CC BY
57
Вестник Челябинского государственного университета. 2014. № 4 (333). Образование и здравоохранение. Вып. 3. С. 44-48.
УдК 612.12:616-008 ББК 28.7:53.6
церулоплазмин и ряд биологически активных субстратов при аутотрансфузии ультрафиолетом облучённой крови спортсменов
Е. В. Елисеев, Е. Г. Кокорева, М. В. Трегубова
ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет», Челябинск, Россия
Определяя механизмы положительного действия аутотрансфузий крови, облучённой ультрафиолетовыми лучами, авторы предлагают рассматривать увеличение активности церулоплазмина как помехоустойчивую реакцию системы крови на возрастающее действие ультрафиолетового излучения.
Ключевые слова: церулоплазмин, супероксиддисмутаза, перекисное окисление липидов, антира-дикальная защита системы крови, помехоустойчивость, АУФОК.
При действии ультрафиолетовых лучей (УФЛ) в биологических системах усиливается образование токсических интермедиатов одноэлектронного восстановления кислорода, обладающих способностью инициировать и поддерживать реакции неконтролируемого перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Ферментная система, инактивирующая свободные радикалы кислорода и тем самым ингибирующая ПОЛ, представлена в клетках (в том числе и в клетках крови) супероксиддисмута-зой (СОД) (КФ.1.15.1.1). Фермент осуществляет дисмутацию супероксидных анионов кислорода в Н2О2 и триплетный кислород. В исследованиях [1] СОД-активность обнаружена и в плазме крови, где её связывают, в частности, с медьсодержащей оксидазой — церулоплазмином (ЦП) (КФ.1.16.3.1). Авторы этой работы предполагают участие этого фермента в детоксикации суперок-сиданионов во внеклеточных средах, что может существенно расширить положение теории помехоустойчивости организма [2]. Более того, гипотезы о функциях ЦП [3; 6], содержание которого в плазме крови здорового человека очень высоко (около 300 мкг/мл) и с которым связана практически вся медь плазмы (до 98 %), позволяют рассматривать его как полифункциональный белок. Отсюда генеральной задачей данной работы явилось изучение влияния церулоплазмина на интенсивность окисления Fe2+ и ряда биологически активных субстратов при аутотрансфузии ультрафиолетовооблучённой крови (АУФОК) на активность и содержание ЦП, активность СОД и интенсивность процессов ПОЛ в крови здоровых спортсменов и бывших спортсменов, чья спортивная карьера остановилась после факта выявления
врачами у них лимфовенозной недостаточности нижних конечностей.
Материалы и методы исследования. В исследовании приняло участие 67 респондентов. Группу здоровых спортсменов (п = 36) составляли кандидаты в мастера и мастера спорта по гандболу и волейболу в возрасте от 19 до 21 года. Данную группу (группу 1) мы рассматривали в качестве доноров. В группу бывших спортсменов (группу 2) вошли лица (п = 31) в возрасте от 25 до 45 лет, спортивная карьера которых остановилась в разное время после факта выявления врачами у них лимфовенозной недостаточности нижних конечностей. По заключению медицинских работников, лим-фостаз нижних конечностей у респондентов данной группы мог быть спровоцирован рядом причин, которые нами не определялись и не анализировались далее в исследованиях. Квалификационный состав данной группы соответствовал реестру спортивной квалификации и видам спорта группы доноров, что позволяло нам в исследованиях сравнивать результаты групп 1 и 2 с учётом их относительной и всё же максимально возможной (в условиях настоящего исследования) однородности.
Респондентам второй группы лечащими врачами были назначены и проводились курсы АУФОК. Использовался аппарат для АУФОК «Изольда» МД-73. Объём облучаемой крови определялся из расчета 2 мл на 1 кг массы тела. Доза облучения соответствовала стандартной дозе, рекомендуемой инструкцией к аппарату. Курс АУФОК состоял из 4 сеансов с интервалом 2 сут. Для исследования кровь забиралась из вены до ультрафиолетового облучения (УФО); из ап-
парата — сразу после УФО и из вены через 5-10 мин после АУФОК.
Парафенилендиаминооксидазную активность ЦП в плазме крови определяли спектрофотометрическим способом [1]. О содержании ЦП в плазме судили по количеству в ней меди [5]. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали по содержанию в плазме диеновых конъюгатов (ДК) липидов, которые определяли спектрофотометрически [1]. СОД-активность измеряли в хло-роформ-этанольных (ХЭ) экстрактах плазмы и гемолизированных эритроцитов (Эр) после их трехкратной отмывки физиологическим раствором [4].
Для изучения возможных механизмов влияния УФИ на активность ЦП и СОД использовали кровь респондентов группы 1 — доноров и в опытах in vitro проводили облучение цельной крови, плазмы, гемолизированных Эр, ХЭ-экстрактов плазмы и Эр в аппарате «Изольда» МД-73 в течение 1-3 мин, после чего во всех образцах изучали активность ферментов. Кроме того, выделяли ЦП с высокой степенью очистки из плацентарной крови человека [6] и облучали его растворы (25,2 мкмоль/л) в спектрофотометричских кюветах. Через 1, 2, 3 мин измеряли поглощение ЦП в области его характеристических максимумов (при 610 и 330 нм). Одновременно измеряли оксидаз-
ную активность ЦП, используя в качестве субстрата окисления раствор парафенилендиамина (0,187 ммоль в 1 л 0,4 М Ка-ацетатного буфера, рН 5,5), растворы адреналина и норадреналина (0,038-0,38 ммоль в 1 л 0,05 М Ка-ацетатного буфера, рН 6,0).
результаты исследования и их обсуждение. Активность ЦП в крови сразу после I сеанса УФО (в аппарате) достоверно снижалась на 10 % и на 15-24 % — после П-^ (таблица).
Одновременно в плазме снижалось на 11-17 % и содержание меди, однако эти изменения не были достоверны из-за большого разброса индивидуальных значений. Через 10 мин после ре-инфузии облучённой крови исследуемые показатели обнаруживали тенденцию к увеличению до исходных значений. В ходе курсового лечения методом АУФОК активность ЦП и содержание меди возрастали и составили ко времени IV сеанса соответственно 125 и 114 % от исходных показателей.
Снижение СОД-активности плазмы крови больных во время I и II сеансов АУФОК совпало с динамикой изменения активности ЦП, но носило недостоверный характер (табл. 1). После III сеанса СОД-активность плазмы достоверно увеличивалась на 33% по сравнению с данными до лечения. Активность СОД в Эр перед II сеансом
динамика активности ЦП и СОд, содержание меди и диеновых конъюгатов в крови спортсменов группы 2 во время лечения методом АУфОК (х ± )
Сеанс Срок наблюдений Церулоплазмин, мкмоль/(л х мин) Медь плазмы, мкмоль/л Супероксиддисмутаза, усл. ед. ДК плазмы, мкмоль/л
плазмы эритроцитов
I і З,78+0,і5 і4,4+0,4 і,9+0,25 3,6+0,50 і0,6 + і,і
2 З,44+0,2і* 3,6і+0,і7 іЗ,2+і,2 і,4+0,24 3,0+0,50 * іі,3+і,2
3 іЗ,0+0,5 і,5+0,20 3,7+0,28 і0,2+і,2
II і 4,і2+0,20 і5,0+0,8 і,8+0,20 5,5+і,0 іі,0+і,2
2 3,і2+0,і9* 3,90+0,28 і3,3+і,0 і,7+0,25 5,8+і,0** 9,9+0,9
3 і4,і+і,2 і,5+0,і9 4,2+0,57 9,9+і,3
III і 4,З4+0,і7 і5,6+0,25 і3,0+і,і і,9+0,25 6,0+і,0** іі,0+0,9
2 3,77±0,і9* 3,86+0,33 і4,7+і,9 2,і+0,З0 6,7+і,50** і0,7+0,8
3 2,5+0,і0** 5,5+і,60 і0,7+і,4
IV і 4,70+0,2і** і6,4+0,8** - 7,0+і,70** 8,4+і,2
2 4,06+0,39 і4,2+і,8 і5,2+0,9 - 6,7+і,80** 7,8+і,З**
3 4,Зі+0,22 - 6,і±і,80** 6,9+і,6 **
Примечание: * отличие от исходных показателей при данном сеансе достоверно; ** отличие от исходных показателей перед I сеансом достоверно (оценка по критерию Вилкоксона — Манна — Уитни, р < 0,05); остальные различия недостоверны: 1 — до УФО; 2 — сразу после УФО в аппарате «Изольда» МД-73; 3 — через 5-10 мин после АУФОК.
увеличивалась на 53 %, а к концу лечения — на 70-94 %.
Содержание ДК-липидов в плазме крови в ходе каждого сеанса (кроме I) имело тенденцию к снижению по сравнению с их количеством до лечения, а после IV сеанса оно достоверно уменьшилось на 29 %.
Как показали модельные эксперименты, проведённые на донорской крови, её облучение приводило к немедленному снижению оксидазной активности ЦП на 10-14 %, облучение плазмы — к снижению на 20-23 %. После УФО растворов очищенного ЦП оксидазная активность фермента ингибировалась на 50 % при использовании в качестве субстрата парафенилендиамина или адреналина, и на 20 % — при использовании нора-дреналина, что, видимо, обусловлено различным сродством фермента с этим субстратом. Изучение кинетики окисления адреналина показало (рисунок), что УФО ЦП приводит к снижению скорости ферментативной реакции почти в 1,5 раза при неизменной константе Михаэлиса (Км ), равной
0,106 ммоль/л адреналина.
результаты исследования и их обсуждение. Проведённые исследования экспериментально показали наличие существенных изменений активности СОД и ЦП у обследуемых группы 2 в ходе их курсового лечения методом АУФОК. Более того, моделируемые при этом методе УФЛ,
немедленно подавляют активность ЦП в плазме крови больных и здоровых спортсменов как по отношению к парафенилендиамину, так и к адреналину и норадреналину. Скорость реакции окисления адреналина облучённым ЦП почти в 1,5 раза ниже, чем необлученным при неизменной Км. Это обусловлено, по-видимому, тем, что под влиянием УФЛ молекулы ЦП частично переходят в восстановленное состояние вследствие конформационных перестроек активного центра. Как известно [3], процесс УФ-инактивации белков начинается с поглощения энергии УФЛ основными хромофорами — триптофаном и цистином, что приводит в итоге к изменению конформации активного центра. В молекуле ЦП обнаружено более высокое содержание триптофана по сравнению с другими белками, и, кроме того, в ней насчитывается до 15 цистиновых групп [6]. Вероятно, эти особенности структуры ЦП и объясняют значительную УФ-чувствительность его молекул.
Возникновение конформационных перестроек в активном центре ЦП при действии УФЛ подтверждается и результатами анализа спектральных характеристик облучённого ЦП. Поглощение фермента при 610 нм снижается. Это подтверждается и данными [4], согласно которым, выявленная нами интенсивность поглощения обусловлена ионами Си2+ типа I («голубая» медь), связанны-
7/Ь у 1
0.100 / у2
0.050 і /\ ..III I
п -7 2.6 7.0 п.о 28.0 1/С
Влияние УФО растворов очищенного ЦП на скорость реакции окисления адреналина: по оси абсцисс — концентрация (С) адреналина, моль/л; по оси ординат — скорость (у) реакции, усл. ед. (график в координатах двойных обратных величин). Растворы ЦП:
1 — необлучённые, 2 — облучённые
ми в активном центре с атомами серы цистеина. Более того, согласно нашим предположениям, снижение поглощения происходит как в результате разрыва связи иона меди с серой, так и вследствие восстановления меди. Поглощение облучённого ЦП уменьшается и при 330 нм, что также свидетельствует о структурных перестройках активного центра данного фермента. Наличие этого поглощения обусловлено ионами диамагнитной меди типа III активного центра ЦП, где они образуют лиганды с тиоловыми группами цистеина и метионина по типу диамагнитных димеров.
Согласно результатам, полученным нами, очевидно, что восстановление меди в молекуле ЦП после УФО имеет большое функциональное значение, поскольку только в восстановленном виде ЦП отдаёт свою медь клеткам и тканям, и только связанная с молекулами ЦП медь используется для синтеза медьсодержащих ферментов и белков. О том, что АУФОК активирует эти процессы, свидетельствует следующая группа фактов: 1) одновременное снижение активности ЦП и содержания меди в плазме крови; 2) увеличение активности СОД в Эр к началу II и последующих сеансов УФО; 3) увеличение активности СОД в Эр после УФО цельной донорской крови при отсутствии эффекта после УФО гемолизированных,
предварительно отмытых от плазмы Эр (в условиях отсутствия ЦП). Активирование СОД, по всей вероятности, обусловлено включением элиминированной из ЦП меди в синтез этого фермента. Не исключено, что дополнительный вклад в активирование СОД в Эр цельной крови вносит и индуцирующий её синтез кислород, уровень которого в крови заметно увеличивается после АУФОК [1].
Выводы:
1. Наблюдаемое в ходе лечения курсом АУФОК активирование ЦП в плазме и СОД в Эр можно считать одним из положительных эффектов приспособления системы крови к УФО.
2. Предложенное и экспериментально обоснованное определение ряда описанных выше реакций может служить примером помехоустойчивой реакцией системы крови к УФО и дополнительно расширить объяснение положительного терапевтического эффекта метода АУФОК.
3. Более того, это позволяет и сам метод АУФОК рассматривать как компенсаторно-приспособительный процесс воздействия, направленный на защиту клеток (как извне, так и изнутри) от разрушительного действия супероксиданионных радикалов кислорода и пероксидов липидов, возникновение которых возможно при УФО.
Список литературы
1. Гаврилов, Б. В. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / Б. В. Гаврилов, М. И. Мишкорудная // Лаборатор. дело. 2003. № 3. C. 33-35.
2. Елисеев, Е. В. Помехоустойчивость организма спортсмена: структура, механизмы, адаптация / Е. В. Елисеев. Челябинск : Экодом, 2003. 357 с.
3. Al-Timim, D. The inhibition of lipid autooxidate by human caeruloplasmin / D. Al-Timim, T. Dormandy. Biochem J. 2007. Vol. і68. Р. 283-288.
4. Fried, R. Enzymatic and enzymatic assay of superoxide dismutase / R. Fried. Biochem J. 2005. Vol. 57, № 5. Р. 657-660.
5. Rosner, R. Egyszerii serum-rez meghatarozas oxalil-dihidraziddal / R. Rosner, I. Mihok. Kiserl. Orvostud. 200і. Vol. 23, № і. Р. 92-97.
6. Stokes, R. A rapid method for the isolation of ceruloplasmin /R. Stokes. Clin. chim. Acta. 2007, Vol. і5. Р. 5i7-523.
Сведения об авторах
Елисеев Евгений Вадимович — доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой физического воспитания и спорта Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. [email protected]
Кокорева елена Геннадьевна — доктор биологических наук, профессор кафедры физического воспитания и спорта Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. [email protected]
трегубова Марина Владимировна — кандидат биологических наук, доцент кафедры физического воспитания и спорта Челябинского государственного университета, Челябинск, Россия. [email protected]
Bulletin of Chelyabinsk State University. 2014. № 4 (333).
Education and Healthcare. Issue 3. P. 44-48.
ceruloplasmin and number of biologically active substrate in the irradiated blood autotransfusion ultraviolet athletes
E. V. Eliseev
Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Department of Physical Education and Sport of Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. [email protected]
E. G. Kokoreva
Doctor of Biological Sciences, Professor of the Department of Physical Education and Sport of Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. [email protected]
M. V. Tregubova
Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Physical Education and Sport of Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia. [email protected]
Defining mechanisms of affirmative action autotransfusion blood irradiated with ultraviolet rays, the authors propose to consider an increase in ceruloplasmin activity as interference-free response of the blood system to the increasing effect of ultraviolet radiation.
Keywords: ceruloplasmin, superoxide dismutase, lipid peroxidation, antiradical protection of the blood system, immunity.
References
1. Gavrilov, B. V. Spectrophotometric determination of lipid hydroperoxide in plasma / B. V. Gavrilov, M. I. Mishkorudnaya // Laboratory work. 2003. № 3. C. 33-35.
2. Eliseev, E. V. Immunity of an athlete: structure, mechanisms, adaptation / E. V. Eliseev. Chelyabinsk Ecodom 2003. 357 p.
3. Al-Timim, D. The inhibition of lipid autooxidate by human caeruloplasmin / D. Al-Timim, T. Dormandy // Biochem J. 2007. Vol. 168. P. 283-288.
4. Fried, R. Enzymatic and enzymatic assay of superoxide dismutase / R. Fried // Biochem J. 2005. Vol. 57, № 5. P. 657-660.
5. Rosner, R. Egyszerii serum-rez meghatarozas oxalil-dihidraziddal / R. Rosner, I. Mihok. Kiserl // Orvos-tud. 2001. Vol. 23, № 1. P. 92-97.
6. Stokes, R. A rapid method for the isolation of ceruloplasmin / R. Stokes // Clin. chim. Acta. 2007. Vol. 15. P. 517-523.
