CC BY
84
weak agglutinagenic strain B. abortus 82, yearly, during the 3-year booster vaccination of cattle inagglutinogenic strain B. abortus R-1096 and control the immune response in revaccinated animals using R-antigen ARVI in CFT.
УДК 663.053:616.013(018) ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЛИНИИ
LEK
Хазиев Л.Р. - аспирант ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань, E-mail: [email protected]
Ключевыеслова: культура клеток, сыворотка, кариология.
Key words: cell culture, serum, karyology.
Введение. Клеточные культуры играют важную роль в биотехнологии при производстве вакцин и биологически активных веществ (Л.П. Дьяконов 2009). Концентрация, общее количество и доля жизнеспособных клеток являются необходимыми и важными характеристиками клеточного пула. Современные исследования и биологические производства требуют, чтобы и концентрация, и процент живых клеток были определены с максимальной точностью. Только оптимальная посевная концентрация позволит получить качественную культуру к заданному сроку. Изменения общего количества клеток и их жизнеспособности в процессе тестирования препаратов на токсичность и противовирусную активность invitro являются основными определяющими параметрами, но кроме них решающее значение имеет общая морфология клеток и их индекс пролиферации, а также стерильность культуры клеток от каких-либо микроорганизмов, в том числе микоплазм и вирусов. В этой связи в специализированных лабораториях, имеющих коллекции или криобанки клеточных культур, следует проводить регулярный контроль их видовой принадлежности. С этой целью широко используют методы цитогенетическнх исследований, которые позволяют контролировать генетическое постоянство клеток по набору и характеристике хромосом. Известно, что такие факторы культивирования, как нестандартность питательных сред и сывороток, вирусы и микоплазмы, могут явиться причиной дестабилизации различных клеточных характеристик, в том числе и кариологических. На сегодняшний день в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГБУ «ФЦТРББ-ВНИВИ» одной из наиболее часто используемых и востребуемых клеточных культур В работе является перевиваемая линия клеток LEK (происхождение: крупный рогатый скот, легкие эмбриона). В криобанке ФГБУ «ФЦТРББ-ВНИВИ» хранятся образцы данной линии разных годов заморозки, начиная с 1982 года.
Цель исследования. Установление стерильности, морфологии, пролиферативной активности и определение кариологических характеристик перевиваемой линии культуры клеток LEK, хранящейся в криобанке в лаборатории культуры клеток и гибридомной технологии более 25 лет.
Материалы и методы. Контроль на стерильность исследуемой культуры клеток проводился путем высева клеточной суспензии на МПА, МПБ, среды Сабуро, Чапека, Китта-Тарроци, ТПС-агар и ТПС - бульон. Для изучения общей морфологии и кариологии клеточной культуры LEK использовался микроскоп NikonType 120. Клетки LEK культивировали на стекле по общепринятой методике (Р. Адамс, 1983) в стандартных условиях монослойно с посевной концентрацией 40-80 тыс.кл/мл в термостате при температуре 370 С на 0,5% ГЛА с 10%-м содержанием сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, антибиотиками и глутамином. Подсчет клеток, для установления индекса их пролиферации, проводился трижды в камере Горяева. После восстановления морфологических параметров культур проводили кариологические исследования хромосомных пластинок с использованием 0,1%-ного колхицина по методу Мурхеда (1960). В ходе работы было подсчитано 1000 метафазных пластинок.
Результаты исследований. В результате проведенных исследований на выше перечисленных бактериальных средах было установлено, что культура клеток LEK оказалась стерильной. После образования монослоя под микроскопом просматривались клетки эллипсоидной формы с прозрачной цитоплазмой, без включений и зернистости. Индекс пролиферации клеток варьировал от 5,55 до 6,01. Для улучшения роста клеток сухой гидролизат лактальбумина подвергался гамма облучению в дозе 1 млн. рентген. В результате подсчета 1000 метафазных пластинок установлено, что модальное число хромосом равно 40, а пределы изменчивости по числу хромосом 55-58. Одна из метафазных пластинок культуры клеток LEK представлена на рис.1
1. Метафазная пластинка культуры клеток LEK
Полученные данные покариологической характеристике перевиваемой линии клеток LEK несколько не соответствуют требованиям, указанным в каталоге Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П), (СХЖ РАСХН), откуда
предположительно в свое время была получена данная культура.
Заключение. Изменения в кариотипе перевиваемой линии клеток LEK возможно объяснить либо неправильными условиями криоконсервации, длительным культивированием, качеством сыворотки, зависящем от источника получения и концентрации в среде, а так же частой сменой и нестандартностью питательных сред. Результаты проведенных исследований легли в основу разработанных нами лабораторных регламентов по использованию культур клеток LEK для вирусологических и диагностических целей.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для
биохимиков/ Р. Адамс - М.:Мир. 1983.-264 с. 2. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии)/ Под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова - М.: Компания Спутник+. -2000. - 400 с. 3. Методы культивирования клеток /Под ред.: Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. - СПб: Издательство Политехн. ун-та.-2008.-278с. 4 Методы культуры клеток для биохимиков / R. Adams. - М.: Изд. «Мир», 1983 - 313 с. 5. Сборник материалов научная программа тезисы / VII Международная конференция «Молекулярная медицина и безопасность» / Плотникова А.М., Хамзина Е.Ю., Кириллова Ю.М., Хусаенов Р.Х. - М. -2010, С.146-147,196.
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЛИНИИ LEK
Хазиев Л. Р.
Резюме
Изучено влияние криоконсервации на биологические свойства культуры клеток LEK. Установлено, что длительная криоконсервация влияет на еецитогенетические свойства.
CYTOGENETICANALYSISOF CULTURE OF CELLS OF THE LEK LINE
Khaziev L.R.
Summary
The effects of cryopreservation on biological properties of cell cultures were studied.It is established that the long cryopreservation influences its cytogenetic properties.
