CC BY
90
точным типам.
В настоящий момент ведутся исследования по нейротрансплантации этих клеток. Так в экспериментах применение стволовых клеток пуповинной крови трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза продлевала их жизнь по сравнению с контрольной группой. Было показано, что введенные внутривенно клетки пуповинной крови мигрировали преимущественно в места дегенерации нервной ткани. При моделировании инсульта у крыс трансплантация пуповинной крови уменьшала клинические проявления ишемии мозга.
Проведено научно-клиническое исследование на 22 пациентах с различными нейродегенеративными заболеваниями (рассеянный склероз 5 человек, боковой амиотрофический склероз 4 человека, аутоиммунные заболевания 8 пациентов, ишемический инсульт 2 больных, травмы головного мозга 3 человека). Пациенты получали лечение клеточной терапией из регистра доноров пуповинной крови после безуспешного стандартного лечения, подписав информированное согласие. Клеточная терапия производилась в рамках исследования за счет средств Покровского банка стволовых клеток.
Таким образом, вместе с появлением доказательных экспериментов по эффективности трансплантации клеток пуповинной крови животным с фенотипом нейродегенеративных заболеваний человека становится очевидным, что применение стволовых клеток пуповинной крови является одним из главных и приоритетных направлений клеточной терапии. В пилотной группе пациентов это было доказано клинически.
Трофимова И.Л., Шунькина К. В., Смолянинов А.Б.
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет, НИЛ клеточных технологий Северо-Западного государственного медицинского университета имени И.И. Мечникова, OOO «Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург, Россия, [email protected]
Изучению стабильности генома мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека уделяется все больше внимания в связи с активным развитием клеточных технологий и перспектив их применения в медицине. При увеличении объема клеточной массы МСК в ходе культивирования возможно появление клеток с возникшими de novo нарушениями хромосомного набора, дающие впоследствии аномальные клеточные линии. Изменение количества генетического материала может привести к неправильному функционированию генома, что оказывает крайне негативное влияние на клетку, вплоть до ее опухолевой трансформации.
Среди аномалий кариотипа МСК обнаруживают как изменения структуры, так и числа хромосом, а в ряде случаев и сочетанные аномалии, при которых идентифицируют как анеуплоидный хромосомный набор, так и структурно перестроенные хромосомы. Применение в терапии клеточных линий с аномальным кариотипом недопустимо.
В связи с этим, в цитогенетической лаборатории Покровского банка стволовых клеток проводится анализ кариотипа МСК на промежуточных пассажах и перед трансплантацией клеток пациенту. Было проведено кариотипирование 13 культур МСК костного мозга (МСККМ) с 2 по 4 пассажи и 9 культур МСК, выделенных из жировой ткани (МСКЖТ) с 3 по 14 пассажи. Препараты мета-фазных хромосом готовили согласно стандартным протоколам. Колхициниза-цию проводили в течение 3-6 ч. (в зависимости от культуры клеток), клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора трипсин-версена, проводили гипотонию 0,55 % KCl. Клетки фиксировали с использованием трех смен фиксатора (этиловый спирт: ледяная уксусная кислота, в соотношении 3:1). Суспензию клеток раскапывали на мокрые охлажденные стекла с высоты 30-50 см. Фиксатор поджигали либо стекла просто высушивали на воздухе. После дифференциального окрашивания (QFH/ AcD или GTG) препаратов метафазных хромосом, анализировали от 6 - 20 метафаз для каждой культуры. Различия в количестве проанализированных метафазных пластинок связано с митотическим потенциалом исследованных культур.
В результате цитогенетического анализа культур МСККМ, проведенного после каждого пассажа, начиная со 2-го, изменений структуры и количества хромосом выявлено не было. При кариотипировании культур МСКЖТ в двух случаях на 4 и 14 пассажах обнаружен абберантный кариотип, представленный сочетанными аномалиями (числа и структуры хромосом) и структурными изменениями. Кариотипы культур: 46,ХХ [5] / 47,ХХ, del5 (q21-qter), +5 (q21;q35) [1] и 46,XY [18] / 46,XY, der21(?), derY(?) [2] / 46, XY, t (3;8) (p 25; q12), der12 (?)[1] соответственно. Возникновение аномалий кариотипа в культурах МСК является серьезным препятствием для их применения в медицине из высокого риска появления нежелательных побочных эффектов.
Появление клеточных клонов с аномальным кариотипом может обуславливаться рядом причин такими как, биологические особенности культуры, методы культивирования (энзиматическое пассирование) или индивидуальные особенности доноров (прием лекарственных препаратов или перенесенное инфекционное заболевание перед пункцией), а также техническими моментами во время приготовления препаратов. Однако наши данные не позволяют предсказать возможности появления клонов клеток с числовыми и/или структурными абберациями хромосом при культивировании. Поэтому мы считаем целесообразным проведение цитогенетического анализа на каждом из пассажей, с целью исключения нарушения кариотипа и обеспечения безопасной трансплантации.
