CC BY
39
генетическая токсикология и генетически активные факторы среды
© о. А. кулаева, в. Е. цыганов
ГНУ Всероссийский научно — исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозака-демии, лаборатория молекулярной и клеточной биологии
& у гороха посевного описан мутант SGEcd1 (cdt), характеризующийся повышенным уровнем накопления кадмия и устойчивостью к данному тяжелому металлу, по сравнению с исходной линией. проведенный ранее SSAp анализ позволил локализовать локус cdt в vI группе сцепления гороха. для более подробного картирования локуса cdt были разработаны молекулярные маркеры, основанные на известных последовательностях генов гороха, выявленных с помощью анализа геномной микросинтении между горохом посевным и модельным бобовым Medicago truncatula. Было выявлено тесное сцепление локуса cdt и маркеров, разработанных на основе генов Pentatricopeptide repeat и Exosome complex exonuclease RRP45. таким образом, были созданы условия для дальнейшего позиционного клонирования гена cdt.
& ключевые слова: генетический анализ устойчивости к кадмию; локализация генов; SNP (Single Nucleotide Polymorphism) маркеры; CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) маркеры; Pisum sativum L.
Поступила в редакцию 14.11.2011. Принята к публикации 10.02.2012
УДК 575.1/.2:574.2
точная локализация мутации по локусу cdt, приводящей к повышенной устойчивости
гороха (pisum sativum l.) к кадмию
ВВЕДЕНИЕ
Кадмий является одним из наиболее токсичных тяжелых металлов. Соли кадмия хорошо растворяются в воде и могут быть легко поглощены растениями. Передача кадмия по пищевым цепям вызывает серьезные нарушения у многих живых организмов (Sanita di Toppi, Gabbrielli, 1999), поэтому исследование механизмов устойчивости к кадмию является крайне актуальной задачей. Для выявления системы генетического контроля аккумуляции и устойчивости растений к тяжелым металлам используются два подхода: анализ варьирования данных признаков в природных популяциях и экспериментальный мутагенез (Кулаева, Цыганов, 2010).
Генетический анализ популяций ряда высших растений выявил широкий полиморфизм по признакам устойчивости к кадмию и его аккумуляции (Кулаева, Цыганов, 2010).
К настоящему времени описано несколько мутантов с измененной чувствительностью или аккумуляцией тяжелых металлов (Кулаева, Цыганов, 2010). У Arabidopsis thaliana выявлено два мутанта чувствительных к кадмию: cadi и cad2, мутантный фенотип которых возникает вследствие нарушений в работе фитохелатинсинтазы (Howden et al., 1995, Ha et al., 1999) и у-глутамилцистеинсинтетазы (Cobbett et al., 1998). Данные ферменты играют ключевую роль в синтезе фитохелатинов и, соответственно, в процессах детоксикации кадмия в растительной клетке. Корневая система мутанта A. thaliana MRC-22 также является чувствительной к действию кадмия (Watanabe et al., 2010). Лишь совсем недавно получены мутанты A. thaliana, устойчивые к кадмию (Watanabe et al., 2010). У мутанта cdr3-1D показано сниженное содержание кадмия в тканях, вследствие усиленной работы переносчика AtPDR8/AtPDR12, переносящего кадмий из вакуоли. У мутанта MRC-26 наблюдается сниженное содержание кадмия в побего-вой части, вследствие нарушенного транспорта кадмия из корней в побег. Предполагается, что устойчивость мутанта MRC-32 связана с измененным содержанием фитохелатинов. К настоящему моменту природа данных мутаций не выявлена (Watanabe et al., 2010).
Ранее нами был описан новый мутант гороха, полученный после ЭМС-мутагенеза линии SGE, характеризующийся повышенными накоплением кадмия в биомассе растений и устойчивостью к токсичным концентрациям кадмия (Tsyganov et al., 2007). Мутация SGECdt характеризуется моногенным рецессивным характером наследования. Биохимический анализ маркеров стресса ((хитиназа, пероксидаза и пролин) (Sharma, Dietz, 2006, Graham, Sticklen, 1993)) показал, что у данного мутанта снижен уровень стрессового ответа на действие кадмия (Tsyganov et al., 2007). Выявлено, что устойчивость мутанта SGECdt к кадмию не связана с процессами синтеза глутатиона и работой фитохелатинсинтазы. Таким образом, этот мутант аккумулирует кадмий, является устойчивым к его токсическому действию и представляет собой новую и уникальную модель для изучения адаптации
генетическая токсикология и генетически активные факторы среды
39
растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов (Tsyganov et а1., 2007). Мутация cdt была локализована нами в VI группе сцепления гороха (Цыганов и др., 2012). В данном исследовании нами проведена точная локализация мутации по локусу cdt на генетической карте гороха.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный материал
В работе были использованы мутант гороха посевного SGECdt из коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Tsyganov et а1., 2007) и линия Л281 из коллекции Центра Джона Иннеса (Норвич, Великобритания).
условия вегетации растений
Для проведения анализа признака устойчивости к кадмию растения выращивались в режиме чередования день/ночь 16/8 ч, при температуре 21 °С, относительной влажности 75 % и освещенности 38 тыс. люкс в условиях гидропоники с аэрацией. Перед посадкой семена стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 30 мин, затем промывали дистиллированной водой 6 раз.
Раствор хлорида кадмия определенной концентрации (12 мкМ CdCl2 ) добавляли в сосуды с питательной средой (Tsyganov et а1., 2007) к пятидневным проросткам гороха.
Гибридологический анализ
Для картирования локуса cdt линия гороха Л281 была скрещена с мутантной линией SGECdt. Чистоту скрещиваний в поколении F1 контролировали с использованием разработанных молекулярных маркеров. Соответствие реальных расщеплений теоретическим в поколении F2 рассчитывали с помощью критерия х2.
Анализ совместного наследования локуса cdt и молекулярных маркеров был проведен с использованием компьютерной программы РЬАОТ (С. М. Розов, Институт цитологии и генетики СО РАН). Построение генетической карты района локализации локуса cdt проводили с помощью программы А^Мар (Iwata, Ninomiya, 2006).
Были проанализированы две независимые популяции F2. Анализ поколения F2 представляет собой определенную сложность, так как велика вероятность получения недостоверных результатов, связанная с неравномерным прорастанием семян, и, как следствие, проявление различий в развитии проростков, что может влиять на их устойчивость к кадмию. Таким образом, в начале исследований, расщепление по признаку устойчивости к кадмию было проанализировано в поколении F3. После подбора условий эксперимента, позволяющих нивелировать вышеописанные сложности, расщепление по признаку устойчивости к кадмию во второй популяции было проанализировано в поколении F2. Расщепление по молекулярным маркерам было проанализировано
в поколении F2 для обеих популяций. Расщепление по признаку устойчивости к кадмию проводилось в условиях гидропоники с аэрацией с использованием 12 мкМ хлорида кадмия.
Дизайн молекулярных маркеров и условия ПЦР
Геномная ДНК была выделена из 30 мг свежих листьев с использованием стандартной методики (Dellaporta, Wood, 1983) и стеклянных шариков диаметром 2 мм (Sigma Aldrich, США), использовавшихся в качестве разрушающего агента. Для проведения каждой ПЦР было использовано 100 нг растительной ДНК. Праймеры для создания ПЦР-маркеров были синтезированы компаниями Евроген (http://evrogen. ru) и Бигль (http://www.biobeagle.com). Было разработано два типа маркеров: маркеры, основанные на аллель-специфичной ПЦР и маркеры, основанные на аллель-специфичной рестрикции продуктов ПЦР (табл. 1, 2). Праймеры были подобраны таким способом, чтобы амплифицировать участок соответствующего гена, содержащий хотя бы один интрон. Сек-венирование аллелей исследуемых генов проводилось с использованием автоматического секвенатора CEQ 8000 (Beckman Coulter, США). ПЦР проводилась с использованием амплификатора C1000 Thermal Cycler, (BioRad, США). Реакционная смесь содержала 2,5 мМ MgCl2, 0,125 мМ каждого из дезоксирибонук-леотидов, 1 единицу Taq полимеразы (Силекс, Россия) и 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Условия проведения ПЦР (оптимизировались для каждой пары используемых праймеров): начальная денатурация ДНК (94 °С — 5 мин), 30 циклов амплификации: денатурация (94 °С — 30 с), отжиг праймеров (температура отжига праймеров подбиралась на основе свойств пары конкретных олигонуклеотидов и варьировала в пределах 56-65 °С — 30 с), синтез ДНК (72 °С — 40 с), окончание синтеза ДНК (72 °С — 10 мин). Для создания ген-специфичных молекулярных маркеров типа CAPS использовались эндонуклеазы рестрикции, опознающие специфическую последовательность нук-леотидов. Для анализа первичных последовательностей родительских аллелей маркеров с целью подбора подходящих для анализа рестриктаз была использована программа dCAPS Finder 2.0 (Neff et al., 2002; http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html). Рестрикци-онный анализ проводился в объеме 10 мкл с использованием 5 мкл продуктов амплификации и 1 единицы соответствующей рестриктазы при температуре 37°С в течение ночи. Фрагменты амплификации и продукты рестрикции разделяли с использованием системы автоматического электрофореза MultiNA (Shimadzu, Япония) и электрофоретически в 2 %-м агарозном геле в 0,5-кратном трис-ацетатном буфере (пример анализа с использованием системы автоматического электрофореза MultiNA представлен на рисунке 2).
Таблица 1
маркеры, основанные на аллель-специфичной пцр
Маркер Прямой и обратный праймеры 5'-3' Температура отжига, °С Продукт, кодируемый соответствующим геном Источник последователь ности в GeneBank ПЦР, специфичная для линии
Psknlß GTGGTGGCCTATGTCCTCC AACTGCATCACCACCCATTCTA 57 Pisum sativum knotted1 like class I homeodomain protein AF080104 SGECdt
GTGGTGGCCTATGTCCTCC AACTGCATCACCACCCATTCTC 68 JI 281
HptB CCGCAACTTCTGCGAGGAAC TGTTCTTCTACGCCTGAATTTC 65 Pisum sativum mRNA for putative His Asp phospho-transfer protein AJ831475 SGECdt
CCGCAACTTCTGCGAGGAAC TGTTCTTCTACGCCTGAATTTT 65 JI 281
SUS3 (Aubert et al, 2006) GCCTGCATTCCGAAACCAACG GATGCGTTTGAGCATCTCCTC 62 Pisum sativum mRNA for sucrose synthase isoform 3 AJ311496 JI 281
HMA3 AATGGCCAGACATATATACGATG CAACMGGTGTGGAKAGGATAAGA 65 Heavy metal ATPase 3 * SGECdt
AATGGCCAGACATATATACGATT CAACMGGTGTGGAKAGGATAAGA 66 JI 281
Символом * отмечены гены, последовательности которых не известны для гороха посевного
Таблица 2
маркеры, основанные на аллель-специфичной рестрикции продуктов пцр
Маркер Прямой и обратный праймеры 5'-3' Температура отжига, °С Рестриктаза Продукт, кодируемый соответствущим геном Источник последователь ности в GeneBank Рестриктаза, специфичная для линии
S27E TTGTTAAACCCACCAGCTGAG CGCACACCACAACAGTTTGAG 58 MnlI Ribosomal protein S27E * JI 281
IF TCCTCCGCCACTTCCAAACC TCCATTTCCCACCATTAGCACA 58 HhaI Pisum sativum eukaryotic translation initiation factor 4E DQ641471 JI281
P450 AACACAARAATCTCCGCCGTC ACCGCTYGCGTGTACTTCATC 58 HpaII Cytochrome P450 * SGECdt
GH TTYACRGATCGGTCAGGACAG ACCGCTYGCGTGTACTTCATC 58 AluI Glycoside hy-drolase * SGECdt
AAA CTGCRGACACKGTAAACACTGT GGTCAGGAGCMAGTTGAAGCA 58 Csp6I Arabidopsis thaliana AAA type ATPase family protein * JI281
PTAC GGAAYTGGAGAAAGCCGGAGA TCAYGGTTGGRTAAACTGGATC 59 SalI Arabidopsis thaliana plastid transcriptionally active 12 * SGECdt
PTP TCCGTTGGACAKCCCAACAAC TTCCACYCTCCCTTTCTCACA 56 TspEI Pentatrico pep-tide repeat * JI281
EX CTGATCCCTCCTTTGAGCCTG GACSGCAAYTGGAAGATGATGT 60 MboII Exosome complex exonuclease RRP45 * JI281
Символом * отмечены гены, последовательности которых не известны для гороха посевного
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ устойчивости мутанта SGECd' и линии JI281 к различным концентрациям хлорида кадмия Так как различные линии гороха посевного могут значительно отличаться по признаку устойчивости к кадмию (Belimov et al., 2003), развитие корневых систем мутанта SGECdt и линии JI281 было проанализировано при выращивании в присутствии различных концентраций хлорида кадмия. В результате была выбрана концентрация 12 мкМ CdCl2, при добавлении которой к пятидневным проросткам гороха растения мутанта SGECdt продолжали нормально развиваться, в то время как рост корневой системы линии JI281 останавливался (рис. 1). Данная концентрация была использована при анализе расщепления поколений F2 и F3 по признаку устойчивости к кадмию.
Анализ расщепления по фенотипу популяций F2 и F3, полученных от скрещивания мутанта SGECd' и линии JI281
Был проведен анализ признака устойчивости к кадмию в первой популяции F3, полученной от скрещивания мутанта SGECdt и линии JI281. При этом были выявлены семьи устойчивые, неустойчивые и семьи, где встречались как устойчивые так и неустойчивые растения, соответствующие в поколении F2 соответственно растениям с генотипом рецессивных гомозигот cdt/cdt, доминантных гомозигот Cdt/Cdt и гетерозигот cdt/Cdt.
Анализ совместного наследования признака устойчивости к кадмию и молекулярных маркеров
Исходя из первоначальной локализации мутации cdt в VI группе сцепления и на основе последовательностей известных генов гороха (Aubert et al., 2006; Kalo et al., 2004; Ellis, Poyser, 2002) были разработаны маркеры Psknl6, HptB, SUS3. Был проведен анализ совместного наследования признака устойчивости к кадмию и разработанных молекулярных маркеров. Результаты анализа представлены в таблице 3.
Основываясь на полученных данных, был проведен анализ микросинтении геномов P. sativum и M. truncatula. Был выявлен регион второй группы сцепления M. truncatula, в пределах которого расположен предполагаемый ортолог локуса cdt, при этом было установлено, что данный регион инвертирован относительно гомологичной области у P. sativum.
С использованием ресурса arabidopsis.org были отобраны различные гены A. thaliana, экспрессия которых изменяется при действии тяжелых металлов. Последовательности данных генов были подвергнуты BLAST-анализу для выбора тех генов, для которых гомологичные последовательности у M. truncatula располагались в выявленном ранее районе второй группы сцепления. Последовательности данных генов были использованы для разработки новых маркеров: HMA3, S27E, IF4E и GH. Результат анализа совместного насле-
Рис 1. Корневые системы растений мутанта БОЕС^ и линии Л281, выросших в питательном растворе с добавлением 12 мкМ хлорида кадмия
Рис 2. Фрагмент анализа расщепления F2 (Л281 х БОЕС^) по молекулярному маркеру IF4E с использованием системы автоматического электрофореза Ми1ША. Пояснения к рисунку 2. БОЕС^, растения 7, 10, 15, 17 — рецессивные гомозиготы; Л 281, растения 3, 4, 5, 21 — доминантные гомозиготы; растения 6, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20 — гетерозиготы по полиморфному локусу гена Ш4Е
дования признака устойчивости к кадмию и разработанных молекулярных маркеров представлен в таблице 4.
Для уточнения локализации локуса cdt и подтверждения полученных ранее данных был проведен анализ совместного наследования признака устойчивости к кадмию и разработанных молекулярных маркеров с использованием второй независимо полученной популяции поколения F2, полученной от скрещивания мутанта SGECdt и линии Л281. Также с использованием поколения F2 были проанализированы молекулярные
Рис 3. Генетическая карта района локализации локуса cdt
маркеры P450, PTP, AAA, P450, PTAC и EX, разработанные c целью детализации расположения локуса cdt. Результат анализа совместного наследования признака устойчивости к кадмию и разработанных молекулярных маркеров представлен в таблице 5.
В результате проведенных исследований было выявлено очень близкое сцепление признака устойчивости к кадмию и маркеров PTP и EX (рис. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Получение мутантов с интересующим фенотипом и последующая идентификация мутантного ло-куса является одним из наиболее распространенных подходов в изучении функций генов растений. По сравнению с ДНК-инсерционным или транспозон-опосредованным мутагенезом химический мутагенез имеет ряд преимуществ. Так, не для всех растительных видов известны надежные способы трансформации. Кроме того, для выявления мутантного фенотипа в случае химического мутагенеза требуется подвергнуть проверке в 20 раз меньше растений, чем при инсерционном мутагенезе. Инсерционный мутагенез чаще всего приводит к выключению функции гена, что может привести к летальности, в то время как при использовании химического мутагенеза могут возникать миссенс-мутации или нуклеотидные замены в области промотора, приводящие к изменению активности продукта, кодируемого соответствующим геном. Нам представляется, что активное использование экспериментального мутагенеза является перспективным, но все еще недостаточно востребованным методом для изучения механизмов детоксикации тяжелых металлов.
Таблица 5
Анализ расщепления по фенотипу растений поколений F2 от скрещивания линий JI281 и SGECd1
Пара маркеров AB AH Ab HB HH Hb aB aH ab Сцепление, сМ ± ст. ошибка Объединенный х2 p (9:3:3:1)
cdt-HptB 25 30 0 0 3 15 4,5 ± 2,53 58,3 0,0001
cdt-HMA3 15 26 9 2 6 11 28,1 ± 6,28 10,9 0,005
cdt-S27E 35 88 3 0 3 41 3,4 ± 1,42 140,3 0,0001
cdt-IF4E 36 89 1 0 0 44 0,56 ± 0,52 164,9 0,0001
cdt-AAA 35 89 2 0 0 44 1,1 ± 0,82 160,0 0,0001
cdt-P450 34 91 1 0 0 43 1,1 ± 0,82 159,7 0,0001
cdt-PTAC 35 89 1 0 0 44 0,56 ± 0,52 164,9 0,0001
cdt-PTP 36 90 0 0 0 44 2,22 ± 1,14 170 0,0001
cdt-EX 35 91 0 0 0 44 2,22 ± 1,14 170 0,0001
А,а — первый ген, В,Ь — второй ген, Н — гетерозигота. Если оба гена доминантны, заглавные буквы обозначают доминантные аллели. Если второй ген является кодоминантным, заглавная А обозначает доминантную аллель первого гена, заглавная В обозначает в этом случае аллель второго гена, который находится в фазе притяжения с А. Если оба гена кодоминантны, заглавной буквой обозначена аллель первого родителя
Таблица 3
Анализ расщепления по фенотипу растений поколений Р2 и Р3 от скрещивания линий Л281 и SGECdt
Пара маркеров AB AH Ab HB HH Hb aB aH ab Сцепление, сМ ± ст. ошибка Объединенный х2 p (9:3:3:1)
cdt-Pskn16 8 19 3 0 2 10 11,22 ± 5,12 21,8 0,0001
cdt-HptB 7 16 2 0 1 9 8,0 ± 4,73 22,3 0,0001
cdt-SUS3 8 15 3 0 6 9 19,7 ± 6,81 12,8 0,005
А,а — первый ген, В,Ь — второй ген, Н — гетерозигота. Если оба гена доминантны, заглавные буквы обозначают доминантные аллели. Если второй ген является кодоминантным, заглавная А обозначает доминантную аллель первого гена, заглавная В обозначает в этом случае аллель второго гена, который находится в фазе притяжения с А. Если оба гена кодоминантны, заглавной буквой обозначена аллель первого родителя
Анализ расщепления по фенотипу растений поколений Р2 и Р3 от скрещивания линий Л281 и SGECdt
Таблица 4
Пара маркеров AB AH Ab HB HH Hb aB aH ab Сцепление сМ ± ст. ошибка Объединенный х2 p (9:3:3:1)
cdt-HMA3 15 27 9 2 6 11 27,9 ± 6,11 11,2 0,005
cdt-S27E 18 38 1 0 0 1 18 2,6 ± 1,85 65,7 0,0001
cdt-IF4E 19 37 1 0 0 19 1,31 ± 1,21 70,9 0,0001
cdt-GH 18 37 1 0 2 16 2,6 ± 1,87 65,7 0,0001
А,а — первый ген, В,Ь — второй ген, Н — гетерозигота. Если оба гена доминантны, заглавные буквы обозначают доминантные аллели. Если второй ген является кодоминантным, заглавная А обозначает доминантную аллель первого гена, заглавная В обозначает в этом случае аллель второго гена, который находится в фазе притяжения с А. Если оба гена кодоминантны, заглавной буквой обозначена аллель первого родителя
Горох посевной является одним из самых известных объектов, на которых были сделаны исследования в области генетики. Он активно используется как модель для изучения генетического контроля процессов симбиогенеза с клубеньковыми бактериями (Greshoff, 2005) и формирования сложного листа (Tattersall et al., 2005). Также данный вид является ценной сельскохозяйственной культурой, обладающей превосходными пищевыми качествами и играющей большую роль в восстановлении плодородия земель, минуя использование минеральных удобрений. Несколько лет назад был получен мутант гороха, характеризующийся повышенными накоплением кадмия в биомассе растений и устойчивостью к токсичным концентрациям кадмия, что делает данный мутант уникальной моделью для изучения адаптаций растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов (Tsyganov et al., 2007).
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению генов гороха, молекулярно-генетические исследования данного вида все еще представляют собой сложную задачу. Затруднения связаны, во-первых, с большим количеством повторяющихся последовательностей, составляющих от 75 до 97 % всего генома гороха посевного (Flavell et al., 1974, Murray et al., 1981). Геном гороха почти в 10 раз превышает таковой у диплоидной люцерны. Функциональное изучение генов гороха осложнено тем фактором, что агробакте-риальная трансформация гороха до сих пор является трудной задачей. Несмотря на постоянную необходи-
мость локализации новых генов гороха, еще не создана единая молекулярно-генетическая база данных, и процент известных последовательностей очень мал. Однако достижения последних лет в области секвенирования геномов модельных растений значительно облегчают и ускоряют исследование новых генов у гороха. Так, завершение проекта секвенирования генома диплоидной люцерны и, в результате, создание ресурса с открытым доступом (http://www.medicagohapmap.org/?genome) позволяет исследовать микросинтению отдельных участков хромосом гороха и люцерны. На основе аннотированных участков определенной группы сцепления люцерны становится возможным разрабатывать маркеры на основе генов, локализация которых не была до этого известна у гороха. Примером такой возможности является данная работа.
Расширить возможности изучения генов гороха можно не только благодаря использованию микросин-тении с модельными бобовыми, но и более отдаленной синтении с А. ШаНапа, результаты секвенирования генома которого на сегодняшний день являются наиболее полными. Такой подход становится возможным благодаря разработке экспрессионных профилей для большого количества генов А. ШаНапа. Однако не всегда знание о генах, находящихся в данной области у модельных объектов позволяет точно узнать, в каком гене произошла мутация. При наличии большого числа генов-кандидатов снова встает необходимость позиционного клонирования исследуемого гена.
Для A. thaliana разработано несколько баз данных, позволяющих клонировать мутантный локус в течение года, однако для менее изученных растений этот срок по прежнему составляет от 3 до 5 лет (Jander et al., 2002).
В данном исследовании нами был использован анализ микросинтении как с M. truncatula, так и с
A. thaliana. В результате была проведена точная локализация мутации по локусу cdt на генетической карте гороха и выявлены 2 фланкирующих маркера (маркер PTP созданный на основе последовательности гена, кодирующего белок, относящийся к семейству PPR и маркер EX, созданный на основе последовательности гена, кодирующего экзонуклеазу), которые показали очень близкое сцепление с локусом cdt. Полученные результаты создают реальные предпосылки для позиционного клонирования локуса cdt.
Благодарности:
Авторы выражают большую признательность
B. А. Жукову, А. Г. Пинаеву и Е. Е. Андронову за ценные консультации при проведении исследований и
C. М. Розову за критическое чтение рукописи.
Данная работа была финансово поддержана ОНТП
Россельхозакадемии, Министерством образования и науки (государственные контракты № 16.552.11.7047, П290) грантом Президента России (НШ-3440.2010.4) и Российским фондом фундаментальных исследований (1 1-04-01675).
ЛИТЕРАТУРА
1. Кулаева О. А., Цыганов В. Е., 2010. Молекуляр-но-генетические основы устойчивости высших растений к кадмию и его аккумуляции // Экол. генетика. Т. 8. С. 3—15.
2. Цыганов В. Е., Кулаева О. А., Нокс М., и др., 2012. Использование SSAP анализа для первичной локализации мутации cdt (cadmium tolerance) в VI группе сцепления гороха // Экол. генетика. Т. X, N 1. С. 42-46.
3. Aubert G, Morin J., Jacquin F. et al., 2006. Functional mapping in pea, as an aid to the candidate gene selection and for investigating synteny with the model legume Medicago truncatula // Theor. Appl. Genet. Vol. 112. P. 1024-1041.
4. Belimov A. A., Safronova V. I., Tsyganov V. E. et al., 2003. Genetic variability in tolerance to cadmium and accumulation of heavy metals in pea (Pisum sativum L.) // Euphytica. Vol. 131. P. 25-35.
5. Cobbett C. S., May M. J., Howden R, RollsB, 1998. The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2-1, of Arabidopsis thaliana is deficient in y-glutamylcysteine synthetase // The Plant J. Vol. 16. P. 73-78.
6. Dellaporta S., Wood J., 1983. Plant DNA miniprep-aration // Plant Mol. Biol. Rep. Vol. 1. P. 19-21.
7. Ellis T., Poyser S., 2002. An integrated and comparative view of pea genetic and cytogenetic maps // New Phytol. Vol. 153. P. 17-25.
8. Flavell R., Bennett M, Smith J., Smith D., 1974. Genome size and the proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants // Biochem. Genet. Vol. 4. P. 257-269.
9. Greshoff P. M, 2005. Positional Cloning of Plant Developmental Genes // The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping / Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim. P. 233-256.
10. Graham L., Sticklen B., 1993. Plant chitinases // Can. J. Bot. Vol. 72. P. 1057-1083.
11. Howden R, Goldsbrough P. B, Andersen C. R, Cobbett C. S., 1995. Cadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient // Plant Physiol. Vol. 107. P. 1059-1066.
12. Ha S, Howden R., Dietrich W., Bugg S., 1999. Phytochelatin synthase genes from arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe // Plant Cell. Vol. 11. P. 1153-1163.
13. IwataH, Ninomiya S., 2006. AntMap: Constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm // Breed. Sci. Vol. 56. P. 371-377.
14. Jander G, Norris S, Rounsley S. et al., 2002. Ara-bidopsis map based cloning in the post genome era // Plant Physiol. Vol. 129. P. 440 450.
15. Kalo P., Seres A., Taylor S. et al., 2004. Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum // Mol. Genet. Genomics. Vol. 272. P. 235-246.
16. Murray M., Peters D., Thompson W., 1981. Ancient repeated sequences in the pea and mung bean genomes and implications for genome evolution // J. Sci. Food Agr. Vol. 17. P. 31-42.
17. Neff M., Turk E, Kalishman M., 2002. Web based primer design for single nucleotide polymorphism analysis // Trends Genet. Vol. 18. P. 613-615.
18. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R., 1999. Response to cadmium in higher plants // Environ. Exp. Bot. Vol. 41. P.105-130.
19. Sharma S., Dietz K., 2006. The significance of ami-no acids and amino acid-derived molecules in plant responses and adaptation to heavy metal stress // J. Exp. Bot. Vol. 57. P. 71 1-726.
20. Tattersall A.D., Turner L., Knox M. R. et al., 2005. The Mutant crispa reveals multiple roles for PHAN-TASTICA in pea compound leaf development // Plant Cell. Vol. 17. P. 1046-1060.
21. Tsyganov V., Belimov A., Borisov A. et al, 2007. A chemically induced new pea (Pisum sativum) mutant SGECdt with increased tolerance to, and
accumulation of, cadmium // Ann. Bot. London. Vol. 99. P. 227-237.
Watanabe A., ¡to H, Chiba M. et al., 2010. Isolation of novel types of Arabidopsis mutants with altered reactions to cadmium: cadmium gradient agar plates are an effective screen for the heavy metal related mutants // Planta. Vol. 232. P. 825-836.
FINE MAPPING OF A CDT LOCUS MUTATION THAT LEADS TO INCREASED CADMIUM TOLERANCE
Kulaeva O. A., Tsyganov V. E.
* SUMMARY: A pea mutant SGECdt (cdt), which has an increased cadmium tolerance and an increased cadmium accumulation, as compared to the initial line, was recently obtained. Earlier, a SSAP (sequence specific amplified polymorphism) analysis revealed localization of the cdt locus in VI linkage group. For fine mapping of the cdt locus a set of PCR based markers was developed. PCR markers were based on known sequences of pea genes, which were determined using analysis of genome microsynteny between pea and model legume Medicago truncatula. The close linkage of the cdt locus and markers based on the Pentatricopeptide repeat and Exosome complex exonu-clease RRP 45 genes was revealed. Thus, prerequisites for cdt positional cloning were developed.
* KEY WORDS: genetic analysis of cadmium tolerance; gene mapping; SNP markers; CAPS markers; Pisum sativum L.
Ф Информация об авторах
Цыганов Виктор Евгеньевич — заведующий лабораторией, кандидат биологических наук. Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, лаборатория молекулярной и клеточной биологии. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: tsyganov@arriam.spb.ru.
Кулаева Ольга Алексеевна — младший научный сотрудник. Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, лаборатория молекулярной и клеточной биологии. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: koa1983@yandex. ru.
Tsyganov Viktor Evgenevich — Head of the laboratory. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology RAAS, Laboratory of Molecular and Cellular Biology. Podbelsky chausse 3, Saint-Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia. E-mail: tsyganov@arriam.spb.ru.
Kulaeva Olga Alekseevna — Junior Scientific Researcher. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology RAAS, Laboratory of Molecular and Cellular Biology. Podbelsky chausse 3, Saint-Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia. E-mail: koa1983@yandex.ru.
