CC BY
11
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
153
трансплантация адипоцитарной
тканеинженерной конструкции
с crispr-опосредованной активацией
экспрессии ucp1
С.С. Мичурина1, 2, Ю.С. Стафеев1, В.А. Труонг3,
М.Ю. Меньшиков1, Ю.Ч. Ху3, Е.В. Парфёнова1, 2
1 ФГБУ НМИЦ кардиологии Минздрава России, Москва, Россия
2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 Национальный университет Цинь Хуа, Синчжу, Тайвань
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: CRISPRa, бакуловирус, UCP1, генная терапия, термогенез.
Нарушение системного энергетического гомеостаза, заключающееся в избыточном поступлении и сниженном расходовании энергетических субстратов, приводит к развитию ожирения и сахарного диабета 2 типа. Активация термогенеза жировой ткани сопровождается окислением глюкозы или жирных кислот с последующим выделением полученной энергии в виде тепла при активации разобщающего белка внутренней мембраны митохондрий UCP1. Благодаря способности утилизировать избыточную энергию трансплантация термогенной жировой ткани может способствовать предотвращению метаболических заболеваний. В настоящей работе мы разработали систему активации транскрипции (CRISPRa) для получения и трансплантации зрелых адипоцитов с повышенной экспрессией UCP1.
Для трансплантации использовали мезенхимные стромальные клетки мыши, дифференцированные в зрелые адипоциты. Для активации экспрессии UCP1 мы создали систему CRISPRa-UCP1, содержащую dCas9, комплексы активации транскрипции и гидовые РНК, специфичные к UCP1. Доставку CRISPRa-UCP1 в адипо-циты осуществляли с помощью бакуловирусной транс-дукции. Модифицированные адипоциты смешивали с матриксом Matrigel и вводили мышам C57BL/6 в область ингвинального жирового депо. Через 7 дней проводили глюкозотолерантный тест, измерение массы тела животных, сбор сыворотки крови. Тканеинженерные конструкции извлекали для анализа экспрессии UCP1 и белков метаболизма адипоцитов методами ПЦР в реальном времени и иммуногистохимии.
На 7 день после трансплантации мы наблюдали увеличение мРНК UCP1 в 40 раз и белка в 4 раза в адипо-цитарных тканеинженерных конструкциях, модифицированных CRISPRa-UCP1. Полученные тканеинженерные конструкции содержали зрелые адипоциты с жировыми каплями. Адипоциты экспрессировали гормончувстви-тельную липазу и транскрипционный фактор PGC1 a, регулирующий белую и бежевую адипогенную диффе-ренцировку. Трансплантация не повлияла на массу тела животных и толерантность к глюкозе за 7 дней воздействия. Трансплантация конструкций, не сопровождалась инфильтрацией CD68+ макрофагами и не повышала концентрацию провоспалительных цитокинов ФНОа и ИЛ-6 в сыворотке животных.
Разработанная система CRISPRa-UCP1 позволяет эффективно активировать экспрессию UCP1 для создания термогенных адипоцитов. Отсутствие системных метаболических эффектов тканеинженерных конструкций может быть связано с низкой продолжительностью воздействия и отсутствием метаболических нарушений у животных. Aдипоциты, модифицированные системой
CRISPRa-UCP1, сохраняют морфологию и метаболические свойства после трансплантации и не вызывают активацию локального и системного воспаления. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности и отсутствии иммуногенности CRISPRa-UCP1 и бакуловирусной системы доставки. Работа поддержана грантом РНФ #20-45-08003.
дифференциальная экспрессия микрорнк в условиях модели церебральной ишемии у крыс при использовании контралатерального полушария в качестве контроля: избыточные и упущенные результаты
И.В. Мозговой1, И.Б. Филиппенков1, Ю.А. Ремизова1, В.В. Ставчанский1, А.Е. Денисова2, Л.В. Губский2, 3, С.А. Лимборская1, Л.В. Дергунова1
1 ФГБУ Институт молекулярной генетики НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
3 ФГБУ Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ишемический инсульт, tMCAO, ипсилате-ральное полушарие мозга, контралатеральное полушарие мозга, транкриптомика, RNA-Seq, микроРНК, микроРНК-мРНК взаимодействия.
Ишемический инсульт — одно из наиболее значимых заболеваний, нарушающих функции мозга. Изучение роли микроРНК как молекул со значительным регуля-торным потенциалом позволяет составить более полное представление о молекулярном патогенезе инсульта. Подобные исследования обычно проводят на моделях животных, и особое значение имеет интерпретация получаемых данных в приложении к клинике. Часто для изучения процессов, протекающих в ипсилатеральном полушарии (ИП) мозга, в качестве контроля используют контралатеральное полушарие (КП) [1, 2]. Однако показано, что после инсульта в КП могут протекать процессы (распространяющаяся депрессия/деполяризация, трансполушарный диашиз), отражающиеся на профиле экспрессии генов. В этой связи рациональной альтернативой КП является использование в качестве контроля образцов мозга ложнооперированных (ЛО) животных.
В данной работе с помощью RNA-Seq был исследован профиль экспрессии микроРНК в подкорковых структурах мозга крыс через 24 ч после обратимой окклюзии правой средней мозговой артерии (tMCAO), выполненной под контролем магнитно-резонансной томографии. Мы проанализировали серию образцов из ИП, КП ишемизированных крыс и правого полушария мозга ЛО животных.
В результате, из 768 аннотированных микроРНК, 26 и 29 оказались дифференциально экспрессирован-ными (ДЭМ) в ИП относительно КП и ЛО соответственно (кратность>1,5; Padj < 0,05). Только 16 ДЭМ оказались общими для обоих сравнений и могли отражать эффект ишемии в ИП вне зависимости от выбора контролей. При этом 1 0 ДЭМ были уникальными для сравнения с КП и 13 ДЭМ — с ЛО. Эти ДЭМ могли представлять
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
