CC BY
4
НАУЧНЫЙ ОБЗОР УДК 577.32
ЦЕЛЕНТЕРАЗИН-ЗАВИСИМЫЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫ: СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ
Людмила Алексеевна Франк, Василиса Валерьевна Красицкая
Институт биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН
Автор, ответственный за переписку: Людмила Алексеевна Франк, lfrank@ yandex.ru
Аннотация. Обзор содержит данные о строении биолюминесцентных систем морских животных, использующих в качестве светоизлучающих белков целен-теразин-зависимые люциферазы. Показано, что благодаря доступности, стабильности и высокому квантовому выходу реакций эти люциферазы, а также их генетические варианты с новыми полезными свойствами успешно используются как репортерные молекулы в разнообразных аналитических системах in vitro и in vivo. Их применение обеспечивает высокую чувствительность, простой дизайн и быстрое выполнение анализа.
Ключевые слова: биолюминесценция, целентеразин, люцифераза. Са2-регулируемый фотопротеин, аналитические системы
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2024-65-3-245-254
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания № 0287-2022-0002.
Для цитирования: Франк Л.А., Красицкая В.В. Целентеразин-зависимые люциферазы: свойства и применение в молекулярном анализе // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2024. Т. 65. № 3. С. 245-254.
SCIENTIFIC REVIEW
COELENTERAZINE-DEPENDENT LUCIFERASES: PROPERTIES AND APPLICATION
Ludmila A. Frank, Vasilisa V. Krasitskaya
Institute of Biophysics, SB RAS, FRC KSC SB RAS Corresponding author: Ludmila A. Frank, [email protected]
Abstract. The review presents data on the structure of bioluminescent systems of marine animals that use coelenterazine-dependent luciferases as light-emitting proteins. It has been shown that due to the availability, stability and high quantum yield of reactions, these luciferases, as well as their genetic variants with new useful properties, are successfully applied as reporter molecules in a variety of analytical systems in vitro and in vivo. Their use provides high sensitivity, simple design and fast analysis.
Keywords: bioluminescence, coelenterazine, luciferase, Ca2-regulated photoprotein, analytical systems
Financial Support. The work was carried out within the framework of the state task No. № 0287-2022-0002.
For citation: Frank L.A., Krasitskaya V.V. Coelenterazine-dependent luciferases: properties and application // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. 2024. T. 65. № 3. S. 245-254.
© Франк Л.А., Красицкая В.В., 2024
Подавляющее число известных на сегодняшний день светящихся организмов являются морскими обитателями. Ключевой элемент биолюминесцентных систем - ферменты-оксигеназы (люциферазы), катализирующие окисление субстрата (люциферина) с выделением света в видимой области спектра. Несмотря на то, что морские светящиеся животные принадлежат к самым разным таксонам, обладают биолюминесцентными системами разной сложности, разным строением люцифераз и механизмом реакции, все они используют в качестве люциферина соединение с одинаковой структурой, содержащей имидазо-пиразиноновый скелет - целентеразин (СТ2) или его близкие аналоги. Экспериментально показано, что биосинтез СТ2 осуществляется копепода-ми [1] и, очевидно, попадает в другие организмы по трофическим цепям [2].
Среди целентеразин-зависимых люцифераз выделяют 2 различных по организации типа (рисунок): а) люциферазы, катализирующие окисление СТ2 по кинетике Михаэлиса-Ментен с образованием целентерамида (СТМ) - декар-боксилированного производного целентерази-на, а также СО2 и кванта голубого цвета; б) Са2-регулируемые фотопротеины, которые представляют собой устойчивый нековалентный комплекс из апобелка и окисленного субстрата в виде гидропероксицелентеразина. Белок включает кальцийсвязывающие сайты классического БР-Иап^типа, и присоединение Са2+ вызывает декарбоксилирование СТ2 с образованием ком -плекса белок-СТМ-3Са2+ с испусканием кванта голубого цвета. Таким образом, биолюминесценция фотопротеинов имеет характер яркой
быстрой вспышки и не зависит от присутствия кислорода в среде, а ее интенсивность всегда линейно зависит от концентрации белка.
Биолюминесцентными системами первого типа обладают, например, мягкие кораллы RemПa, копеподы Metridia и Gaussia, креветка Ор1орЫгш; второй тип имеют медузы Aeqouria, С1у^а, гидроидные полипы Obelia, гребневики Beroe и другие. Приведенный перечень организмов, обладающих целентеразин-зависимой биолюминесцентной системой, далеко не исчерпывающий, более подробно они описаны в обзоре [3].
Люциферазы многих организмов выделены и изучены: они представляют собой небольшие (17-35 кДа), за редким исключением одноце-почечные белки. Кодирующие гены многих из них клонированы, получены рекомбинантные аналоги этих белков, а также их генетическимо-дифицированные аналоги с новыми полезными свойствами, что открывает возможность для их масштабного исследования не только фундаментального, но и прикладного характера.
Как было уже упомянуто, природные СТ2-зависимые люциферазы излучают свет в одном и том же диапазоне с максимумами при 460-480 нм, что можно объяснить одинаковым строением эммитера, образующегося в результате окисления целентерамида, либо его близких аналогов в возбужденном состоянии [4]. Однако биолюминесцентные системы многих организмов содержат молекулу-переизлучатель, спектр свечения которой сдвинут в длинноволновую область (^макс = 510 нм), так называемый зеленый флуоресцентный белок (ОРР). Он был открыт О. Шимомурой при
Типы целентеразин-зависимых биолюминесцентных систем. Luc - люцифераза; PhP - фотопротеин; CTZ - целентеразин; CTM - целентерамид; CBP - целентеразин-связывающий белок; GFP - зеленый флюоресцентный
белок
изучении биолюминесценции медузы Aequorea aequorea [5], а затем обнаружен в биолюминесцентных системах других организмов (например, Clytia и Renilla). Ген GFP клонирован, и к настоящему времени получены не только рекомбинант-ный вариант белка, но и множество его генетических вариантов с новыми полезными свойствами. Это нетоксичные белки со сдвинутыми спектрами флуоресценции и увеличенной яркостью, удлиненные различными биоспецифическими молекулами. Значение этого белка как флуоресцентного репортера в биологических, медицинских и биотехнологических исследованиях трудно переоценить.
Интересно рассмотреть локализацию субстрата в этих биолюминесцентных системах. Молекула целентеразина в силу своей гидрофобности легко проникает через клеточную мембрану и теоретически может распространиться по всему телу животного. Однако само предназначение биолюминесценции как инструмента, призванного обеспечить выживание организма (защиту от хищника, привлечение партнера и др.) предполагает ее постоянную готовность возникать в нужный момент. В Са2-зависимых фотопротеинах предокисленный субстрат локализован внутри белка, который представляет собой стабильный комплекс «три в одном», и сигнал возникает мгновенно при нервном возбуждении, передаваемом потоком Са2+. В случае копепод целентеразин и люцифераза накапливаются по отдельности в специальных железах рачка и в момент возбуждения секретируются в среду, где мгновенно происходит окисление субстрата с возникновением светящегося облака [6]. В биолюминесцентной системе Renilla CTZ прочно, но нековалентно иммобилизован внутри специального Са2-зависимого белка (СВР) и становится доступным окислению люциферазой при присоединении Са2+ [7]. В экспериментах in vitro показано, что СВР является в несколько раз более эффективным субстратом, чем свободный целен-теразин, очевидно, благодаря образованию межбелкового комплекса [8, 9]. Было обнаружено, что СВР Renilla может «работать» как эффективный Са2-зависимый субстрат люциферазы копеподы Metridia longa [10] и искусственной люциферазы NanoLuc [11], а также образовывать комплексы не только с целентеразином дикого типа, но и с его синтетическими аналогами, например целентеразином-v [12] и фуримазином [11].
Для биолюминесцентной реакции CTZ-зависимых люцифераз характерен высокий кван-
товый выход, например, для Са2-регулируемых фотопротеинов гидромедуз он составляет 20-25% [13]. Этот факт в совокупности с доступностью рекомбинантных вариантов люцифераз, простым запуском биолюминесценции (это в особенности касается фотопротеинов), наличием синтетических аналогов люциферина предопределили интерес к практическому использованию этих ферментов в качестве эффективных фоторепортеров в молекулярном анализе in vitro и in vivo. Три года назад нами был проведен обзор публикаций за последние 10 лет по применению CTZ-зависимых люцифераз как эффективных аналитических инструментов для биомедицинских и биотехнологических исследований [14]. Как показывает самый беглый анализ, интерес к этим исследованиям со стороны международного научного сообщества не ослабевает, однако в рамках настоящего мини-обзора будут в основном представлены результаты многолетних исследований, проводимых в Институте биофизики СО РАН. Исследования морской биолюминесценции в нашем институте были инициированы в 60-е годы прошлого века и долгое время проводились под руководством академика РАН Иосифа Исае-вича Гительзона [15].
Са2+-регулируемые фотопротеины - свойства и применение
В 1995 г. клонировали сДНК, кодирующую Са2-регулируемый апофотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima [16], что дало импульс для интенсивного изучения этого белка: был получен его рекомбинантный аналог [17], определена его пространственная структура и предложен механизм функционирования этой системы [18, 19]. В силу высокой гомологии аминокислотных последовательностей молекулы гидроидных фотопротеинов, таких как обелин (PDB 1EL4), акворин (PDB 1EJ3), кли-тин (PDB 3KPX) и митрокомин (PDB 4NQG), похожи и представляют собой компактную глобулу, образованную восемью а-спиралями, формирующими N- и С-домены в виде «чашек», краями соединенных друг с другом. Во внутреннюю полость молекулы обращены боковые радикалы гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают изоляцию иммобилизованного здесь предокисленного субстрата. Три из четырех межспиральных участка включают Са2-связывающие последовательности EF-hand-типа. Аминокислоты, участвующие в локализации субстрата расположены во всех а-спиралях, и
как правило, являются консервативными. Для выяснения роли отдельных аминокислотных остатков в биолюминесцентной реакции фотопротеинов сайт-направленным мутагенезом было получено и тщательно изучено около двухсот вариантов этих белков. Результаты этих исследований суммированы в недавнем подробном обзоре [20].
Параллельно исследовали возможность использования обелина и его мутантных вариантов в качестве репортеров в микроанализе in vitro. Были разработаны условия химического синтеза конъюгатов обелина с различными биоспецифическими молекулами (биотином, стрептави-дином, гормонами, антителами и олигонуклео-тидами, в том числе с ДНК (РНК) аптамерами), позволяющие максимально сохранить его биолюминесцентную активность. Эти соединения использовали как специфические метки в микроанализе для выявления целого ряда диагностически важных молекулярных мишеней (таблица).
Знание структуры активного сайта белка и ключевых аминокислотных остатков, участвующих в иммобилизации субстрата, позволило с помощью технологии сайт-направленного мутагенеза получить варианты обелина с новыми полезными свойствами - измененными спектральными характеристиками и кинетикой биолюминесцентного сигнала. Среди них были получены два варианта обелина: вариант W92F; H22E с быстрой кинетикой сигнала (kd = 0,6 c-1) и сдвинутым в коротковолновую область спектром (^макс = 387 нм); вариант Y138F с замедленной кинетикой и длинноволновым сдвигом спектра (kd = 6,1 c-1; Хмакс = 498 нм). Столь существенные различия сигналов позволяют осуществлять разделение белков с помощью простых широкополосных фотофильтров и временного разрешения [21]. Белки оказались стабильными и яркими, на их основе был разработан способ одновременного выявления двух мишеней в образце: одновременный иммуноана-лиз гонадотропных гормонов (ЛГ и ФСГ), тотального и иммуноглобулин-связанного (макро-) про-лактина [22, 23], а также показаны преимущества этого подхода по сравнению с раздельным анализом мишеней. На основе этих репортеров был разработан способ выявления однонуклеотидных полиморфизмов, пригодный для проведения быстрого локального скриннинга распространенности генотипов в популяции, а также выявления взаимосвязи с генетической предрасположенностью к заболеванию. Так, были исследованы полиморфизмы в гене рецептора меланокортина-1
(MC1R), ассоциированные с риском возникновения меланомы кожи [24]; полиморфизмы, связанные с нарушениями системы гемостаза [25]; ряд полиморфизмов, предположительно связанных с риском возникновения нейросенсорной тугоухости [26]; полиморфизм rs9904341 в регу-ляторной области гена онкомаркера сурвивина с риском возникновения рака мочевого пузыря [27, 28]. Анализ занимает 2 ч (вместе с наработкой матрицы) и существенно проще современных методов генотипирования на основе РТ ПЦР и секвенирования, а различие (более чем на порядок) значений дискриминационного фактора обеспечивает его достоверность. Эти работы проводили в сотрудничестве с медиками НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, Красноярского краевого клинического онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского и Сибирского научно-клинического центра ФМБА России, при их проведении в краткие сроки было исследовано статистически значимое (несколько сотен) число клинических образцов ДНК, что позволило сделать достоверные выводы об их взаимосвязи с соответствующим заболеванием.
Помимо химических конъюгатов, генетическим фьюзингом были получены бифункциональные гибридные молекулы обелина со стреп-тавидином (Stavi-OL) и иммуноглобулин-свя-зывающим фрагментом белка А Staphylococcus aureus (ZZ-OL) [29, 30]. При бактериальной экспрессии оба домена независимо формируют свои пространственные структуры и обладают свойствами «родительских» белков - способностью прочно связываться с биотином и иммуноглобулинами класса G соответственно, а также Са2-зависимой биолюминесценцией. Фактически, благодаря природе полипептида, слитого с обелином, эти белки представляют собой универсальные метки, способные выявлять любые молекулярные комплексы, содержащие биоти-новый или иммуноглобулиновый компонент. Кроме того, были получены гибридные белки фотопротеинов, связывающиеся с конкретными мишенями. Недавно были получены гибриды с онкомаркерами (суривин-обелин и меланома-ингибирующий белок MIA-обелин) как репортеры для выявления этих онкомаркеров в микроанализе конкурентного типа [31].
Уникальная способность фотопротеинов генерировать свет в присутствии ионов Са2+ обусловила их применение в качестве специфичного и чувствительного зонда для проведения мониторинга его внутриклеточных потоков [14, 32]. Эти
Биолюминесцентный микроанализ на основе CTZ-зависимых репортеров
Группа Мишень Заболевание Репортер Образцы ЬОБ / линейный диапазон Лит.
Тропонин I (сердечная изоформа) (cTnl)* инфаркт миокарда №поЬис ~ анти-сТп1 ДНК аптамер сыворотка крови 5,4 нг/мл [51]
а ОЬ ~ с1Т30 сыворотка крови 0,04-3 нМ [53]
и & S о s ч Белок, связывающий жирные кислоты, сердечная изоформа (№АВР) инфаркт миокарда ЫапоЬис ~ анти-ЫАВР 1ЙС сыворотка крови 1,2 нг/мл [51]
й Тропонин Т 0,67-162 нг/мл
Миоглобин инфаркт миокарда 81ау1-ОЬ буфер 5,6-90 нг/мл [29]
Креатин киназа МВ 1,6-50 нг/мл
S « Гемоглобин (НЬ)* сахарный диабет бифункциональный РНК аптамер к НЬ и ОЬ буфер 1,6-50 нМ [54]
§- Гликированный гемоглобин (HbAlc)* сахарный диабет ОЬ ~ анти-НЬА1с ^С сыворотка крови 3,75-15% от тотального гемоглобина [55]
ч (D W IgG человека, кролика, мыши ZZ-OL буфер 4,1-1000 нг/мл [30]
Аутоантитела к основному белку миелина* рассеянный склероз ОЬ ~ анти-ОБМ РНК аптамер сыворотка крови чувствительность 63,7% специфичность 94% [56]
Лютеинизирующий (ЛГ) ифолликулостимулирующий (ФСГ) гормоны нарушения функций генеративных органов ОЬ W92F,H22E ~ анти-ЛГ 1§С: ОЬ У138Б ~ анти-ФСГ сыворотка крови 0,4 и 0,34 мМЕд/мл / 1,25-160 мМЕд/мл [22]
к о ОЬ W92F,H22E -анти- общий РИЬ: 3,54 ± 0,5 мМЕд/мл
S а й Общий и макро пролактин (PRL) гиперпролактинемия РИЬ ^в;ОЬ У138Б ~ aнти-ll[gG сывороткакрови / 56-4500 мМЕд/мл макро РРЬ: 62,5-1000 нг/мл [23]
Свободный (FT4) и тотальный тироксин (ТТ4) гипертиреоз гипотиреоз ОЬ ~ анти-Т4 1йС и ОЬ ~ Т4 сыворотка крови 0,25 нМ (БТ4)15 нМ (ТТ4) [57]
тиреотропин ТТГ ОЬ ~ анти-ТТГ 1йС 0,01 мМЕд/л
Сурвивин (Surv) рак мочевого пузыря ОЬ-8игу моча 0,2-54 нг/мл [28]
а. сыворотка крови 0,7-54 нг/мл [31]
и & s Белок ингибирующий активность меланомы (MIA) меланома ОЬ-М1А сыворотка крови 4,5-500 нг/мл [31]
§ и О циркулирующие клетки опухоли* адонокарценома (рак легкого) ОЬ ~ олигонуклеотид комплементарный к ДНК аптамеру плазма крови чувствительно сть 91,5 % специфичность 75% [58]
к» -й-
ЧО
Окончание табл.
Группа Мишень Заболевание Репортер Образцы ЕОБ / линейный диапазон Лит.
(D Вирус клещевого энцефалита вирус клещевого энцефалита 14D5a-Rm7 клещи чувствительность 89,5% специфичность 98,9 % [44-46]
гкционны агенты 14D5a-MLuc7 буфер гликопро-теин Е до 45 пг [48]
ДНК фрагмент вируса гепатита С вирус гепатита С OL ~ Stavi буфер 1010 7-1010 11 М [59]
•е и поверхностный антиген HbsAg вирус гепатита В OL ~ анти-HbsAg IgG буфер 0,37 нг/мл
S Shigella sonnei LPS шигеллез OL ~ анти- S.sonnei IgG буфер 0,25 нг/мл [60]
ген BIRC5 -31G>C (rs9904341) риск развития рака мочевого пузыря ОШ (доверительный интервал), р 1,71(1,01-2,89), 0,02 [27, 28]
S 00 S •е а о S гены CAT (rs494024), NCL (rs7598759), HSPA1L (rs2227956), PCDH15 (rs7095441), PON2 (rs7785846) риск развития нейросенсорной тугоухости для 1^494024. СС генотип: 0,34(0,16-0,72); СТ генотип: 1,96 (1,01-3,78), 0,02 [26]
в « и 4 5 н о ген MC1R rs 1805007 (R151C), rs 1805008 (R160W), rs 1805009 (D294H) риск развития меланомы OL W92F, H22E ~dT30; OLY138F~aHTH-FITC IgG геномная ДНК 2,93(1,29-6,65), 0,01 3,15 (1,32-7,5), 0,01 [24]
w ген FV (G1691A) риск развития тромбофилии
о и ч о ген FII (G20210A) популяционных исследований не проводилось
ген FVII (G10976A) [25]
ген MTHFR (C677T) риск развития венозных тромбозов
Обозначения. OL - С;Г -регулируемый фотопротеин обелин; Rm7 - мутантный вариант люцифера зы Ren ilia muelleri\ MLuc7 - изоформа люцифера зы \ letridia longa; Stavi - стрептавидин; ZZ - иммуноглобулин-связывающий домен белка A Staphylococcus aureus; 14D5a - миниантитело мыши к вирионному белку вируса клещевого энцефалита; (- ) или (~) - химический коньюгат или гибридный белок соответственно. * Анализ на основе аптамерной сенсорики.
белки имеют малый размер, активны в широком диапазоне рН, нетоксичны, а целентеразин легко проникает через клеточные мембраны. Значительный интерес представляет изучение внутриклеточной передачи сигналов ионами кальция, которая регулирует многочисленные клеточные процессы, включая сокращение мышц, нейронные сигналы, экспрессию генов, пролиферацию, апоптоз и т.д. С помощью методов молекулярной биологии конструируют клеточные линии, экс-прессирующие фотопротеин, а также гибридные белки, содержащие сигнальные полипептиды, позволяющие адресно направлять репортер в различные компартменты клетки [33]. Поскольку концентрация кальция в цитоплазме и различных клеточных органеллах существенно варьирует, проводятся поиски генетических вариантов фотопротеинов с разной чувствительностью к Са2+, низкой чувствительностью к Mg2+, различными спектральными и кинетическими характеристиками биолюминесцентного сигнала. Оказалось, что даже природные фотопротеины, несмотря на схожесть аминокислотных последовательностей, имеют разные диапазоны зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации Са2+ и разную чувствительность к присутствию Mg2+ [34, 35], однако, в целом они укладываются в диапазон 10-10 М. Варианты фотопротеинов с пониженной чувствительностью, пригодных для измерения Са2+, например в митохондриях (миллимолярный диапазон), получают сайт-направленным мутагенезом и с помощью синтетических аналогов СТ2 [36]. Не меньший интерес вызывают и варианты фотопротеинов с повышенной чувствительностью к Са2+ и одновременным сдвигом спектра свечения в длинноволновую область [37]. Это перспективные репортеры для мониторинга сигналов в клетках и тканях.
СТ7-зависимые люциферазы - свойства и применение
Биолюминесцентная система мягкого коралла RemПa reniformis имеет самую длительную историю изучения: первая публикация появилась в 1961 г. [4]. Было показано, что люцифераза является односубъединичным белком (Мм = 35 кДа), с температурным оптимумом 32 °С и максимумом биолюминесценции при 480 нм. Информация о гене, кодирующем этот белок и получении его рекомбинантого варианта была опубликована в 1991 г. [38]. Позднее были получены реком-бинантные белки биолюминесцентной системы RemПa muelleri [8].
Как уже упоминалось выше, биолюминесцентная система Renilla включает три белка: люциферазу, Са2+-зависимый целентеразин-связывающий белок (СВР) и зеленый флюоресцентный белок. Благодаря этому составу биолюминесценция животного контролируется нервной системой и in vivo имеет сдвинутый в длинноволновую область спектр с максимумом сигнала при 509 нм. Зеленое свечение возникает благодаря безызлучательному переносу энергии возбужденного продукта окисления (целентера-мида) на GFP, причем его интенсивность в несколько раз превосходит интенсивность голубого свечения (в отсутствие GFP). Этот процесс используется в различных аналитических системах на основе BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), которые широко применяют для фундаментальных и прикладных исследований. К настоящему времени получено множество генетических вариантов как люциферазы, так и GFP, с новыми полезными свойствами: нетоксичностью, расширенным диапазоном спектра флюоресценции и т.д. [14].
Особый интерес представляют варианты природной секретируемой биолюминесцентной системы, найденные, например, в морских копе-подах Metridia и Gaussia, креветках Oplophorus gracilirostris и др. [6]. Были клонированы сДНК люцифераз 12 видов копепод, получены их ре-комбинантные варианты дикого типа [39, 40] и ряд мутантных вариантов. На N-конце всех этих люцифераз расположен лидерный пептид, обеспечивающий их секрецию во внеклеточное пространство. Аминокислотная последовательность люцифераз содержит относительно большое число высоко консервативных цистеиновых остатков (вMetridia longa и Gaussiaprinceps по 10 остатков цистеина), образующих несколько Cys-Cys мостиков, что, очевидно, определяет высокую стабильность белков. Применение секретируемых лю-цифераз в качестве внутриклеточного репортера позволяет проводить высокопроизводительный неинвазивный мониторинг метаболически активных клеток в режиме реального времени без их лизиса. Так, в работе [41] была получена клеточная линия меланомы человека Mel IL-hMLM3, стабильно экспрессирующая гуманизированный вариант люциферазы Metridia longa и показана возможность неинвазивного биолюминесцентного мониторинга числа метаболически активных клеток по биолюминесценции аликвот среды в образцах, содержащих от 23 000 до 10 клеток. Клетки могут быть использованы для
монт^ин^ их жизнеcпоcобноcти, оценки цитотокcичноcти paзличныx ^единений, а также для вьшокопpоизводительного не-инвазивного cкpинингa пpотивоопуxолевыx пpепapатов.
Большое число цистеиновых остатков усложняет получение этих белков с помощью бактериальной экспрессии, однако найденные эмпирически условия фолдинга открывают возможность для использования их в качестве репортеров в анализе in vitro [10, 42].
Несколько лет назад американская фирма «Promega» выпустила на рынок созданную искусственно целентеразин-зависимую люцифе-разу NanoLuc, а также новый синтетический вариант целентеразина - фуримазин [43]. Название Nano было ей присвоено как наименьшей из известных к тому времени люцифераз (Мм = 19 кДа). Белок представляет собой генетически модифицированную каталитическую субъединицу люциферазы глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris, нестабильную в отсутствие большой субъединицы (35 кДа). В результате мутагенеза (всего было заменено 16 аминокислот) была получена стабильно функционирующая люцифераза, которая при использовании фуримазина в качестве субстрата обладает в сотни раз более высокой активностью, высокой термостабильностью и уникальной длительностью сигнала (t1/2 = 2,5 ч). Наличие коммерчески доступной люциферазы и субстрата, а также готовых наборов для разнообразного применения быстро обеспечили популярность этой системе в качестве эффективного аналитического инструмента [14].
Люциферазы, в отличие от фотопротеинов, чувствительны к химическим модификациям и при попытке синтезировать специфические репортеры теряют значительную часть активности. Поэтому для анализа in vitro чаще всего получают гибридные варианты люцифераз, генетически-слитых с адресными полипептидами [6, 44-49], или конструируют варианты, содержащие уникальные аминокислоты, обеспечивающие сайт-направленную химическую модификацию, которая практически не затрагивает биолюминесцентную функцию белка [50, 51].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Oba Y., Kato S., Ojika M., Inouye S. // Biochem. Biophys.
Res. Commun. 2009. Vol. 390. P. 684.
Востребованным вариантом молекулярного анализа являются однофазные тест-системы, когда все события происходят в одном объеме и исключаются длительные процедуры сорбции-десорбции и промывки. Один из вариантов такой системы основан на использовании так называемых сплит-систем, когда молекула люциферазы представлена в виде двух фрагментов, удлиненных исследуемыми адресными полипептидами и способных комплементировать с восстановлением биолюминесцентной активности при сближении исследуемых биоспецифичных компонентов. Пожалуй, наиболее успешным оказалось применение этой системы в случае люциферазы NanoLuc, где разработана пара фрагментов, способных ком-плементировать с восстановлением активности и предоставляется в виде коммерческого продукта NanoBiT system [14]. Недавно подобная система была предложена нами для выявления вируса клещевого энцефалита в клещах [52].
Приведенные данные показывают, что целен-теразин-зависимые люциферазы являются эффективным аналитическим инструментом, пригодным как для проведения фундаментальных исследований, так и для прикладного использования в современной биотехнологии и биомедицине. Доступность рекомбинантных аналогов люцифераз дикого типа, а также их генетически модифицированных вариантов с новыми полезными свойствами, стабильность при получения специфичных меток с помощью химического коньюгирования или генетического фьюзинга, а также при длительном хранении в растворе, в замороженном и лиофилизированном виде, высокая чувствительность анализа, часто сравнимая с чувствительностью радиоизотопного анализа, определяют перспективность разработки различных аналитических систем на их основе.
К сожалению, объем настоящего обзора не позволяет рассказать подробнее о глубоких фундаментальных исследованиях, направленных на установление структурных закономерностей и механизма реакции CTZ-зависимых люцифераз и других белков этих биолюминесцентных систем. Однако авторы надеются, что смогли пробудить интерес читателя к такому уникальному природному явлению, как биолюминесценция, и научным исследованиям в этой области.
2. Takenaka Y., Yamaguchi A., Shigeri Y. // J. Plankton Res. 2017. Vol. 39. Iss. 3. P. 369.
3. Маркова С.В., Высоцкий Е.С. // Биохимия. 2015. Т. 80. № 6. С. 845.
4. Shimomura O., Yampolsky I. // Bioluminescence: Chemical Principles and Methods, 3rd ed.; World Scientific. Publishing: Singapore, 2019.
5. Shimomura O. // FEBS Letters. Vol. 104. N 2. P. 220.
6. Markova S.V., Larionova M.D., Vysotski E.S. // Photo-chem. Photobiol. 2019. Vol. 95. P. 705.
7. Stepanyuk G.A., Liu Z.J., Markova S.S., Frank L.A., Lee J., Vysotski E.S., Wang B.C. // Photochem. Photo-biol. Sci. 2008. Vol. 7. P. 442.
8. Titushin M.S., Markova S.V., Frank L.A., Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Lee J., Vysotski E.S. // Photochem. Pho-tobiol. Sci. 2008. Vol. 7. P. 189.
9. Titushin M.S., Feng Y., Lee J., Vysotski E. S., Liu Z.-J. // Protein Cell. 2011. Vol 2. N 12. P. 9572.
10. Borisova V.V, Frank L.A., Markova S.V., Burakova L.P., Vysotski E.S. // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. Vol. 7. P. 1025.
11. Kudryavtsev A.N., Krasitskaya VV, Efremov M.K., Zangeeva S.V., Rogova A.V., Tomilin F.N., Frank L.A. // Int. J. Mol. Sci. 2023. Vol. 24. Р. 2144.
12. Stepanyuk G.A., Unch J., Malikova N.P., Markova S.V., Lee J., Vysotski E.S. // Anal. Bioanal. Chem. 2010. Vol. 398. P. 1809.
13. Malikova N.P., Eremeeva E.V., Gulnov D.V., Na-tashin P. V., Nemtseva E.V., Vysotski E.S. // Photochem. Photobiol. 2022. Vol. 98. P. 276.
14. Krasitskaya V V, Bashmakova E. E., Frank L.A. // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. Р. 7465.
15. Франк Л.А. // Биофизика для экологии и медицины: К 90-летию академика РАН И.И. Гительзона. Новосибирск, 2019. С. 72.
16. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. // Gene. 1995. Vol. 153. N P. 273.
17. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R. // Methods Enzy-mol. 2000. Vol. 305. P. 223.
18. Liu Z.J., Vysotski E.S., Chen C.J., Rose J.P., Lee J., Wang B.C. // Protein Sci. 2000 Vol. 9. N 11. P. 2085.
19. Vysotski E.S., Lee J.J. // Acc. Chem. Res. 2004. Vol. 37. N 6. P. 405.
20. Eremeeva E.V, Vysotski E.S. // Photochem. Photobiol. 2019. Vol. 95. N 1. P. 8.
21. Frank L.A., Borisova V.V., Markova S.V, Malikova N.P., Stepanyuk G.A., Vysotski E.S. // Anal. Bioanal. Chem. 2008. Vol. 391. P. 2891.
22. Krasitskaya VV., Kudryavtsev A.N., Shimomura O., Frank L.A. // Anal. Methods. 2013. Vol. 5. P. 636.
23. Kudryavtsev A.N., Krasitskaya V.V., Petunin A.I., Burakov A.Y., Frank L.A. // Anal. Chem. 2012. Vol. 84. P. 3119.
24. Bashmakova E.E., Krasitskaya V.V., Bondar A.A., Eremina E.N., Slepov E.V., Zukov R.A., Frank L.A. // Talanta. 2018. Vol. 189. P. 111.
25. Bashmakova E.E., Krasitskaya V.V., Frank L.A. // Comb. Chem. High Throughput. Screen. 2015. Vol. 18. P. 930.
26. Башмакова Е.Е., Красицкая В.В., Юшкова А.Д., Добрецов К.Г., Франк Л.А. // Вестник оториноларингологии. 2021 Т. 86. № 1. С. 15.
27. Башмакова Е.Е., Панамарев Н.С., Кудрявцев А.Н., Черняев Д.В., Слепов Е.В., Зуков Р.А., Франк Л.А. // Сибирский онкологический журнал. 2022. Т. 21. № 4. С. 64.
28. Панамарев Н.С., Башмакова Е.Е., Кудрявцев А.Н., Черняев Д.В., Мазаев А.В., Слепов Е.В., Зуков Р.А., Франк Л.А. // Вопросы онкологии. 2023. Т. 69. № 2. С. 308.
29. Bashmakova E.E., Krasitskaya V.V., Kudryavtsev A.N., Grigorenko V.G., Frank L.A. // Photochem. Photobiol. 2017. Vol. 93. N 2. P. 548.
30. Krasitskaya V.V., Bashmakova E.E., Kudryavtsev A.N., Vorobyeva M.A., Shatunova E.A., Franka L.A. // Rus. J. Bioorgan Chem. 2020. Vol. 46. N 6. Р. 1004.
31. Bashmakova E.E., Panamarev N.S., Kudryavtsev A.N., Frank L.A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2022. Vol.598. P. 69.
32. Высоцкий Е.С., Маркова С.В., Франк Л.А. // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. С. 404.
33. Bonora M., Giorgi C., Bononi A., Marchi S., Paterg-nani S., Rimessi A., Rizzuto R., Pinton P. // Nat. Protoc. 2013. Vol. 8 P. 2105.
34. Malikova N.P., Burakova L.P., Markova S.V., Vysotski E.S. // Anal. Bioanal. Chem. 2014. Vol. 406. P. 5715-5726.
35. Malikova N.P., Borgdor A.J., Vysotski E.S. // Photochem. Photobiol. Sci. 2015. Vol. 14. P. 2213.
36. De la Fuente S., Fonteriz R.I., de la Cruz P.J., Montero M., Alvarez J. // Biochem. J. 2012. Vol. 445. P. 371.
37. Bakayan A., Picaud S., Malikova N.P., Tricoire L., Lam-bolez B., Vysotski E.S., Peyrieras N. // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. N 21. Р. 7846.
38. Lorenz W.W., McCann R.O., Longiaru M., Corm-ierm M.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 4438.
39. Markova S.V., Golz S., Frank L.A., Kalthof B., Vysotski E.S. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 3212.
40. Markova S.V., Larionova M.D., Burakova L.P., Vysotski E.S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2015. Vol. 457. P. 77.
41. Маpкова СВ., Маликова Н.П., Вьгсоцкий Е.С., Фpанк Л.А., Гительзон И.И. // Биофизика. 2017. Т. 62. № 3. С. 618.
42. Markova S.V., Larionova M.D., Vysotski E.S. // Methods Mol. Biol. 2022. Vol. 2524. P. 59.
43. Hall M.P., Unch J., Binkowski B.F., Valley M.P., Butler B.L., Wood M.G., Otto P., Zimmerman K., Vidugiris G., Machleidt T., Robers M.B., Benink H.A., Eggers C.T., Slater M.R. , Meisenheimer P.L., Klaubert D.H., Fan F., Encell L.P., Wood K.V. // ACS Chem. Biol. 2012. Vol. 7. P. 1848.
44. Burakova L.P., Kudryavtsev A.N., Stepanyuk G.A., Baykov I.K., Morozova V.V., Tikunova N.V., Dubo-va M.A., Lyapustin V.N., Yakimenko V.V, Frank L.A. // Anal. Bioanal. Chem. 2015. Vol. 407. N 18. P. 5417.
45. Kudryavtsev A.N., Burakova L.P., Frank L.A. // Anal. Methods. 2017. Vol. 9. P. 2252.
46. Кудрявцев А.Н., Буракова Л.П., Баринова К.А., Франк Л. А. // Журн. Сиб. федер. ун-та. Биология. 2020. Т. 13. № 3. С. 310.
47. Frank L.A. // J. Siberian Federal University. Biology. 2018. Vol. 11. N 2. P. 166.
48. Larionova M.D., Markova S.V., Tikunova N.V., Vysotski E.S. // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21. N 14. Р. 4971.
49. Патент РФ 2513686.
50. Engelen W., van de Wiel K.M., Meijer L.H.H., Saha B., Merkx M. // Chem. Commun. 2017. Vol. 53. P. 2862.
51. Krasitskaya V.V., Efremov M.K., Frank L.A. // Biocon-jug. Chem. 2023. Vol. 34. N 7. P. 1282.
52. Патент РФ № 2784817.
53. Krasitskaya V.V., Goncharova N.S., Biriukov V.V, Bash-makova E.E., Kabilov M.R., Baykov I.K., Sokolov A.E., Frank L.A. // Photochem. Photobiol. 2020. Vol. 96. P. 1041.
54. Davydova A., Krasitskaya V., Vorobjev P., Ti-moshenko V., Tupikin A., Kabilov M., Frank L., Venyaminova A., Vorobyeva M. // RSC Adv. 2020. Vol. 10. P. 32393.
55. Davydova A., Vorobyeva M., Bashmakova E., Vorobjev P., Krasheninina O., Tupikin A., Kabilov M., Krasitskaya V., Frank L., Venyaminova A. // Anal. Biochemistry. 2019. Vol. 570. P. 43.
56. Krasitskaya V.V, Chaukina V.V., Abroskina M.V., Vorobyeva M.A., Ilminskaya A.A., Prokopenko S.V., Nevin-sky G.A., Venyaminova A.G., Frank L.A. // Anal. Chim. Acta. 2019. Vol. 1064. P. 112.
57. Petunin A.I., Vysotski E.S., Frank L.A. // Anal. Biochem. 2004. Vol. 305. Р. 240.
58. Bashmakova E.E., Krasitskaya V.V., Zamay G.S., Zamay T.N., Frank L.A. // Talanta. 2019. Vol. 199. P. 674.
59. Борисова В.В., Пышная И.А., Пышный Д.В., Франк Л. А. // Биоорган. химия. 2008. Т. 34. С. 792.
60. Frank L., Markova S., Remmel N., Vysotski E., Gitel-son I. // Luminescence. 2007. Vol. 22. P. 215.
Информация об авторах
Людмила Алексеевна Франк - гл. науч. сотр. Института биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, рук. лаборатории биолюминесцентных и экологических технологий, доктор биол. наук ([email protected]);
Василиса Валерьевна Красицкая - ст. науч. сотр. Института биофизики СО РАН, ФИЦ КНЦ СО РАН, лаборатории биолюминесцентных и экологических технологий, канд. биол. наук ([email protected]).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Соблюдение этических стандартов
В данной работе отсутствуют исследования человека и животных.
Статья поступила в редакцию 30.10.2023; одобрена после рецензирования 12.11.2023; принята к публикации 14.11.2023.
