CC BY
85
УДК 57.045+574.2:576.356
Д. А. Петрашова, Н. К. Белишева
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ НЕЙТРОННОЙ КОМПОНЕНТЫ КОСМИЧЕСКИХ ЛУЧЕЙ В КЛЕТКАХ МЕРИСТЕМЫ ALLIUM CEPA
Аннотация
Показано, что при инкубации биологических объектов (Allium cepa L.) в специальной борированной камере с парафиновым покрытием, поглощающем нейтронную компоненту вторичных космических лучей (КЛ) с энергиями < 50 Мэв, в меристеме проростков выявляются специфические цитогенетические эффекты. Наблюдается снижение скорости пролиферации клеток, возрастание частоты встречаемости мостов в анафазе и телофазе, микроядер в клетке, а также появление агглютинации хромосом и двуядерных клеток.
Ключевые слова:
нейтронная компонента космических лучей, нейтроны, экранирование, Allium-test, патологии митоза, микроядра, митотический индекс.
D. A. Petrashova, N. K. Belisheva
THE CYTOGENETIC EFFECTS OF THE COSMIC RAYS HIGH-ENERGY NEUTRON COMPONENT IN THE ALLIUM CEPA MERISTEMATIC CELLS
Abstract
We showed the specific cytogenetic effects in the Allium cepa meristem cells to be detected when incubating in the special borated paraffinic device absorbing of the cosmic rays neutron component with energy < 50 МeV. The cell proliferation speed decreasing, anaphase and telophase bridges frequency increasing, micronucleus frequency increasing, chromosome agglutination and binucleus cells appearance are observed.
Key words:
cosmic rays neutron component, neutrons, shielding, Allium-test, mitosis pathology, micronucleus, mitotic index.
Введение
Космические полеты, а также тщательно подготавливаемая миссия на Марс требуют знания о возможных последствиях воздействия высокоэнергетических частиц на организм космонавтов [1-3]. Представление о возможных эффектах заряженных частиц на биологические объекты были получены в результате космических [1, 3] и наземных экспериментов [4-6].
Вместе с тем, наземные эксперименты, в которых изучают эффекты моноэнергетических потоков тяжелых заряженных частиц [5] или тепловых нейтронов [7], не дают полного представления о возможных последствиях воздействия на организм космонавта потока солнечных космических или галактических космических лучей (СКЛ и ГКЛ соответственно), энергетический спектр и плотность потока которых варьируют в зависимости от характера солнечной активности (СА). Кроме того, на организм космонавта воздействуют вторичные компоненты КЛ, образующиеся в результате взаимодействия заряженных частиц с веществом корабля. Причем основной поток вторичных биоэффективных частиц внутри космического корабля представлен в основном нейтронами разных энергий [1, 2].
41
В силу того что в контролируемом эксперименте на ускорителях очень сложно получить потоки нейтронов с энергетическими спектрами, близкими к естественным фоновым воздействиям вторичных космических лучей (КЛ), генотоксичность вторичных нейтронов у поверхности практически не изучена. Только в отдельных исследованиях была показана биоэффективность нейтронной компоненты вторичных СКЛ у поверхности Земли в период солнечных протонных событий в октябре 1989 г. [6, 8], а также при фоновых вариациях ГКЛ [9].
С нашей точки зрения, именно наземные эксперименты по изучению биоэффективности нейтронной компоненты вторичных КЛ могут приблизить к пониманию того, какие последствия для организма космонавтов могут вызывать вторичные нейтроны в жизненном пространстве космического корабля. Особенно важно выявить эффекты полного спектра нейтронного потока и отдельных его спектральных составляющих, что позволит экранировать организм космонавта от наиболее биоэффективных компонент нейтронного спектра.
Для выявления вклада нейтронной компоненты с высокими энергиями (способных вступать в ядерные взаимодействия с веществом) в индукцию генетических нарушений у различных биологических объектов при фоновых вариациях КЛ, мы использовали специальную камеру, экранирующую биологические объекты от воздействия нейтронов с энергиями < 50 Мэв. Эта камера была создана сотрудниками Полярного геофизического института КНЦ РАН Ю. В. Балабиным и Е. А. Маурчевым, которые рассчитали параметры парафинового экрана на основе программы, позволяющей моделировать прохождение частиц через вещество [10-12]. Сравнение частоты и характера цитогенетических нарушений в исследуемых объектах при фоновом воздействии КЛ у поверхности Земли и в условиях экранирования позволит понять роль КЛ в функционировании биосистем и возможные эффекты КЛ в период космических миссий.
Материалы и методы
Экспозиция биологических объектов к высокоэнергетической нейтронной компоненте вторичных КЛ проводилась в специальной конструкции (рис.1А), состоящей из парафина с борированной внутренней камерой для инкубации, маркированной стрелкой на рис.1Б. Толщина парафинового слоя рассчитана таким образом, чтобы все нейтроны с энергией до 50 МэВ поглощались экраном.
В качестве объекта исследования был выбран лук репчатый (Allium cepa L.), который рекомендован экспертами Всемирной организации здравоохранения как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды. Цитогенетические нарушения в клетках этого объекта при тестировании степени генотоксичности воздействий хорошо коррелируют при сходных воздействиях с цитогенетическими нарушениями в клетках млекопитающих и человека [13, 14].
Эксперимент включал три этапа исследований. Первый этап - анализ динамики возможных нарушений митоза и ядерной структуры в клетках меристемы (20-25.04.2015). Второй этап - определение всхожести семян и интенсивности роста проростков (26.04-6.05.2015). Третий этап - оценка уровня возможных нарушений митоза и ядерной структуры в клетках меристемы
42
после недельной экспозиции в парафиновой камере. Этот этап являлся продолжением 2-го этапа.
Для исследований в рамках 1-го этапа семена A. cepa помещали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу и проращивали при температуре +24оС до появления корешков размером 0.2-0.5 см. Затем чашки Петри с семенами помещали в холодильник для синхронизации митотических циклов в проростках. После этого семена с одинаковыми по размеру проростками помещали в другие чашки Петри рядами по 10 семян. Всего было подготовлено таким образом шесть чашек, три из которых были помещены в парафиновую камеру, а три - в контейнер из папье-маше в качестве контроля. Для фиксации (5 фиксаций в опыте и контроле) отбирали по 10 корешков через каждые 18 ч в соответствии со стандартной методикой (это время соответствует периоду митотического цикла у A. cepa).
Рис.1. Конструкция для инкубации биологических объектов в условиях воздействия высокоэнергетической нейтронной компоненты вторичных космических лучей
Для второго этапа исследований семена A. cepa помещали в 6 чашек Петри (по 100 шт. на чашку), из которых три предназначались для инкубации в парафиновой камере, а три - в контейнере из папье-маше в качестве контроля. Ежедневно семена проверяли на прорастание. Когда появились первые проростки, их замеряли с использованием циркуля и линейки. Все данные вносили в таблицы.
После завершения замеров образцы корешков фиксировали по стандартной методике. Окрашивание корешков проводили 1 %-м ацетоорсеином при температуре 85 оС в термостате 15 мин, оставляли на сутки в свежем красителе при температуре 4 оС. Давленные препараты меристемы A. cepa готовили в капле 45 %-й уксусной кислоты [15]. На препарате каждого корешка подсчитывали не менее 1000 клеток, учитывая все стадии митоза (интерфаза, профаза, метафаза, анафаза, телофаза), на основании чего вычисляли митотический индекс (МИ), а также оценивали все видимые нарушения митоза и ядерной структуры. Для каждой фиксации анализировали не менее трех препаратов.
43
Рис.2. Показатели скорости пролиферации A. cepa в экранированной камере (в условиях воздействия нейтронов с энергиями > 50 Мэв) и в контроле
Результаты и обсуждение
Установлено, что всхожесть семян, длина проростков и митотический индекс в контроле был достоверно выше, чем в камере инкубации в условиях воздействия нейтронов с энергиями > 50 Мэв (рис.2).
При исследовании патологии митоза и ядра были выделены три условные группы нарушений: мосты в анафазе и телофазе, агглютинация хромосом и прочие патологии митоза (фрагменты хромосом в метафазе, отставание хромосом в анафазе и телофазе, моноцентрический и многополюсной митозы). Примеры патологий митоза приведены на рис.3.
44
Рис.3. Патологии митоза в меристеме проростков A. cepa при инкубации в парафиновой камере: 1, 2, 4а - мосты в анафазе; 3 - мост в телофазе;
5, 6 - агглютинация хромосом; 7б, 8, 9 - микроядра в клетке; 4б - отставание хромосомы в анафазе; 7а - хромосома в интерфазе; 10 - монополюсной митоз; 11 - двуядерная клетка; 12 - ядерная почка
45
Анализ препаратов показал, что число нарушений митоза в контроле не превышало 5 % от общего числа метафаз, анафаз и телофаз (МАТ), а при экранировании низкоэнергетической нейтронной компоненты - 12%. Из
нарушений митотического деления клеток преобладали в обеих группах мосты в анафазе и телофазе, причем в корешках, проросших в парафиновой камере, эта патология встречалась чаще (рис.3, 4). Образование мостов может быть связано с наличием в кариотипе дицентрической хромосомы или со слипанием теломерных участков хромосом [16].
Рис.4. Доля нарушений митоза в виде мостов на стадии анафазы и телофазы в меристеме проростков A. cepa при инкубации в парафиновой камере
и в контроле
В корешках A. cepa при инкубации в парафиновой камере, в отличие от контроля, встречается агглютинация хромосом. Эта патология возникает в результате слипания хроматина в метафазе или анафазе.
Основной по встречаемости патологией ядра являлось наличие в клетках микроядер (рис.3). Судя по графику на рис.5, динамика возникновения микроядер носит цикличный характер, по-видимому, в контрольной группе период этого цикла более растянут. Однако данное предположение требует дополнительного изучения. В целом, наличие микроядер свидетельствует о значительном числе нерепарированных повреждений хромосомного материала, что ведет к цитогенетической нестабильности клеточных популяций [17].
При инкубации в парафиновой камере возникали нарушения, связанные с запаздыванием цитокинеза, такие как образования двуядерных клеток (рис.3). Двуядерные клетки образуются в результате нарушения процесса образования внутри родительской клетки клеточной перегородки - фрагмопласта [18]. В контрольной группе данная патология в текущем эксперименте не выявлена.
46
Рис.5. Доля клеток с микроядрами в меристеме проростков A. cepa при инкубации в парафиновой камере и в контроле
Заключение
Таким образом, при инкубации в парафиновой камере проростков A. cepa в условиях воздействия высокоэнергетической нейтронной компоненты КЛ с энергиями > 50 Мэв наблюдается снижение скорости пролиферации клеток, возрастает частота встречаемости мостов в анафазе и телофазе и микроядер в клетке, появляются такие патологии, как агглютинация хромосом и двуядерные клетки. Такие летальные для клетки патологии, как агглютинация, наряду с запаздыванием цитокинеза, могут быть специфическими показателями биоэффективности высокоэнергетической нейтронной компоненты КЛ. Однако чтобы подтвердить достоверность выявленных цитогенетических эффектов, необходимо повторить данный эксперимент еще в нескольких повторностях и желательно с привлечением дополнительных растительных тест-объектов, например, использовавшегося в других наших работах маша (Vigna radiata) [19].
В целом наши исследования могут внести свой вклад в понимание процессов взаимодействия вторичных заряженных частиц с генетическим материалом клетки во время космического полета и оценить дозу, приводящую к необратимым генетическим повреждениям.
Литература
1. Акоев И. Г., Сакович В. А., Юров С. С. Биофизические основы действия космической радиации и ускорителей // Проблемы космической биологии. Л.: Наука, 1989. Т. 60. С. 232-248.
2. Space radiation measurements on board ISS THE DOSMAP EXPERIMENT / G. Reitz, R. Beaujean, E. Benton, S. Burmeister, Ts. Dachev, S. Deme, Luszik-M. Bhadra, P. Olko // Radiation Protection Dosimetry. 2005. Vol. 116, No. 1-4. Р. 374-379.
47
3. Шафиркин А. В., Григорьев Ю. Г. Межпланетные и орбитальные космические полеты. Радиационный риск для космонавтов (радиобиологическое обоснование) / Гос. научный центр РФ - Институт медико-биологических проблем РАН; ФГУ «Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна». М.: Экономика, 2009. 639 с.
4. Goodhead D. T. Enegy deposition stochastics and track structure: what about the target? // Radiation Protection Dosimetry. 2006. Vol. 122, No. 1-4. P. 3-15, doi:10.1093/rpd/ncl498.
5. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion / B. Jakob, J. Splinter, M. Durante, G. Taucher-Scholz // PNAS. 2009. Vol. 106, No. 9. P. 3172-3177.
6. The effect of cosmic rays on biological systems - an investigation during GLE events / N. K. Belisheva, H. Lammer, H. K. Biernat, E.V. Vashenuyk // Astrophys. Space Sci. Trans. 2012. 8. P. 7-17.
7. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells / K. Okumura, Y. Kinashi, Y. Kubota, E. Kitajima, R. Okayasu, K. Ono, S. Takanashi // Journal of Radiation Research. 2013. 54. P. 70-75.
8. Belisheva N. K. Biological effectiveness of cosmic rays near the Earth surface //
Космические факторы эволюции биосферы и геосферы: сб. статей
Междисциплинарного коллоквиума (Москва, 21-23 мая 2014 г.). СПб.: Астрономическое общество, 2014. С. 187-202.
9. Связь динамики слияния клеток, растущих in vitro, с вариациями интенсивности нейтронов у поверхности земли / Н. К. Белишева, Б. М. Кужевский, Э. В. Вашенюк, В. К. Жиров // ДАН. 2005. Т. 402, № 6.
С. 254-257.
10. Fine structure of neutron multiplicity on neutron monitors / Yu. V. Balabin,
B. B. Gvozdevsk, E. A. Maurchev, E. V. Vashenyuk, D. D. Dzhappuev / Astrophys. Space Sci. Trans. 2011. 7. P. 283-286.
11. Transport of solar protons through the atmosphere during GLE / E. A. Maurchev, Yu. V. Balabin, E. V. Vashenyuk, B. B. Gvozdevsky // J. Phys. Conf. Ser. 2013. 409 012200, doi: 10.1088/1742-6596/409/1/012200.
12. A new numerical model for investigating cosmic rays in the Earth’s atmosphere /
E. A. Maurchev, Yu. V. Balabin, B. B. Gvozdevsky, E. V. Vashenyuk // Bulletin of the Russian Academy of Sciences. Physics. 2015. Vol. 79, Issue 5. P. 657-659.
13. Barberrio A., Voltolini J. C., Mello M. L. S. Standardization of bulb and root sample sizes for the Allium test // Ecotoxicology. 2011. Vol. 20. P. 927-935.
14. Fiskesjo G. The Allium test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. 1985. Vol. 102. Р. 99-112.
15. Медведева М. Ю., Болсуновский А. Я., Зотина Т. А. Цитогенетические нарушения у водного растения Elodea canadensis в зоне техногенного загрязнения р. Енисей // Сибирский экологический журнал. 2014. № 4.
C. 561-572.
16. Горячкина О. В., Сизых О. А. Цитогенетические реакции хвойных растений в антропогенно-нарушенных районах г. Красноярска и его районах // Хвойные бореальной зоны. 2012. ХХХ. № 1-2. С. 46-51.
48
17. Цитогенетические реакции семенного потомства на комбинированное антропогенное загрязнение в районе Новолипецкого металлугрического комбината / О. С. Машкина, В. Н. Калаев, Л. С. Мурая, Е. С. Лепикова // Экологическая генетика. 2009. 8 (3). С. 17-29.
18. Малецкий С. И., Колодяжная Я. С. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток и ее влияние на репродуктивные признаки у покрытосеменных растений // Успехи современной биологии. 1999. Т. 119, № 2.С. 128-143.
19. Петрашова Д. А., Белишева Н. К., Мельник Н. А. Оценка генотоксичности природного ионизирующего излучения в клетках Vigna radiata // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2012. Т. 14, № 5(3).
С. 829-831.
Сведения об авторах
Петрашова Дина Александровна,
к.биол.н., научный сотрудник Научного отдела медико-биологических проблем
адаптации человека в Арктике КНЦ РАН, г. Апатиты, [email protected]
Белишева Наталья Константиновна,
д.биол.н., заведующий Научным отделом медико-биологических проблем адаптации
человека в Арктике КНЦ РАН, г. Апатиты, [email protected]
49
