CC BY
127
УДК 616.988.25-002.954.2:611-018.1:575.116.4
В. В. Новицкий, О. Б. Жукова, Н. В. Рязанцева, А. В. Лепехин, Н. П. Пирогова,
О. В. Михайлова, Н. Н. Плотникова, Н. В. Токарева, И. О. Наследникова, А. П. Хлапов
ЦИТОГЕНЕТИКА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ПЕРСИСТЕНЦИЕЙ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
Сибирский государственный медицинский университет М3 РФ, Томск
Проведено исследование хромосомного аппарата лимфоцитов периферической крови у 20 пациентов с бессимптомным носительством вируса клещевого энцефалита и 12 больных с хронической антигенемией с минимальными клиническими проявлениями заболевания, сохранявшимися в течение 12 мес. с момента инфицирования. Контрольную группу составили 17 здоровых доноров. Показано, что персистенция вируса клещевого энцефалита сопровождается цитогенетической нестабильностью лимфоцитарных клеток: обнаружено достоверное увеличение доли клеток со структурными хромосомными аберрациями (одиночные и парные фрагменты), снижение активности системы эксцизионной репарации ДНК.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, лимфоциты, хромосомные аберрации, ДНК-репарация
Персистирующие вирусные инфекции представляют собой актуальную проблему современной медико-биологической науки. В изучении патогенеза вирусной персистенции ключевое положение занимает вопрос о характере взаимодействия между вирусом и клеткой, так как исход инфекции, с одной стороны, определяется пермиссивностью клеточной системы, с другой -патогенностью штамма [5]. К настоящему времени установлено, что одним из механизмов ускользания вируса от действия защитных факторов организма является интеграция вирусного генома в геном пораженной клетки, что может привести к ее генетической нестабильности [3, 5, 11]. Нарушения функциональной активности систем контроля и поддержания генетического гомеостаза на клеточном и молекулярном уровнях вследствие повреждающего действия вирусного агента обусловливают высокий риск возникновения хромосомных аберраций и, как следствие,
развитие структурных и функциональных нарушений на различных уровнях организма [5, 14, 15].
К числу вирусов, способных к пролонгированному пребыванию в организме человека, относится РНК-содержащий вирус семейства Б1а-ушпёае - вирус клещевого энцефалита (КЭ), поражающий, кроме нервных, и иммунокомпетен-тные клетки, функциональная неполноценность которых может явиться причиной длительного поддержания вирусного персистирования [14, 15]. Современный
клинический патоморфоз КЭ с тенденцией к увеличению частоты стертых форм инфекции с хроническим течением и бессимптомного вирусоно-сительства обусловливает интерес исследователей к изучению цитогенетических последствий дли- тельного персистирования вируса КЭ в клетках иммунной системы. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение
характера хромосомных аберраций и состояния системы репарации ДНК в лимфоцитах периферической крови у пациентов - носителей вируса КЭ.
Методика. В исследование были включены 32 пациента с вирусом КЭ (13 мужчин, 19 женщин) в возрасте от 23 до 50 лет. Диагноз клещевого энцефалита верифицировали на основании данных эпидемиологического анамнеза, оценки неврологического статуса, определения уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита методами непрямой реакции гемагглютинации и иммуноферментного анализа, обнаружения вирусной РНК методом полимеразно-цепной реакции. В зависимости от особенностей клинических и лабораторных проявлений клещевой нейроинфекции была выделена группа из 20 пациентов с бессимптомным виру-соносительством (субклиническая форма клещевого энцефалита). У лиц, отнесенных к данной клинической категории, при отсутствии клинических симптомов в крови обнаруживалась вирусная РНК. Вторую группу составили 12 больных с хронической полиомиелитической формой клещевого энцефалита (непрогредиентное течение, стадия ремиссии). Основными проявлениями патологии были стойкий астеновегета-тивный синдром, упорные головные боли, бессонница, снижение памяти в течение 12 мес. после перенесенного острого клещевого энцефалита. Контрольную группу составили 17 практически здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл).
Приготовление препаратов для хромосомного анализа лимфоцитов проводили по методу P.S. Moorhead и др. [13]. Для этого 1 мл гепари-низированной крови (25 ЕД/мл) смешивали с 3 мл питательной среды, состоящей из 90% RPMI-1640 (“Sigma”, США), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 280 мг/мл L-глутамина, 5 мг/мл гентамицина с добавлением фитогемагглютинина (“Difco”, Германия) в концентрации 0,01 мг/мл культуральной среды. Культивирование лимфоцитов проводили в культуральных флаконах при 37°С в течение 52 ч. Для накопления клеток в стадии метафазы во флаконы с культурой лимфоцитов за 2 ч до окончания культивирования вводили по 0,25 мл 0,01% раствора колхицина (“Fluka”, Швейцария). Полученные препараты окрашивали раствором азур II-эозина в течение 10 мин. У каждого обследованного анализировали 100 метафазных пластинок. Учитывали число клеток с хромосомными нарушениями, количество и типы хромосомных аберраций в соответствии с классификацией [4].
Исследование активности эксцизионной репарационной системы ДНК лимфоцитарных клеток, индуцированной ультрафиолетовым облучением, проводили методом сцинтилляцион-ной радиометрии [6]. В каждом случае 50 мкл цельной гепаринизированной крови облучали в течение 15 с двумя ультрафиолетовыми лампами ДБ-15 при дозе и мощности излучения 15 Дж/м2 и 1,6 Дж/с/м2 соответственно. В качестве контроля использовали необлученную кровь. Пробы инкубировали в течение 2 ч при 37°С в культуральной питательной среде, содержащей 10 мкКю-ри/мл среды (3Н)-тимидина. Радиоактивность измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика Магк-3 (США). Об интенсивности репара-тивного синтеза ДНК судили по величине индекса стимуляции (ИС), представляющего собой отношение показателя радиоактивности (импульс/с) пробы после воздействия ультрафиолетовым светом к радиоактивности необлученных образцов.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью 1-критерия Стьюден-та и непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты. Многочисленными исследованиями показано, что возбудители вирусных инфекций, попадая в организм, приводят к разнообразным перестройкам хромосомного аппарата лимфоцитарных клеток: от структурных изменений одной или нескольких хромосом до изменения их числа. Так, при полиомиелите у детей в лимфоцитах периферической крови было выявлено значительное увеличение доли хрома-тидных разрывов [10], вирус простого герпеса индуцировал хроматидные и хромосомные разрывы [5]. Цитогенетические нарушения иммуно-компетентных клеток обнаруживались у больных корью [1], гриппом [7], а также вирусным гепатитом [11, 14]. При этом какой-либо корреляции между спектром аберраций хромосом и видом вируса установлено не было. Существенное увеличение числа цитогенетических аберраций в лимфоцитах периферической крови при вирусных инфекциях может быть обусловлено интеграцией нуклеотидных последова- тельностей генома вируса в геном клетки [14], повреждающим действием протеаз вирусов, клеточных лизосо-мальных нуклеаз, цистеин-протеиназ [2], а также интенсификацией процессов свободнорадикального окисления белков, липидов и нуклеиновых кислот [9].
В проведенном нами цитогенетическом анализе лимфоцитов периферической крови у пациентов с персистенцией вируса КЭ без явных клинических проявлений заболевания было установлено достоверное увеличение доли клеток со структурными аберрациями хромосомного аппарата (примечательно, что клетки с изменен-
ным количеством хромосом отсутствовали). Анализ спектра аберраций хромосом выявил, что цитогенетические нарушения хроматидного типа были представлены одиночными фрагментами, а хромосомного типа - парными фрагментами (табл.). Увеличение числа лимфоцитов с одиночными и парными фрагментами у асимп-томатических вирусоносителей и у хронических носителей вируса КЭ с минимальной клинической симптоматикой инфекции было статистически значимым по сравнению со средними значениями данных показателей у здоровых доноров. Однако достоверных различий спектра хромосомных аберраций между группами пациентов с различными клиническими формами КЭ обнаружено не было (табл.).
Подобные нарушения цитогенетического статуса иммунокомпетентных клеток могут быть связаны как с генотоксическим эффектом вируса КЭ, так и с недостаточной функциональной активностью систем поддержания генетического постоянства [7]. Как известно, целостность генома контролирует система ДНК-репарации, “выявляющая” и “исправляющая” ошибки, которые приводят к изменениям последовательности нуклеотидов в ДНК [6, 7].
Учитывая важную роль репарационной системы ДНК в поддержании стабильности цитогенетического гомеостаза клетки, нами была проведена оценка активности системы эксцизион-ной репарации ДНК лимфоцитов периферической крови у больных с персистенцией вируса КЭ. Было выявлено достоверное снижение средних значений ИС как у пациентов с бессимптом-
Уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периф с персистенцией вируса клещевого энцефалита (M±m)
ной хронической антигенемией (1,25±0,09 у. е.; р<0,01), так и у хронических вирусоносителей с клиническими проявлениями КЭ (1,32±0,17 у. е.; р<0,05) по сравнению со средними значениями данного показателя, зарегистрированного у здоровых доноров (1,91± 0,15 у. е.). Вероятно, снижение активности ДНК репарационной системы при пролонгированной персистенции вируса КЭ может обусловливать повышенный уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови. Подобные нарушения цитогенетического статуса иммунокомпетентных клеток могут явиться причиной их функциональных изменений [7, 8, 14, 15]. Вместе с тем наличие нерепарируемых повреждений ДНК вызывает усиление экспрессии гена р53, который индуцирует процесс апоптоза [12], что закономерно приводит к элиминации вирусинфицированных клеток. Усиление апоптотической гибели и функциональная неполноценность иммунокомпе-тентных клеток могут явиться причиной неадекватности иммунного ответа организма, что, не исключено, и является одним из факторов, способствующим длительной персистенции вируса КЭ.
Заключение. Таким образом, полученные нами данные показывают, что, несмотря на отсутствие явной клинической симптоматики инфекционного процесса, персистенция вируса клещевого энцефалита сопровождается цитогенетической нестабильностью лимфоцитарных клеток, регистрируемой как на молекулярном (ДНК-репарационный анализ), так и на клеточном (хромосомный анализ) уровнях.
Таблица
1еской крови у пациентов
Показатели Характеристика групп обследованных лиц
Здоровые доноры Пациенты с бессимптомным вирусоносительством клещевого энцефалита Хронические вирусоносители клещевого энцефалита с клиническими проявлениями заболевания
Доля аберрантных клеток, % 1,28±0,35 2,86±0,34** 3,13±0,40**
Количество аберраций хроматидного типа, % 0,66±0,19 1,42±0,30* 1,75±0,37**
в том числе: одиночные фрагменты 0,66±0,19 1,42±0,30* 1,75±0,37**
изохроматидные обмены Не обнаружены Не обнаружены Не обнаружены
Количество аберраций хромосомного типа, % 0,65±0,20 1,43±0,48* 1,50±0,38*
в том числе: парные фрагменты 0,65±0,20 1,29±0,26* 1,24±0,22*
кольцевые хромосомы Не обнаружены не обнаружены Единичные
дицентрические хромосомы Не обнаружены Единичные Единичные
Примечание. * - р<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; статистически значимых отличий между изучаемыми показателями у пациентов с бессимптомным вирусоноси-тельством и у хронических вирусоносителей клещевого энцефалита с клиническими проявлениями заболевания выявлено не было.
CYTOGENETICS OF PERIPHERAL BLOOD LYMP- HOCYTES IN PATIENTS WITH PERSISTENCE BY TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS
V.V. Novitsky, O.B. Zhukova, N.V. Ryazantseva,
A.V. Lepekhin, N.P. Pirogova, O.V. Mikhaylova,
N.N. Plotnikova, N.V. Tokareva, I.O. Naslednikova,
A.P. Hlapov
A research of the chromosomal apparatus of peripheral blood lymphocytes in 20 patients with asymptomatic carrier state of tick-borne encephalitis virus and 12 patients with minimal clinical symptoms being kept during 12 months was carried out. 17 normal donors composed the control group. It has been shown that the tick-borne encephalitis virus persistence is followed with changes in cytogenetic indices of lymphocytes. A statistically significant increase in percentage of structural chromosome aberrations (single and double fragments), reduction of the excision DNA-repair activity was revealed.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авакова А.Н., Рапопорт Р.И. //Цитология. 1971. Т. 13. №7. С. 830-836.
2. Айзензон М.Г., Александров Ю.Н., Бужиевская Т.И. Мутагенное действие природных и синтетических полинуклеотидов. Киев, 1990.
3. Антонов П.В., Цинзерлинг В.А. // Архив патологии. 2001. Т. 63. № 1. С. 47-51.
4. Бочков Н.П., Кулешов Н.П., Журков В.С. // Цитология. 1972. Т. 14. № 10. С. 1267-1273.
5. Букринская А.Г., Жданов В.М. Молекулярные основы патогенности вирусов. М., 1991.
6. Засухина Г.Д. Репаративные механизмы клеток и проблемы окружающей среды. М., 1979.
7. Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н., Ильинских И.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск, 1992.
8. Исаева М.Л., Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б. // Вопросы вирусологии. 1998. Т. 43. №4. С. 182-186.
9. Маеда X., Акаике Т. // Биохимия. 1998. Т. 63. № 7. С. 854-865.
10. Bhatnagar A., Rani R., Ghosh P. // Mutat. Res. 1984. Vol. 141. №1. P. 55-58.
11. Jablonska M. // Cas. Lek. Cesk. 1997. Vol. 136. № 20. P. 619-623.
12. Jayaraman J., Prives C. // Cell. 1995. Vol. 81. № 7. P. 1021-1029.
13. Moorhead P.S., Nowell P.S., Mellman W.J. //Exp. Cell. Res. 1960. №20. P. 613-618.
14. Sakakura C., Hagiwara A., Taniguchi H. et al. // Brit. J. Cancer. 1999. Vol. 80. № 12. P. 2034-2039.
15. Uehara T., Miyawaki T., Ohta K. // Blood. 1992. Vol. 80. № 2. P. 452-458.
