ПСАРЁВА1, Светлана Александровна ЕРМОЛАЕВА2, Нэлли Фёдоровна ТИМЧЕНКО1
1 ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1
2 ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18
3 ФГБУН Институт белка РАН 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 4
4 ФГБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Минздрава России
142279, пос. Оболенск
В статье представлены материалы по выделению и очистке цитотоксического некротизирующего фактора Yersinia pseudotuberculosis, его идентификации методом масс-спектрометрии, молекулярно-генетической характеристике двух доменов гена этого токсина, в том числе функционально значимого, в штаммах Yersinia pseudotuberculosis, изолированных от больных, мелких мышевидных грызунов и из окружающей среды в Российской Федерации.
Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis, штамм, цитотоксический некротизирующий фактор, белок, ген.
В современных условиях бактериальные инфекции представляют глобальную проблему. Стало очевидным, что остановить процесс их распространения среди населения и существенно повлиять на заболеваемость к настоящему времени не удалось. Более того, имеет место появление новых и возвращение старых инфекций. Ярким примером существования таких проблем служат возбудители чумы и псевдотуберкулеза (Yersinia pestis и Y pseudotuberculosis). Это заставляет исследователей искать причины появления такой высокой агрессивности у возбудителей.
В середине ХХ столетия на Дальнем Востоке России (Приморский край) начали регистрироваться многочисленные вспышки ранее неизвестного заболевания, названного до выяснения его этиологии дальневосточной скарлатинопо-добной лихорадкой (ДСЛ) [2]. Как обнаружено, возбудителем этого заболевания, протекающего с тяжелой клинической картиной и рецидивами, является Y pseudotuberculosis [1]. Наблюдения позволили сформулировать положение, что ДСЛ - это острая инфекционная болезнь, характеризующаяся циклическим течением, инток-
Персиянова Е.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории экологии патогенных бактерий, t-mail: Helen-pers@yandex.ru
Адгамов Р.Р. - младший научный сотрудник лаборатории экологии возбудителей инфекций, e-mail: bacter@yandex.ru
Сурин А.К. - к.ф.-м.н., научный сотрудник лаборатории физики белка, e-mail: alexey_surin@mail.ru
Псарёва Е.К. - младший научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий, e-mail: katehok_84@mail.ru
Ермолаева С.А. - д.м.н., проф., зав. лабораторией экологии возбудителей инфекций, e-mail: sveta@ermolaeva.msk.su
Тимченко Н.Ф. - д.м.н., проф., зав. лабораторией молекулярных основ патогенности бактерий, e-mail: ntimch@mail.ru
сикацией, лихорадкой, экзантемой и преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, печени и суставов.
Возбудитель ДСЛ продуцирует факторы па-тогенности с инвазивной, антифагоцитарной и токсической функциями, кодируемыми хромосомными и плазмидными (pYV) генами [3]. В этой статье внимание сосредоточено на одном из недавно открытых белковых токсинов Y. pseudotuberculosis - цитотоксическом некро-тизирующем факторе (cytotoxic necrotizing factor, CNF) [9]. Авторы сообщили, что экстракты из Y. pseudotuberculosis индуцируют увеличение размеров и многоядерность клеток HEp-2, подобно цитотоксическому некротизирующему фактору E. coli. Активность препаратов не зависела от присутствия плазмиды вирулентности (pYV) и не ингибировалась антителами, способными нейтрализовать CNF1 E. coli. Также было выявлено, что нуклеотидная последовательность гена cnf Y pseudotuberculosis на 65,1 % идентична гену cnf E. coli.
В последующие 10 лет появились статьи, в которых были представлены материалы по изучению механизмов действия этого токсина иерсиний, его роли в вирулентности бактерий и в развитии патологического процесса при псевдотуберкулезе [5-8, 10]. Стало ясно, что CNF Y pseudotuberculosis является белком молекулярной массой около 115 кДа [6]. Несмотря на достигнутые успехи в изучении CNF Y. pseudotuberculosis, остается много вопросов, на которые пока нет ответов. Прежде всего это касается возможной роли данного фактора патогенности в появлении нового клона Y. pseudotuberculosis - возбудителя дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки [4].
В связи с новыми фактами в настоящее время актуально исследование названного фактора патогенности в штаммах Y. pseudotuberculosis, циркулирующих в России, а также его вклада в развитие патологического процесса при псевдотуберкулезе.
Целью работы явился поиск в штаммах Y. pseudotuberculosis цитотоксического некроти-зирующего фактора, выделение и идентификация этого белка, исследование вариабельности доменов гена cnfY, в том числе функционально значимого.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали 102 штамма Y pseudotuberculosis (коллекция ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН), выделенные от больных людей, мелких мышевидных грызунов,
рыб, из внешней среды в различных регионах России за период 1967-2008 гг. Бактерии выращивали на питательном агаре при температуре +37 оС в течение 20-24 ч. Белок выделяли из Y pseudotuberculosis (штамм 2517, III серовар, коллекция Института им. Л. Пастера, Франция), определяли его молекулярную массу [3].
Из окрашенного геля после электрофореза вырезали фрагмент, содержащий интересующий нас белок. Гель отмывали, высушивали на вакуумном концентраторе (Eppendorf 5301, Германия), добавляли раствор протеазы (трипсин) из расчета 1:100 и инкубировали 24 ч. Полученные в результате гидролиза белка пептиды экстрагировали из геля, смесь пептидов наносили на колонку с обращенной фазой, состыкованную с масс-спектрометром (LCQ Deca XP, Thermo Finnigan, Германия). Пептиды смывали градиентом ацетонитрила. Смываемые с колонки пептиды в автоматическом режиме поступали в масс-спектрометр для анализа методом тандемной масс-спектрометрии. В результате для каждого набора пептидов были получены величины их молекулярных масс и масс-спектры фрагментации ионов пептидов. Фрагментацию проводили столкновением с инертным газом (гелием). Данные анализировали с помощью поисковой программы Mascot (www.matrixscience.com).
Для амплификации и секвенирования фрагментов гена cnfY использовали две пары прай-меров: 5'-GCA-GGT-GGG-AGC-AAC-AAA-GAT (CnfF) и 5-CAG-GAG-CGA-ACA-ACT-AAA-TGG-AA (CnfR ), 5'-TGC-ATC-GTC-AAT-AAA-AGG-AGT-GTT (Cnf-1) и 5'-AAT-TTT-GGT-TTT-ACT-GGT-GGT-TCA (Cnf-2). Программы ПЦР - для 1-го фрагмента гена cnfY (функционально-значимого домена) [5] и для 2-го фрагмента гена cnfY [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Хроматографическое выделение CNF Y. pseudotuberculosis включало в себя несколько этапов. На первом этапе фракцию белков, полученную из лизата клеток Y. pseudotuberculosis, после высаливания 50 % сульфатом аммония наносили на колонку с DEAE-целлюлозой, уравновешенную 10 мМ Tris-HCI буфером, рН 7,3. При элюции в линейном градиенте NaCl (от 0,0 до 0,5 М) фракции CNF обнаруживали в диапазоне концентрации хлорида натрия от 0,2 до 0,5 М. Электрофоретическое исследование этих фракций выявило наличие более 20 белковых компонентов.
Второй этап очистки CNF проведен на колонке с анионитом Mono Q, уравновешенной
Рис. 1. Хроматографическое выделение белка CNF Y. pseudotuberculosis с помощью высокоэффективной гельфильтрации на колонке Superose 6. а - профиль элюции препарата; б - электро-фореграмма фракций элюируемого пика
Mascot Search Results:
Database: NCBInr 20110924 (15334873 sequences; 5258635425 residues)
Taxonomy: Bacteria (Eubacteria) (8877447 sequences) Protein hits: cytotoxic necrotizing factor [Yersinia pseudotuberculosis]
Mascot Score Histogram:
Ions score is -10*Log (P), where P is the probability that the observed match is a random event. Individual ions scores >58 indicate identity or extensive homology (p<0.05).
Protein scores are derived from ions scores as a non-probabilistic basis for ranking protein hits.
40-j ЗОН
-S20I
£ ЮН
о
I
я
250 500
Protein Score
750
Рис. 2. Результаты поиска по базе белковых последовательностей для масс-спектров фрагментации ионов пептидов
буфером 20 мМ Tris-HCI, pH 7,6. Элюируемый в середине линейного градиента NaCl (от 0,0 до 0,6 М) преобладающий пик содержал CNFY с примесью других белков. Окончательную очистку осуществляли на колонке Superose 6. Буфер содержал 20 мМ Tris-HCl, 0,1 М NaCl, pH 7,6. В результате высокоэффективной гельфильтрации элюируемый (в течение 80 минут) CNF вышел одним симметричным пиком c 34 по 45 минуту, а SDS-электрофорез выделенных фракций показал наличие 4-6 минорных белковых компонентов и одного мажорного белка молекулярной массой около 110-115 кДа (рис. 1). Таким образом, нами был получен препарат для дальнейшего исследования его методом тандемной масс-спектрометрии.
При идентификации мажорного белка установлено, что он является цитотоксическим не-кротизирующим фактором Y pseudotuberculosis молекулярной массой 114479 Да. Как показано на рис. 2, столбец с правой стороны гистограммы соответствует степени достоверности идентификации белка (Protein score), рассчитанной для данного эксперимента. Степень достоверности свидетельствует о полном соответствии искомого белка цитотоксическому некротизирующему фактору, белку из Y. pseudotuberculosis.
На рис. 3 представлена последовательность узнанного белка. Курсивом обозначены пептиды, идентифицированные методом масс-
спектрометрии. Для этих пептидов показано полное соответствие последовательностей, полученных из масс-спектрометрических экспериментов и последовательности белка.
В продолжение развития вопроса о CNF Y. pseudotuberculosis с помощью молекулярно-генетических методов исследованы штаммы, выделенные из разных источников и регионов Российской Федерации. Фрагмент гена, кодирующего функциональный домен изучаемого белка, амплифицирован в ПЦР, определена последова-
1 MKNQWQHQYF LSYSELVANF PSPEKWSDJT IKHKFSTTLP WFGWADPDNL 51 YFIRFTQSRS NNKSYTGWDH LGKYAIETLT LTQAAIVNIG SRFDIFDEAS 101 SXA6JYKTNN ADSFDETNEA KMLPSEYLYF LRDCDFSNLY NKALSDYWAE 151 NYEKFSTLLQ NYYISSAYYL YKDSAISKDE YEFSIDAIFN KKSKILRYYF 201 DVYGYYSSDM FVAMNDNKTM LFIPGATNPF IFADNITDLR DKIKilLISDK 251 NTRELFSKHF SLYDRQDGNT YLGVNSMLEQ IVSGWDTNY IMYSNKNIRE 301 RNVFGSMAFS TRERSFNDGD VTJJCSNAEVQ RDYALNVLQT ILSLSPIFDI 351 VLPEVSIPIS LGITASSVGI SFDELINGDT YEERRSAIPG LATNTVLLGI 401 SFAIPFLISK AEENKLIINN LVGSDENILN KNNLGDFLEK YNISESDIPE 451 NGSLVINLKW IWVPVRLVKL NDEEGEIVAI KGSTLSGIYY EVDTETGYEI 501 LSRRVFRTEY NEKIIWTRGG GLKGGQPFNF EGLDIPVYFI DKPYSELASS 551 VELSFVNDDS PLLFPEMDSR LPKPTPELDI KYYSSNLSSF KEDTVILMRG 601 ТТЕЕЕЯШ1А WYKTAGGSNK DLEENFIEAG PQFNLSFSEY TSSINSADTA 651 SRKHFLVIIK VQVKYISNDN VLYANHWAIP DEAPVEVLAV VDRRFIFPEP 701 PVKPKLSFIQ JCIANRFLTEN VAEISSINFR RLNSGNINVL KGRGVFSSRR 751 LREIYLRFDA ANADELRPGD VYVKKTKFDS MGYDSHFYNE GIGINGAPTL 801 NTYTGEYVAD SSSQGATYWL КYSLTNETSI IKVSNSARGA NGIKIALEEI 851 EENKPWITS GTLTGCTWF ARKGEYFYAV HTGNSESLIG FTSTSGVAKA 901 IEVLSSLSEL EVPALPDVIN NNTLVEYLSD NFDSALISYS SSSLKPNSMI 951 NISRENVSTF SYYTDDIQLP SFGTSVTILV RTNDNTWRS LSESYTMNSN 1001 SSXMWFNVL QKDF
Рис. 3. Последовательность cytotoxic necrotizing factor из Y. pseudotuberculosis. Курсивом выделены части последовательности, которые соответствуют полученным масс-спектрам фрагментации
тельность ампликона. Длина фрагмента гена cnfY составила 1041 пару нуклеотидов (п. н.).
При анализе последовательности гена cnfY у подавляющего большинства штаммов выявлена делеция фрагмента, кодирующего функциональный Rho-домен, вовлекаемый непосредственно в белок-белок взаимодействие с Rho GTF-зами. Сайт делеции размером 946 п.н. картирован. Полноразмерная копия гена cnfY была выявлена только у двух штаммов из всей коллекции. Первый штамм выделен на Дальнем Востоке Российской Федерации (Приморский край) из смыва с капусты, являющейся одним из основных факторов передачи Y. pseudotuberculosis при ДСЛ, второй -коллекционный.
Результаты исследования второго фрагмента гена cnfY в штаммах Y pseudotuberculosis, изолированных из разных источников, в том числе и от больных ДСЛ, показали, что большинство изоля-тов (97,6 % - больные, 84,6 % - окружающая среда, 100 % - грызуны) имели делецию размером 300 пар нуклеотидов в исследуемом участке гена. Размер фрагмента гена этой группы изолятов составил 1800 п. н. Полноразмерная копия данного участка гена cnfY (2100 п. н.) выявлена у небольшого числа штаммов (2,4 % - больные, 15,4 % -окружающая среда, 0 % - грызуны).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из Y. pseudotuberculosis c помощью ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, а также тандемной масс-спектрометрии выделен и идентифицирован цитотоксический некроти-зирующий фактор-белок молекулярной массой 114479 Дальтон.
При анализе последовательности cnfY гена Y. pseudotuberculosis, кодирующей функционально значимый Rho-домен в штаммах, изолированных от больных дальневосточной скарлатино-подобной лихорадкой людей, выявлена делеция фрагмента. Сайт делеции размером 931 п. н. картирован. Полноразмерная копия cnfY гена обнаружена только у двух из 30 исследованных штаммов.
У подавляющего числа исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружена делеция во втором фрагменте гена cnfY. Сайт делеции размером 300 п. н.
Полученные данные позволяют поставить вопрос о роли цитотоксического некротизирую-щего фактора в вирулентности возбудителя дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки,
клона Y. pseudotuberculosis, и в патогенезе этой новой клинико-эпидемической формы псевдотуберкулеза, в гене которого имеют место несколько делеций, в том числе в функционально значимой области. Несомненно, результаты дальнейших исследований в названных направлениях позволят ответить на эти важные вопросы, касающиеся возбудителя псевдотуберкулеза.
Авторы благодарят сотрудников Института белка РАН Нину Владимировну Котову и Виктора Викторовича Марченкова за оказанную помощь при проведении экспериментов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Знаменский В.А., Вишняков А.К. Этиология дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки // Журн. микробиол. 1967. (2). 125-130.
2. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатинопо-добная лихорадка. М.: Медицина, 1979. 183 с.
3. Тимченко Н.Ф., Ермолаева С.А., Адгамов Р.Р. и др. Возбудитель дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (псевдотуберкулеза человека) -клон Yersinia pseudotuberculosis // Мат. III Всерос. науч.-практич. конф. с междунар. участием. СПб., 2011. 109-110.
4. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток: Приморский по-лиграфкомбинат, 2004. 220 с.
5. Timchenko N.F., Adgamov R.R., Ermolaeva S.A. Variability in the functional domains of the Rho-modifying toxins of Yersinia pseudotuberculosis // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. 954. 261-266.
6. Blumenthal B., Hoffmann C., Aktories K. et al. The cytotoxic necrotizing factors from Yersinia pseudo-tuberculosis and from Escherichia coli bind to different cellular receptors but take the same route to the cyto-sol // Infect. Immun. 2007. 75. 3344-3353.
7. Hoffmann C., Pop M., Leemhuis J. et al. The Yersinia pseudotuberculosis cytotoxic necrotizing factor (CNFY) selectively activates RhoA // J. Biol. Chem. 2004.279. 16026-16032.
8. Knust Z., Schmidt G. Cytotoxic necrotizing factors (CNFs)-a growing toxin family // Toxins. 2010. 2. (1). 116-127.
9. Lockman H.A., Gillespie R.A., Baker B.D., Shakhnovich E. Yersinia pseudotuberculosis produces a cytotoxic necrotizing factor // Infect. Immun. 2002. 70. 2708-2714.
10. Worsham P.L., Mou S., Cote C.K., Fritz D. Virulence of Yersinia pseudotuberculosis in Aerosol Model // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. 954. 217-222.
CYTOTOXIC NECROTIZING FACTOR OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS, PATHOGEN OF FAR EASTERN SCARLET-LIKE FEVER
Elena Viktorovna PERSIYANOVA1, Ruslan Renatovich ADGAMOV2, Aleksey Konstantinovich SURIN3,4, Ekaterina Konstantinovna PSAREVA1, Svetlana Aleksandrovna ERMOLAEVA2, Nelly Fedorovna TIMCHENKO1
1 FSBI «RI for Epidemiology and Microbiology named after G.P. Somov» of SB RAMS 690087, Vladivostok, Selskaya str., 1
2 Institute of Epidemiology and Microbiology n.a. N.F. Gamaleya 123098, Moscow, Gamaleya str., 18
3 Institute of Protein Research RAS 142290, Pushchino, Institutskaya str., 4
4 State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology of Minzdrav of Russia 142279, Moscow reg., Serpukhov district, village Obolensk
The materials on isolation and purification of the cytotoxic necrotizing factor of Y. pseudotuberculosis, its identification by mass spectrometry, a molecular genetic characterization of two domains of its toxin gene, including functionally significant, in strains of bacteria isolated from patients, small rodents and the environment in the Russian Federation have been introduced in the article.
Key words: Yersinia pseudotuberculosis, strain, cytotoxic necrotizing factor, protein, gene.
Persiyanova E.V. - candidate of biological sciences, senior researcher of the laboratory of ecology ofpathogenic bacteria, e-mail: Helen-pers@yandex.ru
Adgamov R.R. - junior researcher of the laboratory of ecology ofpathogens, e-mail: bacter@yandex.ru Surin A.K. - candidate ofphysical- mathematical sciences, researcher of the laboratory ofprotein physics, e-mail: alexey_surin@mail.ru
Psareva E.K. - junior researcher of the laboratory molecular bases ofpathogenicity of bacteria, e-mail: katehok_84@mail.ru
Ermolaeva S.A. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory of ecology ofpathogens, e-mail: sveta@ermolaeva.msk.su
Timchenko N.F. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory molecular bases ofpathogenicity of bacteria, e-mail: ntimch@mail.ru
