CC BY
68
frequencies in the Dutch Caucasian population. Hum. Immunol. 2006; 67: 756-63.
52. Rajalingam R., Ge P., Reed E.F. A sequencing-based typing method for HLA-DQA1 alleles. Hum. Immunol. 2004; 65: 373-9.
53. Dunn P.P., Day S., Williams S., Bendukidze N. HLA-DQB1 sequencing-based typing using newly identified conserved nucleotide sequences in introns 1 and 2. Tissue Antigens. 2005; 66: 99-106.
54. Kruskal J.B. Nonmetric multidimensional scaling: a numerical method. Psychometrika. 1964; 29: 115-29.
55. Johansson A., Ingman M., Mack S.J., Erlich H., Gyllensten U. Genetic origin of the Swedish Sami inferred from HLA class I and class II allele frequencies. Eur. J. Hum. Genet. 2008; 16(11): 1341-9.
56. Marsh S.G.E., Albert E.D., Bodmer W.F. et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2010. Tissue Antigens. 2010; 75: 291-455.
57. Kuranov A.B., Mukhamedyarov D.A., Momynaliev K.T. Identification of new HLA-DRB1 alleles in Kazakh individuals. Tissue Antigens. 2011; 77(3): 263-4.
58. Acland A., Agarwala R., Barrett T. et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 7-17.
59. Jinam T.A., Saitou N., Edo J., Mahmood A., Phipps M.E. Molecular analysis of HLA Class I and Class II genes in four indigenous Malaysian populations. Tissue Antigens. 2010; 75 (2): 151-8.
60. Boldyreva M.N. HLA (class II) and Natural Selection. "Functional" Genotype Hypothesis and Advantages of "Functional" Heterozygosity. [HLA (klass II) i estestvennyy ot-bor. "Funktsional'nyy" genotip, gipoteza, preimushchestva "funktsional'noy" geterozigotnosti]: Diss. Moscow; 2007. (in Russian)
61. Berezina G. M., Svyatova G. S., Makhmutova Zh. "The analysis of the genetic structure of the Kazakh population as estimated from mitochondrial DNA polymorphism. Med. Hlth Sci. J. (MHSJ). 2011; 6: 2-6.
62. Balanovsky O., Rootsi S., Pshenichnov A., Kivisild T., Churn-osov M. et al. Two sources of the Russian patrilineal heritage in their Eurasian context. Am. J. Hum. Genet. 2008; 82: 236-50.
63. Dulik M.C., Osipova L.P., Schurr T.G. Y-chromosome variation in Altaian kazakhs reveals a common paternal gene pool for Kazakhs and the influence of mongolian expansions. PLoS One. 2011; 6: e17548.
64. Derenko M.V., Malyarchuk B.A., Voznyak M., Denisova G.A., Dambueva I.K. et al. Distribution of Genghis Khan descendants of male lineage in the northern Eurasian populations. Genetika. 2007; 43 (3): 422-6. (in Russian)
65. Derenko M., Malyarchuk B., Grzybowski T., Denisova G., Rogalla U. et al. Origin and post-glacial dispersal of mitochondrial DNA haplogroups C and D in northern Asia. PLoS One. 2010; 5(12): e15214.
66. Alexeev L.P. Petranji G. HLA in eight ethnic groups from the former USSR. In: Proceedings of the 11-th International Histo-compability Workshop and Conference .Oxford: Oxford University Press; 1991; vol. 1: 666- 73.
67. Chen R.B., Ye G.Y., Geng Z.C. et al. HLA polymorphism of the principal minority nationalities in mainland China. In: Tsuji K., Aizawa M., Sasazuki T., eds. HLA 1991: Proceedings of the 11th International Histocompatibility Workshop Conference. Oxford: Oxford University Press: 1992; vol 1: 676-9.
68. Shen C.M., Zhu B.F., Deng Y.J., Ye S.H., Yan J.W. et al. Allele polymorphism and haplotype diversity of HLA-A, -B and -DRB1 loci in sequence-based typing for Chinese Uyghur ethnic group. PLoS One. 2010; 5(11): e13458.
Received 05.10.14
клеточная иммунология
© ЖЕРЕБЯтьЕБ а. с., КАМЫшнЫЙ а. М., 2015 УдК 616.34-002-018.1-092:612.017.1]-085.275.4-092.9
Жеребятьев А. С., Камышный А. М.
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОБКИ Т-ЛИМФОЦИТОБ И ПАТТЕРН-РАСПОЗНАЮЩИЕ РЕЦЕПТОРЫ — ЭКСПРЕССИЯ ЛИМФОЦИТАМИ КИШЕЧНИКА ПРИ ОКСАЗОЛОНОБОМ КОЛИТЕ У КРЫС И ПОСЛЕ ББЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРА 3-ГИДРОКСИ-3-МЕТИЛГЛУТАРИЛ КОЭНЗИМ А-РЕДУКТАЗЫ И АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРОБ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1
Запорожский государственный медицинский университет, 69035, Запорожье, Украина
Мы изучили возможность применения симвастатина и антагониста рецепторов интерлейкина-1 (АРИЛ-1)для коррекции экспериментального колита у крыс с акцентом на исследование экспрессии TLR2, TLR4, NOD2, RIG-I и транскрипционных факторов T-bet, GATA-3, RORyt и Foxp3 лимфоцитами толстой кишки. Иммунопозитив-ные лимфоциты были идентифицированы с помощью метода прямой и непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител крысы. Симвастатин и АРИЛ-1 благоприятно влияют на исход и течение оксазолониндуцированного колита через модулирование экспрессии образраспознающих рецепторов на лимфоцитах и баланса между различными субпопуляциями Т-хелперов толстой кишки.
Ключевые слова: копит; образраспознающие рецепторы; антагонист рецепторов интерлейкина-1 (АРИЛ-1); симвастатин.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 139-144.
Для корреспонденции: Жеребятьев Александр Сергеевич, [email protected] For correspondence: Zherebiatiev Aleksandr Sergeevich, [email protected]
Zherebiatiev A. S., Kamyshnyi A. M.
TRANSCRIPTIONAL REGULATORS OF T-LYMPHOCYTE DIFFERENTIATION AND PATTERN RECOGNITION RECEPTORS — EXPRESSION BY LYMPHOCYTES IN THE INTESTINE IN EXPERIMENTAL OXAZOLONE-INDUCED COLITIS IN RATS AND AFTER ADMINISTRATION OF INHIBITOR OF 3-HYDROXY-3-METHYLGLUTARYL COENZYME A REDUCTASE AND ANTAGONIST OF RECEPTORS OF INTERLEUKIN-1
Zaporozhye State Medical University, 69035, Zaporozhye, Ukraine
We studied the possibility of simvastatin and antagonist of receptors of interleukin-1 for correction of experimental colitis in rats with a focus on the expression studies of TLR2, TLR4, NOD2, RIG-I and transcription factors T-bet, GATA-3, RORYt and Foxp3 with lymphocytes of colon. The immunopositive lymphocytes were determined using a direct and indirect immunofluorescence technique with using a monoclonal rat antibody. Simvastatin and antagonist of receptors of interleukin-1 seemed to be beneficial in oxazolone-induced rat colitis model through modulate pattern recognition receptors expression on lymphocytes and balance between different T-helper cell subsets of colon.
Keywords: colitis; pattern recognition receptors; antagonist of receptors of interleukin-1 (ARIL-1); simvastatin.
citation: Immunologiya. 2015; 36(3): 139-144. (in Russian)
введение. Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о прогрессивном росте уровя заболеваемости воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) в разных стран мира, точные механизмы развития этих заболеваний остаются предметом дискуссии [1]. Кишечный барьер состоит из бактериальной биопленки, слизи, клеток эпителия и кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ). Дисфункция этого комплекса создает предпосылки развития воспалительного процесса в кишечнике. В этом ведущую роль играют образраспознающие рецепторы (РЯЯ), которые распознают патогенассоциированные молекулярные образы микроорганизмов (РАМР). К ним относятся мембранные и эндосомальные ТоП-Нке-рецепторы (ТЬЯ), цитоплаз-матические NOD-Hke-рецепторы и сенсоры вирусных РНК — ЯЮ-Нке-рецепторы, сигнализация через которые закономерно приводит к активации адаптивной иммунной системы. Результаты многочисленных работ показывают, что в большинстве случаях воспаление слизистой оболочки кишечника связано с дисбалансом различных субпопуляций Т-хелперов (1Ъ) [2], из которых определенную роль в патофизиологии воспаления кишечника играют № типов 1 (ТЫ), 2 (ТЬ2) и 17 (ТЫ7), а также Т-регуляторные лимфоциты (Т^), основными регуляторами дифференцировки которых являются соответственно транскрипционные факторы Т-Ье^ GATA-3, RORyt и Foxp3 [3].
Химически индуцированные модели воспаления кишечника — наиболее часто применяющиеся модели ВЗК у животных. Хотя у них есть, как и у всех других моделей, в том числе и у генетических, свои ограничения, в целом они сходны по некоторым важным иммунологическим и гистологическим аспектам с ВЗК у человека. Интраректальное введение тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) или оксазолона является широкоизвестным способом индукции колита у животных [4-7]. TNBS и оксазолон рассматривают в качестве гаптенов, способных связываться с эндогенными протеинами в слизистой оболочке кишечника и вызывать местную иммунологическую реакцию, опосредованную активацией макрофагов, дендритных клеток и Т-лимфоцитов. Однако TNBS-индуцированный колит связан с преимущественной активацией ТЫ-опосредованного иммунного ответа, гиперпродукцией зависимых от № цитокинов интерлейкина (ТЬ) 12, фактора некроза опухоли а и и интерферона- у (ШМу), которые приводят к инфильтрации и трансмуральному воспалению. Данная модель по своим клинико-морфологическим проявлениям соотносится с болезнью Крона у человека. В отличие от TNBS оксазолон вызывает колит, связанный с ТЬ2- и ШКТ-поляризованным типом Т-клеточного ответа и характеризуется повышенной выработкой ГЬ-4 и ГЬ-5, но нормальным уровнем ШМу. Оксазолоновый колит ограничивается дистальной частью толстой кишки в отличие от TNBS-колита, который характеризуется как панколит. Таким образом, на основании гистопатологических особенностей изменений в дистальном отделе толстой кишки оксазолоновый колит у грызунов имитирует язвенный колит у человека [4].
Важной задачей является поиск методов патогенетически обоснованной терапии ВЗК, в связи с этим вызывает особый интерес использование таких препаратов, как статины, иммуномодулирующие холестериннезависимые эффекты которых открыты совсем недавно. К ним относятся подавление экспрессии MHC II антиген-представляющими клетками, изменение активности Th и баланса продуцируемых ими цитокинов. Lee и соавт. продемонстрировали, что сим-вастатин подавляет экспрессию провоспалительных генов, блокируя передачу сигналов через NF-kB и ослабляет DSS-индуцированный острый колит у мышей. Некоторые авторы показали, что статины способствуют уменьшению воспаления при экспериментальной патологии как у животных [5], так и у пациентов с хроническим колитом [6]. В свою очередь применение антагонистов основных системных провоспали-тельных цитокинов IL-1a та ГЬ-ф оказалось эффективным при некоторых хронических воспалительных заболеваниях, а человеческий рекомбинантный IL-1ra (Anakinra) был одобрен в США для лечения ревматоидного артрита [7], однако высокая стоимость ограничивает широкое применение этого препарата и побуждает к поиску и изучению более дешевых аналогов. Поэтому мы обратили внимание на возможность применения антагониста рецепторов IL-1 (АРИЛ-1).
Цель исследования - изучить динамику распределения T-bet+, GATA-3+, RORyt+ и Foxp3+-клеток (Treg), а также особенностей экспрессии PRR — TLR2, TLR4, NOD2 и RIG-I - лимфоцитами толстой кишки как важных параметров иммунной системы, определяющих направление развития им-мунопатофизиологического процесса при экспериментальном колите у крыс, а также на фоне введения симвастатина и АРИЛ-1.
Материалы и методы
Исследования провоили на 40 самцах-крысах линии Ви-стар массой 110-1б0 г. Экспериментальную часть работы выполняли в соответствии с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которых используют для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Животных разделили по 10 на четыре группы: 1-я группа - контроль; 2-я - с экспериментальной патологией - оксазолониндуцированным колитом (ОИК); 3-я - с ОИК, которым вводили симвастатин; 4-я - с ОИК, которым вводили АРИЛ-1 (производство ОАО «РЭСБИО», Санкт-Петербург, Россия). ОИК индуцировали на 7-е сутки после предварительной сенсибилизации однократным вну-триректальным введением 0,1 % раствора оксазолона (Sigma, США) в дозе 10 мг на 1 животное под кетаминовым наркозом. Предварительную сенсибилизацию осуществляли нанесением на предварительно выбритый участок кожи животного 0,2 мл 3% сенсибилизирующего раствора, состоящего из смеси ацетона, оливкового масла и оксазолона [8]. Симвастатин вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг через 24 ч после индукции колита в течение 5 дней. АРИЛ-1 вводили подкожно в дозе 3 мг/кг через 24 ч после индукции колита в течение
5 дней. Животных выводили из эксперимента декапитирова-нием под наркозом. Изымали участки толстой кишки и на 20 ч погружали в фиксатор Буэна.
Структуру популяции T-bet, -GATA-3, -Foxp3, -RORyt, -TLR2, -TLR4, -NOD2 и RIGI иммунопозитивных лимфоцитов (T-bet+, GATA-3+, Foxp3+, RORyt+, TLR2+, TLR4+, NOD2+, RIGI+) - изучали на основании анализа серийных гистологических срезов и данных их морфометрических и денситоме-трических характеристик. Для проведения данного исследования на ротационном микротоме MICROM HR-360 (Microm, Германия) делали 5-микронные серийные срезы кишечника, которые затем депарафинировали в ксилоле, проводили ре-гидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100, 96, 70%), отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и инкубировали с первичными моноклональными антителами (АТ) к T-bet, GATA-3, Foxp3, ROR, NOD2 или RIGI (SantaCrusBio-tech, США). После этого срезы инкубировали с вторичными АТ, конъюгированными с флюоресцеином изотиоционатом (FITC) в течение 18 ч во влажной камере при t 4°С. Либо инкубировали срезы с АТ к TLR-2 и TLR-4 (HycultBiotech, Нидерланды), конъюгированными с FITC в течение 18 ч во влажной камере при t 4оС. После инкубации все срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и помещали в смеси глицерина и фосфатного буфера (1:9) для последующей люминесцентной микроскопии. Обработанные гистологические срезы изучали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Изображение, получаемое на микроскопе Primo Star (Zeiss, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм (FITC) с помощью высокочувствительной камеры Axio Cam 5c (ZEISS, Германия), и пакета программ для получения, архивирования и подготовки изображений к публикации Axio Vision 4.7.2 (ZEISS, Германия) немедленно вводили в компьютер. При этом в автоматическом режиме определяли области со статистически значимой флюоресценцией, характерной для лимфоидных клеток, которые экспрессиру-ют рецепторы. Вычисляли морфометрические и денситоме-трические характеристики иммунопозитивных клеток. При окраске АТ исследовали иммунопозитивные лимфоциты, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки (LAM PR) и подслизистой основе (TELA SUBM) толстой кишки. Окрашенные гематоксилином и эозином срезы использовали для морфологической верификации колита с использованием критериев, специально описанных S. Wirtz и соавт. [8] для химически индуцированных ВЗК (табл. 1). При этом для всех исследований срезы делали как с дистального отдела толстой кишки (зона локализации патологического процесса), так и с проксимального отдела, расположенного вдалеке от очага.
Все полученные экспериментальные данные обрабатывали на персональном компьютере с помощью пакета прикладных и статистических программ Excel из пакета MS Office 2010 (Microsoft Corp., США), Statistica 6.0 (Stat-Soft, 2001). Для всех показателей рассчитывали значение средней арифметической выборки (М), ее дисперсии и ошибки средней (m). Для выявления достоверности различий результатов исследований в опытных и контрольных группах животных устанавливали t-коэффициент Стьюдента, после чего определяли возможность разницы выборок (р) и доверительный интервал средней. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение. Развитие колита сопровождается макроскопическими изменениями в толстой кишке: отеком, гиперемией, множественными эрозиями и язвами. При гистологическом исследовании тканей, окрашенных гематоксилином и эозином, мы наблюдали признаки воспаления с инфильтрацией мононуклеарними клетками, в первую очередь лимфоцитами, моноцитами и плазматическими клетками, а также нейтрофилами и эозинофилами. Патологические изменения также включали гибель эпителиоцитов, укорочение и исчезновение кишечных крипт, утолщение стенки кишечника, уменьшение количества бокаловидных клеток и плотности желез. Воспаление располагалось в/под
Таблица 1
Балльная система подсчета гистологических изменений, ассоциированных с воспалением в толстой кишке
Балл
Гистологические изменения
0 Нет признаков воспаления
1 Низкий уровень воспаления с очаговой инфильтрацией мононуклеарными клетками (1-2 очага)
2 Умеренное воспаление с множественными очагами
3 Тяжелое воспаление с увеличением количества сосудов и явным утолщением стенки
4 Максимальная тяжесть воспаления с трансмуральной лейкоцитарной инфильтрацией и потерей бокаловидных клеток
Таблица 2
Результаты гистологических изменений, ассоциированных с воспалением в толстой кишке (М ± т)
Параметр Контроль (n = 10) Колит (n = 10) Симвастатин (n = 10) АРИЛ-1 (n = 10)
Балл 1,7 ± 0,2 2,7 ± 0,3 1,5 ± 0,2* 1,3 ± 0,2*
*p < 0,05.
эпителиальным слоем слизистой, хотя в некоторых случаях мышечный слой был инфильтрирован воспалительным клетками. Тяжесть этих повреждений уменьшилась у животных, получавших симвастатин и АРИЛ-1 (табл. 2).
Развитие ОИК сопровождалось изменением количества всех изучаемых иммунопозитивных клеток в дистальном отделе толстой кишки, за исключением количества NOD2+-лимфоцитов. Так, снизилось содержание RIGI+-лимфоцитов (в LAM PR на 17%; р < 0,05), T-bet+-лимфоцитов (в LAM PR на 23%; р < 0,05) и Foxp3+-лимфоцитов (в LAM PR на 16%, в TELA SUBM на 23%; р < 0,05), при этом повысился уровень ^К2+-лимфоцитов (в LAM PR на 39%, в TELA SUBM на 87%; р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов (в LAM PR на 30%, в TELA SUBM на 52%; р < 0,05), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 25%, в TELA SUBM на 30%; р < 0,05) и GATA-3+-лимфоцитов (в LAM PR на 38%, в TELA SUBM на 31%; р < 0,05) по сравнению с таковым у животных контрольной группы (см. рисунок б).
Иную ситуацию наблюдали при изучении распределения клеток в проксимальном отделе толстой кишки, вдалеке от очага патологического процесса, а именно однонаправленную тенденцию к снижению количества изучаемых иммунопозитивных клеток, за исключением количества RORyt+-лимфоцитов, которое не изменилось. Так, плотность популяции ^К2+-лимфоцитов уменьшилась на 26-31% (р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов - на 20-25% (р < 0,05), аналогичным образом снижалось количество клеток, экспресси-рующих цитоплазматические ПРР RIGI и NOD2 и транскрипционные регуляторы дифференцировки Т-хелперов (см. рисунок а). Данные изменения мы можем объяснить тем, что, как указано выше, в патологический процесс при оксазоло-новом колите вовлекается преимущественно дистальный отдел толстой кишки, а также возможным перераспределением и миграцией Т-лимфоцитов из проксимального в дистальный отдел толстой кишки при развитии ОИК.
Значение изменений уровня экспрессии TLR в развитии ВЗК показано в целом ряде исследований. В частности, K. Tanaka [9] при изучении экспрессии TLR в слизистой оболочке кишечника у пациентов с ВЗК обнаружил повышение уровня TLR-2 и TLR-4 в подвздошной кишке по сравнению с таковым у здоровых волонтеров. E. Cario [10] установила, что TLR-2 играет ключевую роль в поддержании целостности слизистой оболочки в модели повреждения эпителиального барьера кишечника у мышей. Между тем большинство работ, касающихся изменения экспрессии PRR в условиях
COLON DIST б
TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 Щ\ Колит (LAM PR) ЦЩ Колит (TELA SUBM)
COLON PR, LAM PR 6
TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3
COLON DIST, LAM PR д
TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 Контроль (LAM PR) -à- Контроль (TELA SUBM)
COLON PR, TELA SUBM 3
TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3
COLON DIST, TELA SUBM e
TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 K^J Колит+симв. астатин
TLR2 TLR4 RIG1 NOD2 Tbet GATA3 ROR Foxp3 I Колит+АРИЛ-1 - Колит
Суммарная плотность (количество на 1мм2) TLR2+, TLR4+, NOD2+, RIGI+, T-bet+, GATA-3+, RORyt+, Foxp3+ - клеток в собственной пластинке слизистой оболочки проксимального отдела толстого кишечника (COLON PR, LAM PR) и подслизистой основе проксимального отдела толстого кишечника (COLON PR, TELA SUBM) при развитии колита (а) и после введения симвастатина и АРИЛ-1 (в, г) экспериментальным животным; собственной пластинке слизистой оболочки дистального отдела толстого кишечника (COLON DIST, LAM PR); подслизистой основе дистального отдела толстого кишечника (COLON DIST, TELA SUBM) при развитии колита (б) и после введения симвастатина и АРИЛ-1, (д, е) эксперементальным животным.
ВЗК, касаются в основном эпителиального компартмента, а не лимфоидных клеток. В то же время прямая экспрессия PRR лимфоцитами влияет на их активацию, пролиферацию, выживание и продукцию цитокинов. Экспрессия практически всех известных TLR на CD4+ Т-клетках идентифицирована на уровне мРНК, а Myd88"'" CD4+ Т-клетки показали пониженную пролиферацию в ответ на активацию TLR, не смогли
продуцировать провоспалительные цитокины (IL-6, IL-17) и были не способны индуцировать колит. Стимуляция аго-нистами TLR2 способствует дифференцировке Th17 in vitro и приводит к пролиферации и продукции ^П-зависимых цитокинов, а сигнализация через TLR-4 влияет на функциональную активность Treg - введение LPS вызывает усиление их пролиферации и выживания in vitro и in vivo, а супрес-
сивная активность Treg повышается в 10 раз [11]. Поэтому обнаруженные нами изменения уровня экспрессии TLR-2- и TLR-4-лимфоцитами при ОИК может напрямую влиять на их функциональную активность. Также известно, что нарушение экспрессии цитоплазматических сенсоров РНК RIG-I приводит к серьезным повреждениям и воспалительной инфильтрации в слизистой оболочке кишки [12]. Увеличение экспрессии RLR в структурах КАЛТ может спровоцировать избыточную продукцию IFNy, что в свою очередь является одним из факторов риска развития ВЗК. Кроме того, изменение уровня экспрессии RLR способно оказывать влияние на баланс субпопуляций Th, воздействуя на уровень образования провоспалительных Th17- и ТЫ-клеток [13].
Довольно показательными оказались результаты изучения распределения исследуемых клеток в дистальном отделе толстой кишки при введении симвастатина и АРИЛ-1 экспериментальным животным. Мы наблюдали однонаправленную тенденцию к снижению количества изучаемых иммунопози-тивных клеток, при этом эффекты АРИЛ-1 были более выражены в отношении TLR2+-, TLR4+- и Foxp3+-лимфоцитов, а симвастатин более интенсивно снижал численность T-bet+- и ОАТА-3+-лимфоцитов (см. рисунок д, е).
Введение симвастатина животным с колитом привело к снижению в проксимальном отделе толстой кишки количества TLR2+-лимфоцитов (в LAM PR на 34%, в TELA SUBM на 30%; р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов (в LAM PR на 28%, в TELA SUBM на 30%; р < 0,05), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 29%, в TELA SUBM на 20%; р < 0,05) и повышению уровня RIGI+-лимфоцитов (в LAM PR на 33%, в TELA SUBM на 21%;р < 0,05), T-bet+-лимфоцитов (в TELA SUBM на 33%; р < 0,05)), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 29%, в TELA SUBM на 20%; (р < 0,05) (см. рисунок в, г). Введение АРИЛ-1 животным с колитом привело к снижению количества TLR2+-лимфоцитов (в LAM PR на 30%; р < 0,05), TLR4+-лимфоцитов (в LAM PR на 18%, в TELA SUBM на 20%; р < 0,05), NOD2+-лимфоцитов (в LAM PR на 21%, в TELA SUBM на 42%; р < 0,05), GATA-3+-лимфоцитов (в LAM PR на 27%; р < 0,05), RORyt+-лимфоцитов (в LAM PR на 47%, в TELA SUBM на 36%; р < 0,05) и повышению содержания T-bet+-лимфоцитов (в TELA SUBM на 33%;р < 0,05) (см. рисунок в, г).
Участие различных субпопуляций Th в иммунопатогене-зе ВЗК показано во многих исследованиях. Так, M. Neurath и соавт. [14] продемонстрировали аккумуляцию Т-клеток, экспрессирующих T-bet в собственной пластинке кишечника у пациентов с болезнью Крона, а также более высокую экспрессию T-bet в этих клетках. Перемещение дифференцированных Th17 в организм мышей с лимфопенией приводит к развитию колита. Эти данные доказывают, что ^П-клетки играют важную роль в патогенезе ВЗК, что подтверждается и нашими результатами по увеличению их количества. J. Dambacher и соавт. [15] показали, что пациенты с болезнью Крона имеют повышенный уровень IL-17A в слизистой оболочке кишечника, собственная пластинка содержит повышенное количество Th17, а фактор транскрипции RORyt экспрессирован на более высоких уровнях. K. Ohtani и соавт. [16] обнаружили значительное усиление экспрессии GATA-3 в слизистой оболочке кишечника у детей с этими заболеваниями, а F. Heller и соавт. [17] показали, что развитие оксазоло-нового колита ассоциировано со значительным увеличением экспрессии мРНК IL-5 и IL-13 - цитокинов Th2, в лимфоцитах кишечника.
Также следует отметить, что изучаемые нами транскрипционные факторы могут экспрессироваться помимо классических № и так называемыми врожденными лимфоидными клетками (innate lymphoid cells - ILCs), играющими важную роль в регулировании и поддержании кишечного гомеостаза [18]. ILCs могут быть сгруппированы c учетом их селективной зависимости от специфических факторов транскрипции, необходимых для их развития и функционирования, в настоящее время выделяют три их основные группы: T-bet+ ILCs (1-я группа), GATA3+ ILCs (2-я группа) и RORyt+ ILCs (3-я группа). ILCs играют важную роль в развитии и созре-
вании КАЛТ, формировании изолированных лимфоидных фолликулов (ILF) [19]. Интересно, что этот процесс зависит от наличия синантропных бактерий в кишечнике, предполагают, что полученные от бактерий сигналы способствуют ILC-опосредованному образованию и созреванию вторичных лимфоидных структур в кишечнике. Кроме того, 3-я группа ILCs также способствует восстановлению архитектоники вторичных лимфоидных органов вследствие нарушения го-меостаза иммунных клеток вирусными или патогенными бактериальными инфекциями. Секреция ILCs3-клетками IL-22 играет роль в снижении проницаемости кишечного эпителия и анатомическом сдерживании конкретных видов синантропных бактерий, а срыв этого пути приводит к транслокации и распространению бактерий в периферических тканях и началу провоспалительного ответа с участием клеток адаптивной иммунной системы [20]. Показано снижение уровня IL-22-продуцирующих NCR+RORyt+ ILCs3-клеток и реципрокное увеличение количества IFNy-продуцирующих ILCl-клеток в толстой и подвздошной кишке у пациентов с болезнью Крона относительно аналогичных показателей у здоровых пациентов контрольной группы [21], предопределяя гипотезу, что баланс между lFNy-продуцирующими и ILCs22-продуцирующими ILC-клетками может влиять на тяжесть воспаления кишечника, оказывая воздействие на проницаемость кишечника и его репарацию. Powrie и соавт. (2011) установили увеличение экспрессии генов Th17-ассоциированных цитокинов IL17A и IL17F в CD3--клетках кишечной ткани у пациентов с болезнью Крона [22]. Результаты этих исследований подчеркивают необходимость лучшего понимания того, как ILcs регулируют адаптивный иммунитет с целью разработки новых терапевтических стратегий, направленных на лечение заболеваний, которые обусловлены неадекватными воспалительными реакциями на синан-тропную микрофлору, аллергены или аутоантигены. Таким образом, развитие и прогрессирование ВЗК могут быть связаны не только с изменением уровня экспрессии PRR и дисбалансом адаптивных субпопуляций Th1, Th2, Th17 и Treg, но и с распределением в КАЛТ врожденных T-bet+, GATA3+ и RORyt+ -лимфоцитов.
F. Heller и соавт. в своем исследовании описывают окса-золоновую модель колита как опосредованную Th2- и NKT-клетками, которые продуцируют IL-13. Секреция IL-13 мо-нонуклеарными клетками собственной пластинки слизистой оболочки кишечника повышается при оксазолоновом колите и имеет большое значение в индукции патологии [23]. Это наблюдали также и в других экспериментальных моделях воспаления, опосредованного Th2 [24]. Мыши, обработанные IL-13Ra2-Fc (АТ, нейтрализующие IL-13), были защищены от индукции оксазолонового колита [25]. Кроме того, цито-кин IL-13, а также IL-4 могут привести к нарушению плотных контактов между эпителиальными клетками, что в свою очередь способствует инвазии бактерий. Таким образом, воспаление при язвенном колите, как правило, начинается в дис-тальных отделах толстой кишки, где бактериальная нагрузка является наиболее высокой и где нарушение регуляции иммунного ответа может привести к стимуляции NNKT-клеток антигенпрезентирующими клетками, экспрессирующими CD1d. IL-13 секретируется активированными NKT- клетками и может способствовать распространению воспаления на соседние ткани, вызывая повреждение эпителиального барьера в этом регионе. Эти данные показывают, что CD4+ NKT-клетки, продуцирующие IL-13, наряду с Th2 способствуют прогрессированию колита, который напоминает язвенный колит у человека. Эта модель воспаления может быть эффективно заблокирована нейтрализацией IL-13, истощением или ингибированием активации NKT-клеток через CD1d, что может представлять возможный вариант лечения данного заболевания. Характерно, что наши результаты демонстрируют увеличение численности GATA-3+-лимфоцитов при развитии ОИК, что подтверждает его №2-зависимый генез. Кроме того, транскрипционный фактор GATA-3 в процессе своей дифференцировки могут экспрессировать и NKT-клетки.
Тем не менее одновременное увеличение субпопуляции про-воспалительных RORyt+-лимфоцитов и снижение супрессор-ных РохрЗ-клеток могут свидетельствовать также и о важной роли дисбаланса содержания Th17/Treg в механизмах развития колита. Снижение уровня провоспалительной сигнализации в кишечнике с помощью АРИЛ-1 и симвастатина дает положительный эффект на характер прогрессии ОИК.
выводы. 1. При развитии экспериментального ОИК колита увеличивается количество лимфоцитов, экспрессирую-щих мембранные ПРР TLR2 и TLR4, что приводит к накоплению в собственной пластинке слизистой оболочки и подсли-зистой основе дистального отдела толстой кишки RORyt+- и GATA-3+-лимфоцитов, при этом плотность RIGI+-, T-bet+- и супрессорных Рохр3+-лимфоцитов снижается.
2. Введение симвастатина и АРИЛ-1 на фоне развития колита снижало уровень активации как мембранных, так и ци-топлазматических рецепторов врожденного иммунитета, что закономерно уменьшало аккумуляцию Th в толстой кишке.
литература (references)
1. Sartor R. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2006; 3 (7): 390-407.
2. Chao K., Zhong B., Zhang S., Gong X., Yao J., Chen M. Imbalance of CD4(+) T cell subgroups in ulcerative colitis. Zhonghua. Yi Xue Za Zhi. 2011; 91(23): 1605-8.
3. Izcue A., Coombes J., Powrie F. Regulatory T cells suppress systemic and mucosal immune activation to control intestinal inflammation. Immunol. Rev. 2006; 212: 256-71.
4. Randhawa P., Singh K., Singh N., Jaggi A. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Korean J. Physiol. Pharmacol. 2014; 18 (4): 279-88.
5. Leung B., Sattar N., Crilly A., Prach M., McCarey D., Payne H. et al. A novel anti-inflammatory role for simvastatin in inflammatory arthritis. J. Immunol. 2003; 170 (3): 1524-30.
6. Grip O., Janciauskiene S. Atorvastatin reduces plasma levels of chemokine (CXCL10) in patients with Crohn's disease. PLoS One. 2009; 4 (5): 5263.
7. Thompson R., Dripps D., Eisenberg S. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) as a probe and as a treatment for IL-1 mediated disease. Int. J. Immunopharmacol. 1992; 14 (3): 475-80.
8. Wirtz S. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat. Protocols. 2007; 2(3): 541-6.
9. Tanaka K. Expression of Toll-like receptors in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bowel disease. Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2008; 2(2): 193-6.
10. Cario E. Barrier-protective function of intestinal epithelial Tolllike receptor 2. Mucosal Immunol. 2008; 1: 62-6.
11. Reynolds J., Pappu B., Peng J., Martinez G., Zhang Y., Chung Y. et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 2010; 32(5): 692-702.
12. Wang X., Li M., Zheng H., Muster T., Palese P., Beg A. et al. Influenza A virus NS1 protein prevents activation of NF-kappaB and induction of alpha/beta interferon. J. Virol. 2000; 74(24): 11566-73.
13. Negishi H., Yanai H., Nakajima A., Koshiba R., Atarashi K., Matsuda A. et al. Cross-interference of RLR and TLR signaling pathways modulates antibacterial T cell responses. Nat. Immunol. 2012; 13(7): 659-66.
14. Neurath M., Weigmann B., Finotto S., Glickman J., Nieuwenhuis E., Iijima H. et al. The transcription factor T-bet regulates mucosal T cell activation in experimental colitis and Crohn's disease. J. Exp. Med. 2002; 195(9): 1129-43.
15. Dambacher J., Beigel F., Zitzmann K., De Toni E., Göke B., Diepolder H. et al. The role of the novel Th17 cytokine IL-26 in intestinal inflammation. Gut. 2009; 58(9): 1207-17.
16. Ohtani K., Ohtsuka Y., Ikuse T., Baba Y., Yamakawa Y., Aoyagi Y. et al. Increased mucosal expression of GATA-3 and STAT-4 in pediatric ulcerative colitis. Pediatr. Int. 2010; 52(4): 584-9.
17. Heller F., Fuss I., Nieuwenhuis E., Blumberg R. Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T cells. Immunity. 2002; 17: 629-38.
18. Spits H., Cupedo T. Innate lymphoid cells: emerging insights in development, lineage relationships, and function. Annu. Rev. Immunol. 2012; 30: 647-75.
19. Eberl G. Inducible lymphoid tissues in the adult gut: recapitulation of a fetal developmental pathway? Nat. Rev. Immunol. 2005; 5(5): 413-20.
20. Sonnenberg G., Monticelli L., Alenghat T., Fung T. Innate lymphoid cells promote anatomical containment of lymphoid-resident commensal bacteria. Science. 2012; 336 (6086): 1321-5.
21. Ciccia F., Accardo-Palumbo A., Alessandro R., Rizzo A., Principe S., Peralta S. et al. Interleukin-22 and interleukin-22-producing NKp44+ natural killer cells in subclinical gut inflammation in ankylosing spondylitis. Arthr. and Rheum. 2012; 64(6): 1869-78.
22. Geremia A., Arancibia-Carcamo C., Fleming M., Rust N., Singh B., Mortensen N. et al. IL-23-responsive innate lymphoid cells are increased in inflammatory bowel disease. J. Exp. Med. 2011; 208(6): 1127-33.
23. Heller F., Fuss I., Nieuwenhuis E., Blumberg R., Strober W. Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T cells. Immunity. 2002; 17(5): 629-38.
24. Minty A., Asselin S., Bensussan A., Shire D., Vita N., Vyakarnam A. et al. The related cytokines interleukin-13 and interleukin-4 are distinguished by differential production and differential effects on T lymphocytes. Eur. Cytokine Netw. 1997; 8(2): 203-13.
25. Donaldson D., Whitters M., Fitz L., Neben T., Finnerty H., Henderson S. et al. The murine IL-13 receptor alpha 2: molecular cloning, characterization, and comparison with murine IL-13 receptor alpha 1. J. Immunol. 1998; 161(5): 2317-24.
Поступила 18.11.14 Received 18.11.14
