CC BY
33
УДК 57.017.3:546.48
Кобилецька M.C.*, к.б.н., доцент, Корчинська О.С.**, к.б.н., доцент,
Маленька У.С.*©
*Лъе1есъкий нацюналъний ymeepcumem iмет 1вана Франка **Лъвгвсъкий нацюналъний медичнийутеерситет iметДанила Галицъкого
АКТИВШСТЬ ХЛОРОФЫАЗИ У РОСЛИН КУКУРУДЗИ ЗА Д11 КАДМ1Й ХЛОРИДУ ТА САЛ1ЦИЛ0В01 КИСЛОТИ
Дослгджено вплыв альтернативных Memodie обробки салщиловою кислотою на змту aKmuenocmi хлорофыази у рослин кукурудзи за dií кадмш хлориду в концентрацИ' 10 6M. Виявлено зростання aKmuenocmi хлорофыази, особливо за dií rnÓMiu хлориду, проте обробка рослин салщиловою кислотою спричинювала зниження aKmuenocmi ферменту, nopiвнянo з рослинами, яю зазнали впливу стресора.
Ключов1 слова: Zea mays L., активтстъхлороф^зи, кадмшхлорид
Вступ. Вивчення особливостей шгментного складу рослин з р1зною толерантшстю до стресових фактор1в мае велике значения для з'ясування механ1зм1в i'xHboi адаптаци до умов навколишнього середовища, а саме для розумшня еволюцшних шлях1в становления фотосинтетичного апарату рослин [1].
Тривала адаптащя рослин до св1тлових умов вщбуваеться иереважно за рахунок модифжацш фотосинтетичного апарату (ФСА). Важливу роль при цьому вдаграе варшвання активное^ фермент1в фотосинтезуючих систем, вщпов¿дальних за синтез i деградацш нативних хлорофш-вмкних комплекав. Одним Í3 таких фермент1в е хлорофшаза (хлорофш - хлорофшд - гщролаза), яка локал1зована в обох фотосистемах i бере участь у метабол1зм1 хлорофшу. Вщ активност! ферменту залежить bmíct хлорофшу, розклад i накгромадження шгменту [5]. Цей фермент катал1зуе деф1тол1зацш хлорофшу. Оскшьки 3míhh вшьно! енерги при здшсненш ще! реакцп невисою, то вважають що хлорофшаза може катал1зувати й приеднання ф1толу до хлорофшду [4].
Проведено кшетичш дослщження, що пщтверджують кнування хлорофшази у вигляд1 декшькох форм з р1зною функцюнальною актившстю i можливкть И регуляци in vivo шляхом змши конформаци ферменту [3]. Важливою умовою реал1заци хлорофшазно! пдрол1тично! реакци е взаемна доступшсть субстрату та ферменту. Це визначаеться локал1защею i станом хлорофшази i хлорофшу в систем!. Шгмент, зв'язаний в комплекс з бшком i лшщами, виявляеться малодоступним гщрол1тичнш дп хлорофшази. Саме це забезпечуе можливкть 1хнього кнування в фотосистемах. Разом з тим, власна актившсть хлорофшази залежить вщ И надмолекулярних зв'язюв в комплексах [2]. Анал1з л1тературних даних свщчить також про важливкть показника
© Кобилецька M.C., Корчинська О.С., Маленька У.С., 2012
45
míu;hoctí зв'язку хлорофшу в хлорофш - бшково - лшщному комплекс! для оцшки роботи фотосинтетичного апарату.
Метою роботи було дослщити вплив салщилово! кислоти на змшу активност! хлорофшази у рослин кукурудзи за ди кадмш хлориду, а також встановити характер впливу цих фактор1в на мщшсть зв'язку в хлорофш-бшковому комплекс!.
Матер1ал i методи. Об'ектом дослщжень були рослини кукурудзи (Zea mays L.) сорту Титан. Насшня пророщували в кювет1 на фшьтрувальному nanepi, зволоженому дистильованою водою, в термостат! при температур! 24°С протягом 5 д1б. üotím проростки переносили на розчини хлориду кадмш у концентращях 10-6 М. Окр1м того, частину проростюв не обробляли СК, а теля перенесения ix на розчини з хлоридом кадмш на 6-ту добу обприскували розчином СК у концентраци10-4 М. Контролем слугували рослини, вирощеш на дистильованш водг
Визначення активное^ хлорофшази проводили за методом [6]. Брали дв1 наважки листюв по 0,1 г. У першш (контрольнш) визначали суму зелених шгменив i початковий bmíct хлорофшщу. Першу наважку рослинного матер1алу (0,1 г) попередньо подр1бнювали, додавали невелику кшьккть MgCÜ3 та 10мл 80%-го ацетону i ретельно розтирали. Одержаний екстракт вщфшьтровували кр1зь скляний фшьтр та доводили об'ем отриманого фшьтрату до 10мл.
У другш наважщ листюв (дослщнш), визначали bmíct хлорофшщу теля дй' хлорофшази. Наважку листюв розтирали з 60%- ним ацетоном i MgCO3 . Доводили об'ем до 10мл та шкубували екстракт за юмнатно! температури впродовж одте! години у темрявг Реакцш припиняли за концентраци ацетону 80%. Для цього до гомогенат1 додавали р1вний об'ем (10мл) 100% -го ацетону. Одержаний гомогенат1 вщфшьтровували кр1зь скляний фильтр та доводили у Mipmñ колб1 до 25мл.
Екстракти контрольного та дослщного вар!ант!в дшили на дв1 píbhí частини. Першу частину кожного з розчишв залишали у темряв1 для визначення сумарного вмюту зелених тгмешгв. У другш частит екстракт1в визначали юльюсть хлорофшду. Для цього до друго! частини (10мл) додавали 1мл 0,02 н NH4ÜH. CyMim переносили у дшильну лшку та додавали 0,2 мл насиченого розчину NaCl i 5мл петролейного еф1ру. Одержану сум1ш енергшно струшували та роздшяли, причому в петролейний еф1р екстрагувалися лшофшьт форми тгмент1в, що мютять ф1тол-хлорофши, а також каротинощи. Безф1тольш тгменти - хлорофшди, залишаються в нижньому водно-ацетоновому mapi. Шсля роздшення цих mapiB нижнш водно-ацетоновий шар збирали в окрему колбу. Одержану сумш переносили у дшильну лшку i повторювали екстракцш 3-4 рази до повного вилучення хлорофшв.
Шсля юнцево! екстракцп водно-ацетоновий шар зливали у м1рну колбу i доводили чистим ацетоном об'ем до mítkh. Для визначення вмюту хлорофшу обидва ацетонов! екстракти контрольно! та дослщно! проб
46
спектрофотометрували вщповщно за 663 I 645 нм. Концентрацш суми хлорофшв обчислювали за формулою:
хлорофши (а + Ь) = 8,02 *А663 + 20,2* А645 = мг/л,
де А - величина поглинання сумарно! витяжки шгмент1в, за двох довжин хвиль, вщповщно максимумам поглинання шгменив у 80% ацетош.
Мщшсть зв'язку в хлорофш-бшковому комплекс! визначали за методом [6]. Спершу дв1 наважки листя по 0,5 г розтирали в ступках вщповщно з 100%-ним I 60%- ним ацетоном. Розтерту масу в 100%-му ацетош переносили вщразу на фшьтр Шота I промивали невеликими порщями сухого ацетону. Об'ем фшьтрату доводили до 10мл. Дал1 обчислювали вмкт хлорофшу в матер1алг Розтертий в 60% -му розчиш ацетону матер1ал настоювали протягом 20 хвилин, I лише теля цього ф1льтрували, дв1ч1 промиваючи осад на ф1льтр1 60% - ним розчином ацетону. Об'ем екстракту також доводили розчином ацетону до 10мл, збовтували I колориметрували з червоним св1тлоф1льтром. Визначали кшьккть слабкозв'язаного хлороф1лу в 1г матер1алу. Про м1цн1сть зв'язку хлороф1лу з лшопротещним комплексом пластид робили на основ! сп1вв1дношення, яке виражали у процентах: кшькють хлороф1лу в 60% - му розчиш ацетону до кшькост1 хлороф1лу в 100%-му розчиш ацетону.
Результати досл1дження. Анал1з отриманих даних вказуе на те, що активн1сть хлороф1лази за д11 кадмш хлориду зростае. Обробка сал1циловою кислотою, як шляхом замочування нас1ння, так I шляхом обприскування проростк1в, призводила до зниження активност1 ферменту, щодо контрольних рослин та тих, яю зазнали впливу важкого металу. Достов1рно! р1зниц1 м1ж активн1стю хлороф1лази у листках рослин за дп р1зних метод1в обробки сал1циловою кислотою не виявлено.
Рис. Активн1сть хлороф1лази у листках рослин кукурудзи за дй' кадм1й хлориду та сал1цилово1 кислоти, % розкладеного хлороф1лу:
1-контроль, 2- СёСЬ (10-6М), 3 - СК (10-4 М) обприскування, 4 - СК (104 М) замочування, 5- СёСЬ (10-6м) + СК (10-4 М) обприскування, 6 - СёСЬ (10-
6М) + СК (10-4 М) замочування.
47
Проте у вар1антах з передпоавним замочуванням насшня кукурудзи у розчинах СК спостер1гали певне зростання активное^ ферменту, на вщмшу вщ рослин, яю зазнали впливу СК шляхом обприскування 6-ти добових проростюв, у листках, яких виявлено незначне зниження активное^ дослщжуваного ферменту щодо иоиереднього вар1анту.
Функцюнальна актившсть хлорофшу залежить вщ мщност1 зв'язку з бшково- лшщним комплексом, який характеризуе його стан за р1зних зовшшшх фактор1в. Велика увага дослщнимв придшяеться мщност1 зв'язку шгмент1в в хлорофш-бшково-лшщному комплекс! хлоропласпв в ощнщ стшкост1 рослин до несприятливих чинниюв зовшшнього середовища. Даний показник при дп на рослини р1зних еколопчних фактор1в може I пщвищуватися I знижуватися, що визначаеться як I характером фактора, силою його прояву так I видовою приналежшстю.
Вщом1 даш про те, що сучасш висопродуктивш сорти рослин мютять в хлоропластах бшьше хлорофшу, мщно зв'язаного з бшково-лшщним комплексом. Це пояснюеться юнуванням добре вираженого зв'язку м1ж функцюнальною актившстю хлоропласпв I функциональною оргашзащею !хнього енергетичного дихального ланцюга, що забезпечуе утворення великого фонду молекул АТФ та сприяе бшьш штенсивнш робот1 бшок-синтезуючо! системи хлоропласпв. У результат! цього зростае синтез бшюв та нуклешових кислот, що само по соб1 визначае можливкть бшьш повного використання генетичного потенщалу в наступних етапах перетворення збережено! енергн св1тла.
Змша стану хлорофш-бшково-лшщного комплексу за дн на рослини важких метал1в майже не вивчена.
Вплив стресора на рослини спричинював змши стану хлорофш -бшкового комплексу в дослщжуваних рослин. У рослин кукурудзи спостер1гали зростання мщност1 ХБК щодо контролю, що можна вважати результатом високого адаптивного потенщалу рослин кукурудзи до дп важких метал1в. Екзогенна обробка салщиловою кислотою мала певний вплив на оргашзащю шгмент бшкових комплекав. Зокрема, при дп лише СК спостеркали зниження мщност1 зв'язку ХБК з шгментом. Це може бути пов'язано з безпосередшм впливом СК на структури листка при обробщ рослин шляхом обприскування. Очевидно, що зростання мщност1 звязку хлорофшв з мембранами е адаптивною реакщею рослин на дш стресово! дози кадмш в середовищ1 проростання. Негативний вплив важкого металу на мембрани виражаеться у порушенш мщност1 зв'язку з ними хлорофшу. Гщрофобний зв'язок каротино!д1в з мембраною також послаблюеться, про що свщчить нижчий % невилученого хлорофшу в рослин, що пщдавались впливу кадмш хлориду. Щодо сум1сно! СК та кадмш хлориду, то в цьому випадку показники е вищими щодо контролю, тобто мщшсть зв'язку каротиновдв ¿з бшково-лшщними комплексами зростае, хоча це пщвищення зростання е незначним.
Висновки. Отримаш результата дослщжень вказують на те, що екзогенна салщилова кислота бере участь у регуляцн фотосинтетичного
48
процесу рослин, причому одним з можливих шлях1в И дп е модулящя активност1 ферменлв за участю сприяння генерування активних форм кисню у стресових та не стресових умовах. Кадмш хлорид у концентраци 10-6M спричинюе значне зростання активное^ хлорофшази. Проведен! дослщження щодо визначення мщност1 зв'язку хлорофшв та каротиновдв з хлорофш-бшковим комплексом свщчать про суттевий вплив СК на шгментну систему рослин, адже цей показник вказуе на функцюнальну актившсть фотосинтетичного апарату.
Л1тература
1. Алексеев Ю.В. Тяжелые металлы в почвах и растениях. - М.: Агропромиздат, 1987.-142 с.
2. Бессонова В.П. Влияние тяжелых металлов на фотосинтез растений: Монография.- Днепропетровск: Днепропетровский государственный аграрный университет, 2006.-208 с.
3. Зеленський О.В. Еколого-физиологические аспекты изучения фотосинтеза. Л.: Наука, 1977. - 56с.
4. Протасова Н.Н., Кефели В.И. Фотосинтез и рост высших растений, их взаимосвязи и корреляции // Физиология фотосинтеза. - М.: Наука. - 1982. - С. 25 -27.
5. Судина Е.Г., Лозовая В.П., Довбыш Е.Ф. и др. К вопросу о локализации хлорофилазы в хлоропласте // Физиол. и биохим. культ. раст. -1973. - №5.- С. 154-158.
6. Ф1зюлопя рослин: практикум / О.В. Войцех1вська, А.В. Концетам, O.I. Косик та ¿н. За заг. ред. Т.В. Паршиково!, Луцьк: Терен.- 2010. - 416с.
Summary
M.Kobyletska*, O. Korchynska**, U. Malenka*
* Ivan Franko National University of Lviv, Lviv, Ukraine ** Danylo Galytskyj National Medical University of Lviv, Lviv, Ukraine THE INFLUENCE OF SALICYLIC ACID ON CHANGES HLOROFILAZ ACTIVITY IN PLANT OF MAIZE FOR THE ACTIONS OF CADMIUM CHLORIDE
Influence of various methods of salicylic acid on changes hlorofilaz activity in plant of maize for the actions of cadmium chloride at a concentration 10-6 M were investigated. The hlorofilaz activity was shown increased, especially when exposed cadmium chloride. Although the salicylic acid processing plants led to decreased activity of the enzyme, on plants exposed to stressor. Is judged presence that exogenous salicylic acid is involved in regulation of the photosynthetic process of plants.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Параняк Р.П.
49
