CC BY
137
УДК 615.45:577.115.083:616-006-092.4/.9
N. A. Oborotova1, A. A. Vilanskaia1, VI. Procofeva12
THERMOSENSITIVE LIPOSOME DRUG FORMS IN THE EXPERIMENTAL ONCOLOGY
1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 21. M. Sechenova Moscow Medical Academy
ABSTRACT
In these review we have analyzed the advantages of liposome anticancer drug delivery and the main liposome types, used in the last few years. We observed the possibility of using thermosensitive liposome in combination with local hyperthermia and the mechanism of thermosensitive drug release from vesicles as well as the main characteristics of these liposomes. We have emphasized the role of space around the liposomes in drug release from thermoliposomes and their usefulness in suppressing multidrug resistance.
Key words: thermoliposomes, hyperthermia, trigger drug release, phase transition, multidrug resistance.
H. А. Оборотова1, А. А. Виланская1, В. И. Прокофьева2
ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОНКОЛОГИИ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2 ММА им. И. М. Сеченова, Москва
РЕЗЮМЕ
В обзоре проанализированы преимущества липосомальной доставки цитостатиков и основные виды липосо-мальных носителей, изучаемые в последние годы.
Описана возможность использования термочувствительных липосом для сочетанного применения с локальной гипертермией, а также механизм термозависимого высвобождения лекарственных веществ (ЛВ) из везикул и их основные характеристики. Указана роль среды в реализации термозависимого высвобождения ЛВ из термоли-посом и применение последних в борьбе с множественной лекарственной устойчивостью опухолевых клеток.
Ключевые слова: термолипосомы, гипертермия, триггерное высвобождение, фазовый переход, множественная лекарственная устойчивость.
■ ■
62
-Q-
ВВЕДЕНИЕ
Повышение эффективности лекарственной терапии злокачественных новообразований проводится по разным направлениям. Кроме продолжения поиска новых избирательно действующих на опухоли лекарственных веществ (ЛВ) идет разработка рациональных лекарственных форм (ЛФ), позволяющих оптимизировать методики применения отобранных в эксперименте активных препаратов, создавать схемы и режимы полихимиотерапии, совершенствовать методы комплексного и комбинированного лечения злокачественных новообразований. Целенаправленное концентрирование ЛВ в опухолевой зоне с помощью ЛФ увеличивает селективность действия противоопухолевых препаратов и ограничивает их цитотоксическое действие на нормальные ткани.
В стремлении создать ЛФ для направленной доставки ЛВ исследователи идут различными путями. Одним из подходов к решению этой проблемы является микроинкапсулирование, т. е. использование специфических носителей — липосом, которые благодаря своим коллоидным свойствам, контролируемым размерам, поверхностным характеристикам, мембранотроп-ности и биосовместимости рассматриваются как перспективные системы доставки ЛВ в кровяное русло.
ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
За последние десятилетия для создания липосо-мальных препаратов испытывались ЛВ, относящиеся к следующим нозологическим группам: противовос-
палительные, противотуберкулезные, противопарази-тарные, анестетики, ферменты, различные вакцины и гены. Однако наибольший интерес вызывают исследования в области совершенствования ЛФ противоопухолевых препаратов [1; 4; 5; 16; 18; 22; 35].
Известно, что сосудистая сеть здоровой ткани (кроме органов РЭС) имеет плотный непрерывный эндотелиальный слой, препятствующий проникновению в нее макромолекул и микровезикул. Опухолевая ткань в отличие от здоровой имеет ряд патофизиологических особенностей: гиперваскулярность, незаконченность сосудистой архитектоники, секреция факторов, увеличивающих проницаемость опухолевых сосудов, дренаж, создаваемый за счет макромолекул и частиц и обеспечивающий удержание липосом в опухолевой ткани [10; 15; 26]. В процессе развития опухолевого заболевания расстояние между эндотелиальными клетками, выстилающими внутреннюю поверхность капилляров в очагах поражения, может увеличиваться, и образующиеся поры позволяют малым однослойным липосомам (МОЛ) за счет пассивной конвективной диффузии проникать из кровотока в опухолевую ткань. Это обеспечивает более направленную доставку ЛВ в сравнении со свободным препаратом.
Возможность регуляции избирательного распределения липосом в организме путем изменения их состава делает липосомальную технологию предметом обширных научных изысканий с целью совершенствования химиотерапии злокачественных заболеваний. Особое значение имеет преимущественное высвобождение химиопрепаратов в опухолевых очагах и снижение его концентрации в здоровых тканях, а также продолжительность противоопухолевого воздействия вследствие более длительной циркуляции липосомальных препаратов в кровеносном русле. Показано, что липосомы, имеющие иной характер распределения в организме, нежели само ЛВ, существенным образом снижают токсичность и улучшают терапевтическую эффективность известных противоопухолевых препаратов, таких как доксорубицин, даунорубицин, метотрексат, цисплатин, блеомицин, митомицин и др. [4; 5; 18]. Некоторые из этих цитостатиков уже используются в химиотерапии в виде новых липосомальных ЛФ, другие находятся на стадиях доклинического и клинического исследований. Кроме того, в настоящее время изучается возможность применения липосомальных ЛФ для совершенствования основного направления фотохимиотерапии — метода фотодинамической терапии. Экспериментальные исследования липосомальных фотосенсибилизаторов показали возможность солюбилизации гидрофобных ЛВ, увеличение их биодоступности при внутривенном введении, поддержание высокого индекса селективности, обеспечивающего оптимальную фотодинамическую эффективность [2; 3].
Таким образом, к преимуществам использования липосомальных цитостатиков относятся следующие:
— улучшенная доставка ЛВ к месту опухоли;
— защита окружающих тканей от цитотоксичес-кого действия ЛВ;
— способность высвобождать ЛB в ответ на действие экзогенного стимула;
— биологическая совместимость с системами организма;
— отсутствие кумулятивной токсичности;
— предупреждение местных тканевых реакций при введении цитостатиков;
— доступность технологических материалов и относительная простота изготовления липосом.
Липосомальные ЛФ можно вводить как внутривенно, так и внутримышечно, подкожно, внутрь различных полостей, ингаляционно, наружно, перорально. Однако, попадая в системный кровоток, липосомы быстро подвергаются опсонизации и последующему захвату фагоцитами РЭС. Это приводит к значительному снижению эффективности противоопухолевой терапии инкапсулированными препаратами. B результате длительных исследований показано, что подбором компонентов липидного бислоя липосом, их размера, заряда и поверхностных характеристик можно значительно увеличить стабильность везикул в биологических жидкостях, скорость высвобождения ЛB из них и время циркуляции в кровяном русле [32; 36].
Обнаружение липосом, способных целенаправленно доставлять содержимое в солидные опухоли in vivo, связано с разработкой технологии активного включения в липосомы гамма-радиоактивного изотопа индия 111In. Успешное применение меченных 111In малых однослойных липосом для получения изображения ряда опухолей послужило стимулом к исследованию включения в них цитостатиков [54]. Благодаря определенным характеристикам распада ш!п-изотоп стал прекрасным инструментом мониторинга липосомальных частиц in vivo. С помощью изотопного метода метки был исследован широкий спектр липосо-мных систем, различных по составу и физическим характеристикам.
Кроме того, большой раздел современных исследований посвящен разработке липосомального носителя, гарантирующего направленную доставку и контролируемое высвобождение инкапсулированного ЛB в опухолевой ткани [1; 8]. С этой целью разрабатывается ряд специальных липосом, в т. ч.:
— иммунолипосомы, содержащие вектор в виде специфических моноклональных антител;
— катионные липосомы, содержащие в своем составе заряженный липид, тропный к эндотелию сосудов;
— рН-чувствительные липосомы, высвобождающие ЛB в тканях с заниженным значением рН;
— термочувствительные липосомы, высвобождающие ЛB в нагреваемых тканях.
Экспериментальные исследования in vitro и in vivo показали, что использование липосомальных препаратов в комбинации с различными экзогенными физикохимическими стимулами (ультразвук или гипертермия) позволяет значительно увеличить селективность липосомальной доставки, контролировать скорость и место высвобождения ЛB и в результате достигать его концентрирования в опухолевой ткани [29].
ГИПЕРТЕРМИЯ В ПОВЫШЕНИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
C древних времен гипертермия (ГТ) рассматривалась в качестве вспомогательной терапии, способствующей повышению эффективности лечения ряда заболеваний, в т. ч. и опухолевых. В настоящее время ГТ широко исследуется как в экспериментальном, так и клиническом аспекте. Изучается проблема ее использования в сочетании с радиационным облучением и химиотерапией опухолей [11]. Клинически выделяют ГТ всего тела, региональную и локальную ГТ. Для создания ГТ используют электромагнитное поле, УЗ, перфузионные методы. Достижения клинической ГТ при лечении солидных опухолей (меланома, опухоли головы и шеи, молочной железы, желудочно-кишечного и урогенитального тракта, глиобластома и саркома) представлены в ряде работ. Параллельно продолжаются многочисленные доклинические исследования как in vitro, так и in vivo [20; 24; 27; 29; 38; 48; 49; 56; 57].
Обнаружено, что ГТ не только обладает самостоятельным цитотоксическим действием, но и увеличивает чувствительность опухолевых клеток к ряду цитостатиков; это явление назвали термохимиочувствительностью. При этом совместное применение ГТ и некоторых противоопухолевых агентов (митомицина, доксорубицина) позволяет значительным образом усилить противоопухолевое влияние последних [17; 19]. Эффект, возникающий от сочетанного применения лекарственных препаратов и ГТ, классифицируют как:
— дополняющий, при котором наблюдается линейная зависимость цитотоксичности от повышения температуры;
— порогово-зависимый, при котором повышение температуры не вызывает или вызывает слабое увеличение цитотоксичности, но в момент пороговой температуры наблюдается резкое повышение цитотоксичности;
— независимый, когда повышение температуры не влияет на цитотоксичность.
При использовании большинства алкилирующих соединений типа циклофосфана, а также платиновых соединений в сочетании с нагревом в интервале
37-40,5 °С цитотоксичность повышается линейно. Цитотоксичность большинства антиметаболитов (5-фтор-урацил) так же, как и винко-алкалоидов и таксанов не изменяется при нагревании, в то время как антрациклин доксорубицин имеет температурный порог [20].
Отмечено, что ГТ увеличивает проницаемость опухолевых сосудов для макромолекул (антител, фер-ритина, пигментов) [15; 43] и липосом [24; 29]. Обнаружено, что ГТ является причиной реоксигинации опухоли и что ее степень связана с достигаемым уровнем цитотоксичности [21]. Показано, что во время нагревания (43 °C) скорость кровяного потока в опухоли увеличивается в 1,5-2 раза по сравнению с ненагретым контрольным участком [46; 50]. В нормальных тканях ГТ также увеличивает кровоток, но не изменяет проницаемости обычных сосудов для липосом [10;
50-52]. Следовательно, за счет усиления локального кровотока и увеличения проницаемости сосудов опухоли ГТ может способствовать доставке липосом в пораженную область [14].
Однако ГТ не должна являться причиной повреждения тканей больного, поэтому необходимо подобрать такой состав липосом, который позволит высвобождать ЛВ при температуре, не превышающей 43 °С. Для сочетанного применения липосом с локальной ГТ в последние годы изучаются термочувствительные липосомы. Преимущество этого направления в том, что выход ЛВ из липосом контролируется воздействием извне, что позволяет легко модифицировать желаемые условия нагрева пораженной области.
ТЕРМОЛИПИДЫ ДЛЯ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЛИПОСОМ
Для достижения оптимального терапевтического эффекта in vivo важное значение имеет длительное присутствие липосом в кровотоке и высвобождение содержимого липосом в опухолевой ткани. При этом кроме размера везикул важную роль играет липидная композиция бислойной мембраны липосомы, которая должна быть термочувствительной и способной разрушаться при нагревании. Идея термочувствительных липосом заключается в их способности высвобождать ЛВ в ответ на действие локальной ГТ, в процессе которой опухоль нагревается до 41-45 °С. Известно, что ламеллярная структура липосомальной мембраны при переходе из геля в жидкокристаллическое состояние образует поры, через которые включенный цитостатик проникает в окружающую среду. Поэтому можно создать липосомы, которые будут высвобождать препарат преимущественно при температуре перехода липидов в жидкокристаллическую фазу [8; 24; 29; 33; 34]. Для создания термолипосом используются липиды, фазовый температурный переход которых находится в пределах 38-42 °С.
Однако термолипосомы должны удерживать в плазме заключенное в них ЛВ в течение определенного периода времени, высвобождая его только в ответ на экзогенный тепловой стимул (триггерное воздействие).
В 1978 г. M. B. Yatvin и соавт. предложили использовать для химиотерапии сочетание ГТ с технологическими возможностями липосом. Оригинальный состав термолипосом с неомицином, состоящий из нейтральных липидов дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) и дистероилфосфатидилхолина (DSPC) в мольном соотношении как 7:1, был изучен in vitro на E. coli при различных температурах. В других работах ряд авторов использовали отрицательно заряженный дипалми-тоилфосфатидилглицерол (DPPG). Эти липиды имеют низкие температуры плавления. Так, для DPPC и DPPG температура фазового перехода равна 41 °С, а для DSPC — 53 °С. При смешивании данных липидов можно создавать композиции с заданным значением температуры перехода в физиологически приемлемом интервале. В результате сочетанного применения ло-
кальной ГТ и липосомального носителя липидная мембрана разрушается, высвобождая препарат в окружающую среду.
Кроме вышеназванных термолипидов, определяющих термостабильность, важным компонентом бислойной мембраны является холестерин, который, взаимодействуя с гидрофобными концами фосфолипидов, обеспечивает их целостность, более плотную упаковку углеводородных цепей липидов и снижает температуру их фазового перехода [23; 28; 47]. В результате повышается стабильность липосомы в биологических жидкостях (при термпературе 37 °С) и увеличивается термостабильность [12].
Проведенные in vitro исследования доказали, что липосомы с данной композицией липидов обладали способностью ГТ триггерно высвобождать включенный неомицин при температуре 42 °С [58; 59]. В дальнейшем появился ряд аналогичных исследований с другими препаратами, в основном — противоопухолевыми соединениями.
Роль липидной композиции и структуры липосом в исследованиях in vitro показана и на пустых липосо-мах. G. Arancia и соавт. (1994) обнаружили, что многослойные липосомы (МСЛ) способны сливаться с клеточными мембранами, изменяя их характеристики [6]. Проникая в клетку, липосомальная мембрана изменяет функции органелл. Этот эффект увеличивается в условиях ГТ. МОЛ не обладают такой токсичностью, поэтому важно отделять МСЛ от МОЛ в процессе приготовления липосомальной лекарственной формы.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ЛИПОСОМ
Помимо температуры фазового перехода, другой функциональной характеристикой липосомальных липидов является дифференциальная термостабильность. Эта величина отражает разницу в высвобождении ЛВ из липосом при физиологической температуре (37 °С) и в условиях ГТ. Термостабильность показывает чувствительность липосом к ГТ, быстроту высвобождения ЛВ из них, а также их стабильность в биологических жидкостях в отсутствие нагрева (при 37 °С).
Для оценки рациональности липидной композиции и сочетанного применения липосомных препаратов с ГТ исследования проводятся в первую очередь in vitro. Большинство работ посвящено изучению интенсивности высвобождения ЛВ из термолипосом путем сравнения цитотоксичности различных липосомальных композиций и ГТ на культурах опухолевых клеток. В эксперименте in vitro был проведен сравнительный анализ нескольких липидных композиций липосом: DPPC/DSPC (7:1 или 6:3) и DPPC/DSPC/холестерин (6:3:2, 6:3:4 или 5:4:2) со средним диаметром везикул 50 нм, содержащих 6-карбоксифлюоресцеин. Термостабильность липосом определяли по высвобождению 6-карбоксифлюоресцеина. Их инкубировали при температуре 37 или 43 °С в фосфатном буфере с добавлением или без добавления бычьей сыворотки. В результате исследований было выявлено оптимальное соот-
ношение фосфолипид/холестерин (СН) 9:2, позволяющее эффективно стабилизировать липосомы в кровяном русле. Состав фосфолипидов и их соотношение в мембране липосом, согласно результатам исследований, отвечает за чувствительность липосом к воздействию ГТ и за скорость высвобождения препарата из них. Оптимально подобранная липосомальная композиция DPPC/DSPC/CH 5:4:2, характеризующаяся максимальной термостабильностью 70 % и температурой фазового перехода мембраны 41,2 °С, предлагается для дальнейших исследований in vitro и in vivo [37].
Исследования in vitro DPPC/DSPC/CH липосом в соотношении 5:4:2 с доксорубицином проводились J. L. Merlin (1991) на культуре клеток Hela S3 [37; 38]. В ходе эксперимента обнаружено, что:
1) инкапсулирование доксорубицина в данных ли-посомах не ослабляет противоопухолевой активности препарата. При этом не найдено существенного различия в цитотоксичности свободного или включенного в липосомы доксорубицина. Пустые липосомы не проявили цитотоксичности;
2) в комбинации с ГТ (43 °С) цитотоксичность доксорубицина повышается, но не обнаружено значимого различия между свободным и липосомальным препаратом в дозе 0,1 и 0,2 мкмоль/л. Однако значительное увеличение цитотоксичности липосомального доксорубицина (в 1,2 раза) наблюдается при использовании препарата в относительно малой дозе (0,05 мкмоль/л).
ВЛИЯНИЕ ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ ВНУТРИ ЛИПОСОМЫ НА СКОРОСТЬ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ЛВ
В экспериментах было показано, что на интенсивность высвобождения содержимого из везикул влияет разница осмотического давления, создаваемого макромолекулами ЛВ внутри липосомы и в окружающей их среде [13-55; Naoto Oku, 1994]. Чем осмотическое давление водной фазы липосом больше давления окружающего раствора, тем быстрее происходит термозависимый (40-42 °С) разрыв липосомальной мембраны и выход содержимого в окружающую среду.
В эксперименте готовили липосомы, состоящие из DPPC, DSPC и дицетилфосфата (DCP) в молярном соотношении 9:1:1 с включенными ЛВ: состав с кальце-ином (натрия глюконат, содержащий флюорофор); состав с флюоресцеинизотиоцианатдекстраном (FD) различной молекулярной массы: FD-10cMr= 9400 и FD-150cMr =144 000.
Установлено, что в момент фазового перехода термолипидов липосомальной мембраны высвобождение ЛВ протекало максимально интенсивно при осмотическом давлении внутри везикул 1,2 osM (осмотическое давление фосфатного буфера = 0,3 osM). Так, практически в 2 раза увеличилось высвобождение ЛВ из липосом с осмотическим давлением 0,6 osM по сравнению с липосомами, у которых оно не превышало 0,3 osM. Максимальный выход ЛВ зафиксирован для липосом с наибольшим осмотическим давлением — 1,2
osM в случаях как с кальцеином, так и с FD-10. Далее стабильность липосом с кальцеином проверяли в фосфатном буфере и в 50% бычьей сыворотке. Все составы липосом были устойчивы не менее 2 мес. при температуре 4 °С. Высвобождение кальцеина из липосом в сыворотке крови при температуре 37 °С увеличивалось во времени пропорционально их осмотическому давлению. Предполагается, что в момент перехода липидов липосомального бислоя из геля в жидкокристаллическое состояние высокое осмотическое давление внутри липосом обеспечивает направленный ток окружающего раствора внутрь липосом, липидная мембрана разрывается, высвобождая ЛВ, при этом концентрация макромолекул ЛВ в окружающей среде резко увеличивается. В эксперименте наиболее стабильными в условиях буфера и сыворотки при температуре 37 °С оказались липосомы с осмотическим давлением 0,6 osM. Уровень высвобождения препарата за 8 ч не превышал 10 % как в одном, так и в другом случае. Поэтому термочувствительные липосомы состава DPPC/DSPC/DCP (в соотношении 9:1:1) с осмотическим давлением внутренней водной фазы 0,6 osM предложены авторами работы для дальнейших исследований in vivo.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПОНЕНТОВ СЫВОРОТКИ НА ФУНКЦИИ ЛИПОСОМ, ТАКИЕ КАК ДОСТАВКА И ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ЛВ
Сыворотка крови содержит много протеинов, которые могут взаимодействовать с липосомами, изменяя их стабильность и термочувствительность. Scherphof и соавт. (1981) показали, что липопротеины крови способны разрушать липосомальную мембрану. В дальнейшем рядом авторов проводились исследования по изучению влияния компонентов сыворотки на функции липосом. В результате исследований in vitro было обнаружено, что высвобождение ЛВ из термолипосом шло более интенсивно в присутствии сыворотки по сравнению со стандартным буфером.
В эксперименте был проведен сравнительный анализ 2 типов липосом с митомицином С, состоящих из нейтрального DPPC-липида и сочетания этого липида с отрицательно заряженным (DPPG) в условиях буфера и плазмы при различной температуре. В присутствии плазмы при температуре 44 °С отмечалось 100%-е высвобождение ЛВ независимо от состава липосом, в то время как в буферной системе при той же температуре отмечалось высвобождение ЛВ лишь на 81 и 87 % соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о взаимодействии липосом с сывороточными белками и повышении высвобождения ЛВ при достижении температуры фазового перехода липосомальной мембраны.
Для выявления зависимости высвобождения мито-мицина С из липосом их инкубировали в течение 60 мин при температуре 37 и 42 °С в буферной системе и в присутствии плазмы. Оба состава липосом показали максимальное высвобождение ЛВ при температуре
42 ° С в присутствии плазмы. Высвобождение ЛВ из нейтральных липосом достигло плато в значении 88 % при температуре 42 °С в буферном растворе и возросло до 99 % в присутствии плазмы. После смешивания анионных липосом (ОРРС/ОРРв) с плазмой при температуре 42 °С суммарный потенциал мембраны значительно вырос (с -46 до -31), а для нейтральных липосом практически не изменился. При этом последующее нагревание липосомальной дисперсии до температуры 42 °С в плазме никак не повлияло на мембранный потенциал обоих составов.
Ниже температуры фазового перехода мембранных липидов альбумин минимально связан с липосомальной мембраной, однако по мере приближения температуры к 42 °С количество связанного белка увеличивается и при достижении температуры фазового перехода липидов наблюдается максимальное значение этого показателя.
Основываясь на результатах вышеописанных исследований, а также на интерпретации кривых дифференциальной сканирующей калориметрии, авторы статьи предполагают, что при температуре ниже таковой фазового перехода липосомальных липидов белки плазмы связаны с анионными липосомами за счет электростатических взаимодействий между фосфолипидами и белковыми молекулами, в то время как нейтральные липосомы в очень малой степени способны взаимодействовать с белками плазмы. Благодаря присутствию плазменных белков, адсорбирующихся на липидной мембране за счет электростатических взаимодействий, липидный бислой становится стабильнее и препятствует случайному высвобождению ЛВ из липосом (ОРРС/ОРРв) при температуре ниже таковой фазового перехода липидов (высвобождение не более 15 %).
Однако для ОРРС липосом в среде плазмы характерно увеличение высвобождения препарата при температуре ниже таковой фазового перехода липидов, что, возможно, обусловлено взаимодействием последних с протеинами плазмы, которые, по некоторым данным, способны вытягивать липиды из липосомального бислоя и таким образом дестабилизировать мембрану, способствуя преждевременному высвобождению ЛВ в кровоток.
Когда же температура достигает таковой фазового перехода липосомальной мембраны, электростатические взаимодействия с белком подавляются. По данным кривых дифференциальной сканирующей калориметрии, пик, соответствующий значению фазового перехода липидной мембраны, расширяется и почти исчезает. Этот эффект может быть обусловлен уже другим механизмом — гидрофобными взаимодействиями между липидами мембраны и белками плазмы. Белок, связанный липидным бислоем, способен растягивать фосфо-липидную структуру, дестабилизируя и изменяя липосомальную мембрану. Следовательно, гидрофобные взаимодействия протеинов с липидным бислоем индуцированы за счет фазового превращения липидов. Результаты, отражающие максимальное связывание альбумина с липосомами обоих составов при температуре
42 °С, поддерживают эту гипотезу. Таким образом, несмотря на то что оба состава липосом показали максимальное высвобождение ЛВ при температуре 42 °С в присутствии плазмы, наиболее рациональным составом термолипосом в данном эксперименте по критерию устойчивости в плазме при физиологической температуре выбран DPPC/DPPG [12; 13].
Доказано, что термочувствительность липосом, их стабильность в биологических жидкостях и продолжительность нахождения в кровотоке определяются составом компонентов липосомальной мембраны и их соотношением в бислое. Для проведения исследований in vitro по изучению механизма высвобождения доксорубицина в бычьей сыворотке и человеческой плазме авторы искали липосомальную композицию, способную длительное время оставаться в кровяном русле и противостоять захвату макрофагами РЭС, с максимальной термостабильностью и четким фазовым переходом липидов мембраны. В эксперименте использовали липосомы состава DPPC/HSPC/CHOL/PEG-PE в соотношениях 100:50:0:0, 100:50:75:0, 100:50:0:3, 100:50:30:6, 50:50:100:0 и 50:50:50:0. По данным кривых дифференциальной сканирующей калориметрии четкий фазовый переход наблюдался у липосом с соотношением холестерин/фосфолипид 5:1, у других композиций четкие пики, соответствующие переходу фосфолипидов мембраны, отсутствовали.
При исследованиях in vitro в фосфатном буфере у всех изучаемых типов липосом высвобождение препарата увеличивалось с повышением температуры, однако присутствие в составе некоторых композиций молекул холестерина значительно снижало уровень высвобождения препарата как при 37 °С, так и в условиях ГТ.
В среде бычьей сыворотки у липосом всех типов по сравнению с буфером наблюдалась одинаковая закономерность высвобождения ЛВ: с увеличением количества холестерина в липосомах усиливалось высвобождение препарата при температуре 37 °С, а с повышением температуры (до 45 °С) оно начинало снижаться. Как в среде бычьей сыворотки, так и в человеческой плазме минимальное высвобождение ЛВ при нормальных условиях и максимальное в условиях ГТ характерно для липосомальной композиции DPPC/HSPC/CHOL/PEG-PE в соотношении 100:50:30:6, в то время как у остальных липосом разница высвобождения в таких условиях была минимальной. Таким образом, данная композиция рекомендована для дальнейшего изучения in vitro и in vivo.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В БОРЬБЕ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ (МЛУ)
В последнее время все большее внимание стали уделять проблеме, связанной с возникновением резистентности опухолевых клеток к ЛВ.
Среди механизмов, обеспечивающих возникновение резистентности, выделяют следующие:
— увеличение активности различных ферментативных систем в опухолевых клетках, таких как глута-тион^-трансфераза, глутатионпероксидаза, суперок-сиддисмутаза, топоизомераза II или гексафосфатной метаболизм;
— избыточное образование трансмембранного белка гликопротеина, который работает по принципу помпы, обеспечивая активный выброс попавших в клетку ксенобиотиков, что может быть обусловлено избыточной экспрессией гена гликопротеина [5].
Этот белок присутствует почти во всех здоровых клетках органов человека (почки, печень, селезенка и др.) и отвечает за выброс биологически активных соединений.
Отмечена резистентность к следующим ЛВ: ант-рациклины, алкалоиды барвинка, эпиподофиллоток-син, дактиномицин, митоксантрон, таксол и их производные.
Существует множество препаратов, способных подавлять MЛУ, это такие, как верапамил, дилтиазем, гуанин, гуанидин, резерпин, тамоксифен, циклоспорин А. Однако для этого необходимы очень высокие дозы ЛВ, применение которых может привести к выраженному токсическому эффекту.
Одним из путей борьбы с лекарственной резистентностью является использование инкапсулированных форм ЛВ, обеспечивающих проникновение препарата внутрь резистентных клеток за счет слияния липосом с клеточной мембраной (минуя взаимодействие с гликопротеинами) [39]. В 1993 г. J. L. Merlin на модели аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 показал рациональность применения ГТ в сочетании с липосомальной композицией DPPC/DSPC/CH 5:4:2 для преодоления МЛУ [39]. В работе исследовалось действие термолипосом (DPPC/DSPC/CH = 5:4:2) и свободного доксорубицина на чувствительные и резистентные клетки аденокарциномы человека при температуре 37 и 43 °С. Резистентность (R) к свободному доксорубицину в R-опухолевых клетках была в 200 раз выше, чем в чувствительных. При введении в чувствительные опухолевые клетки свободного и инкапсулированного препарата в дозе 0,15 и 0,35 мкмоль/л при температуре 37 °С в обоих случаях цитотоксичность была приблизительно одинакова, пропорциональна дозе 48 и 22 % выживших клеток для свободного ЛВ и 52 и 24 % — для липосомального. В условиях локальной ГТ (43 °С) произошло усиление эффекта как свободного ЛВ (10 и 1 %), так и липосомального доксорубицина (9 и 1 %) в 5 раз. Это может быть связано прежде всего с тем, что опухолевые клетки изолированы от воздействия окружающей среды и ЛВ оказывает на них, таким образом, непосредственное влияние [39].
Изучая in vitro характер внутриклеточного накопления даунорубицина в P-гликопротеинэкспрессирую-щей линии клеток при действии термолипосом в сочетании с ГТ, J. L. Merlin и соавт. (1995) обнаружили также значительное увеличение захвата липосомального препарата клетками MCF-7 [40].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подводя итог, можно отметить, что рациональность использования липосомальных лекарственных форм в настоящее время доказана на ряде противоопухолевых препаратов. Возможность регуляции избирательности распределения липосом в организме является актуальной задачей и активно изучается в целях разработки терапевтических препаратов для режимов как обычной химиотерапии, так и для фотодинамичес-кой терапии. В настоящее время наибольший интерес представляют исследования в области использования липосомальных препаратов в комбинации с УЗ- и ГТ-воздействием, что позволяет увеличить селективность доставки ЛВ к опухоли.
Для сочетанного применения липосом с локальной гипертермией изучаются термочувствительные липосомы, когда выход ЛВ в опухоли контролируется с помощью нагрева пораженной области. Для создания термолипосом используются липиды, фазовый температурный переход которых находится в пределах
38-42 °С. Работы проводятся in vitro и in vivo по подбору рациональных композиций термолипосом, оценивается дифференциальная термостабильность липосом, скорость высвобождения лекарств и соответствующий цитотоксический эффект. На интенсивность высвобождения лекарств из липосом влияет разность осмотического давления, создаваемая внутри липосом и в окружающей их среде. Чем выше осмотическое давление внутри липосом, тем быстрее ГТ вызывает разрыв липосомальной мембраны и высвобождает ЛВ в пораженную зону. Предложена липосомальная композиция DPPC/HSPC/CH в соотношении 100:50:30:6, для которой минимальное высвобождение ЛВ в среду бычьей сыворотки или человеческой плазмы наблюдается при температуре 37 °С, а максимальное — в условиях ГТ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А. Ю., Оборотова Н. А. Иммуно-липосомы — новые средства доставки лекарственных препаратов // Совр. онкол. — 2001. — Т. 3, № 2. — С. 44-46.
2. Меерович И. Г., Оборотова Н. А. Применение липосом в фотохимиотерапии: 1. Липосомы в ФДТ // Рос. биотер. журн. — Т. 2, № 4. — С. 3-8.
3. Меерович И. Г., Смирнова З. С., Лукьянец Е. А. Фенилтиозамещенные фталоцианины — новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона // Рос. биотер. журн. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 54-60.
4. Оборотова Н. А. Липосомальные лекарственные формы противоопухолевых препаратов // Хим.-фармацевт. журн. — 2001. — Т. 34, № 4. — С. 32-38.
5. Оборотова Н. А., Барышников А. Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современ. онкол. — 2001. — Т. 121, № 5.
— С. 464-475.
6. Arancia G., Calcabrini A., Matarrese P. et al. Effect of incubation with liposomes at different tempera-
ture on cultured melanoma cells (M14) // Int. J. Hyperthermia. — 1994. — Vol. 10. — P. 101-114.
7. Chelvi T. P., Ralhan R. Designing of termosensi-tive liposomes from natural lipids for multimodality cancer therapy // Int. J. Hypertermia. — 1995. — Vol. 11. — P. 685-695.
8. Dass C. R., Walker T. L., Burton M. A., Decruz E. E. Enhanced anticancer therapy mediated by specialized liposomes // J. Pharmac. Pharmacol. — 1997. — Vol. 49.
— P. 972-975.
9. Dewhirst M. W., Proznitz L., Thrall D. et al. Hyperthermic treatment of malignant diseases: Current status and a View toward the Future // Seminars in Oncology. — 1977. — Vol. 24, No. 6. — P. 616-625.
10. Durar T., Jain R. Differential response of normal and tumor microcirculation of hypertermia // Cancer Res.
— 1984. — Vol. 44. — P. 605-612.
11. Falk M. N., Issels R. D. Hyperthermia in oncology // Int. J. Hyperthermia. — 2001. — Vol. 17, No. 1. — P. 1-18.
12. Gaber M.H. Effect of bovine serum on the phase transition temperature of cholesterol-containing liposomes // J. Microencaps. — 1998. — Vol. 15. — P. 207-214.
13. Gaber M. H., Hong K., Huang S. K., Wu N. Z., Papahadjopoulos. Termosensitive sterically stabilized liposomes: formulation and in vitro studies of mechanism of doxorubicin release by bovin serum and human plasma // Pharmac. Res. — 1995. — Vol. 12. — P. 1407-1416.
14. Gaber M. H., Hong K., Wu N. Z. et al. Termosensitive liposomes: extravasation and release of contents in tumor microvascular // Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. — 1996. — Vol. 36, No. 5. — P. 1177-1187.
15. Gerlowsky L., Jain R. Effect of hypertermia on microvascular permeability to macromolecules in normal and tumor tissues // Int. J. Microcirc. Clin. Experiment. — 1985. — Vol. 4. — P. 363-372.
16. Green S., Fortier A., Dukstra J. et al. Liposomal vaccines // Advances in Experiment. Med. Biol. — Vol. 383. — P. 83-92.
17. Hahn G.M., Braun J., Har-Kedar I. Thermochemotherapy: synergism between hypertermia and adri-amicin in mammalian cell inactivation / Proceeding of the Natural Academy of Science of the United States of America. — Vol. 72. — P. 937-940.
18. Harrington K. J., Lewansski C. R., Stewart J. S. W. Liposomes as Vechicles for Targeted Therapy of Cancer. Part 2: Clinical Development // Clin. Oncol. — 2000. — Vol. 12. — P. 16-24.
19. Herman T. S. Temperature dependence of adri-amycin, cis-diamminedichloroplatinum, bleomycin, and 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea cytotoxity in vitro // Cancer Res. — Vol. 43. — P. 517-520.
20. Hildebrandt B., Wust P., Ahlers O. et al. The cellular and molecular basis of hyperthermia // Crit. Rev. Oncol. Hematol. — 2002. — Vol. 43. — P. 33-56.
21. Horsman M. R., Overgaard J. Can mild hyperthermia improve tumor oxygenation? // Int. J. Hyperthermia. — Vol. 13. — P. 141-147.
-e-
22. Hosokawa T., Sami M., Kato Y., Hayakawa E. Alteration in the temperature — dependent content release property of termosensitive liposomes in plasma // Chem. Pharm. Bull. — 2003. — Vol. 51, No. 1. — P. 1227-1237.
23. Ickenstein M. L., Arfvidsson C. M., Needham D. Disk formation in cholesterol-free liposomes during phase transition // Biochim. Biophys. Acta. — 2003. — Vol. 1614. — P. 135-138.
24. Iga K., Hamaguchi N., Igari Y. et al. Heat-specific drug release of large unilamellar vesicle as hypertermia-mediated targeted delivery // Int. J. Pharmac. — 1989. — Vol. 57, No. 3. — P. 241-251.
25. Iga K., Ogawa Y., Toguchi H.Heat induced drug release rate and maximal targeting index of termosensitive liposomes in tumor bearing mice // Pharmac. Res. — 1992. — Vol. 9, No. 5. — P. 658-662.
26. Jain R. K. Transport of molecules across tumor vasculature // Cancer Metast. Rev. — 1987. — Vol. 6. — P. 559-593.
27. Kakinuma K., Tanaka R., Takahashi H. et al. Targeting chemotherapy for malignant brain tumor using thermosensitive liposome and localized hyperthermia // J. Neurosurg. — 1988. — Vol. 84. — P. 180-184.
28. Kirby C., Clarke J., Gregoriadis G. Effect of cholesterol content of small unilamellar vesicles on the stability in vivo and in vitro // Biochem. J. — 1980. — Vol. 186.
— P. 591-598.
29. Kong G., Dewhirst M. Hyperthermia and liposomes // Int. J. Hyperthermia. — 1999. — Vol. 15. — P. 345-370.
30. Lee A.G. Lipid phase transition and phase diagrams. Lipid phase transition // Biochim. Biophis. Acta.
— 1977. — Vol. 472. — P. 237-281.
31. Litzinger D., Huang L. Phosphotidylethanola-mine liposomes: drug delivery, gene transfer, and immun-odiagnostic applications // Biochim. Biophis. Acta. — 1992. — Vol. 113. — P. 201-227.
32. Litzinger D., Buiting A. M. J., van Rooijen N., Huang L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution and amphipaphic polyethylene glycol-containing liposomes // Biochim. Biophis. Acta. —
1994. — Vol. 1190. — P. 99-107.
33. Magin R. L., Niesman M. R. Temperature-dependent drug release from large unilamellar liposomes // Cancer Drug Delivery. — 1984. — Vol. 1. — P. 109-117.
34. Magin R. L., Niesman M. R. Temperature-dependent permeability of large unilamellar liposomes // Chem. Phys. Lipids. — 1984. — Vol. 34. — P. 245-256.
35. Massing U.Cancer therapy with liposomal formulations of cancer drugs // Int. J. Clin. Pharm. Ther. — 1997. — Vol. 35. — P. 87-90.
36. Majer L. D., Tai L., Ko D. et al. Influence of vesicle size, lipid composition, and drug-to-lipid ratio on the biological activity of liposomal doxorubicin in mice // Cancer Res. — 1989. — Vol. 49. — P. 5922-5930.
37. Merlin J. L. Encapsulation of doxorubicin in thermosensitive small unilamellar vesicle liposomes // Eur. J. Cancer. — 1991. — Vol. 27. — P. 1026-1030.
38. Merlin J. L. In vitro evaluation of the association of thermosensitive liposome — encapsulated doxorubicin with hyperthermia // Eur. J. Cancer. — 1991. — Vol. 27.
— P. 1031-1034.
39. Merlin J. L., Marchal S., Ramacci C. et al. Antiproliferative activity of thermosensitive liposome-encapsulated doxorubicin combined with 43 degrees C hyperthermia in sensitive and multidrug — resistant MCF-7 cells // Eur. J. Cancer. — 1993. — Vol. 29A. — P. 2264-2268.
40. Merlin J. L., Marchal S., Ramacci C. et al. Modulation of daunorubicin intracellular accumulation in P-glycoprotein expressing MCF-7 human breast adenocarcinoma cells by thermosensitive — liposome encapsulation and hyperthermia // Int. J. Hyperthermia. — 1995. — Vol. 11. — P. 855-865.
41. Muggia F. Clinical efficacy and prospects for use of pegylated liposomal doxorubicin in the treatment of ovarian and breast cancers // Drugs. — 1997. — Vol. 54.
— P. 22-29.
42. Ning S., Macleod K., Abra R. M., Huan A.H. Hyperthermia induces doxorubicin release from long-circulating liposomes and enhances their antitumor efficacy // Int. J. Rad. Oncol., Biol., Phys. — 1994. — Vol. 29. — P. 827-834.
43. Oku Noato, Naruse Ryoko, Doi Kanak, Okada Shoji. Potential usage of termosensitive liposomes for macromolekular delivery // Biochim. Biophys. Acta. —
1994. — Vol. 119. — P. 389-391.
44. Ono A., Horikoshi I., Ueno M. Study on hepatic artery chemoembolization using temperature-sensitive liposome or lipiodol emulsion // Biol. Pharm. Bull. —
1995. — Vol. 18(2). — P. 279-283.
45. Papahadjopoulos D., Jacobson K., Nir S. Phase transitions in phospholipid vesicles. Fluorescence polarization and permeability measurements concerning the effect of temperature and cholesterol // Biochim. Biophys. Acta. — 1973. — Vol. 311. — P. 330-348.
46. Pence D., Song C. Effects of heat on blood flow. Hyperthermia in cancel — treatment / Ed. by L. Anghileri, J. Robert. — Boca Raton, FL: CRC Press, 1986. — P. 1-16.
47. Senior J., Gregoriadis G. Stubility of small unilamellar liposomes in serum and cliarence from the circulation. The effect of the phospholipids and cholesterol content // Life Sci. — 1982. — Vol. 30. — P. 2123-2136.
48. Shinkai M., Suzuki M., Iijima S., Kobayashi T. Antibody-conjugated magnetoliposomes for targeting cancer cells and their application in hyperthermia // Biotech. Applied Biochem. — 1995. — Vol. 21. — P. 125-137.
49. Shinkai M., Yanase M., Honda H. et al. Intracellular hyperthermia for cancer using magnetite cationic liposomes: in vitro study // Japan. J. Cancer Res.
— 1996. — Vol. 87. — P. 1179-1183.
50. Song C. Effects of local hyperthermia on blood flow and microenvironment: a review // Cancer Res. — 1984. — Vol. 44. — P. 4721-4730.
51. Song C., Kang M. S., Rhee J. G., Levirr S. H. Effect of hyperthermia on vascular function in normal and
О
neoplastic tissues // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1980. — Vol. 335. — P. 35-43.
52. Song C., Lokshina A., Rhee J. G., Patten M., Levitt S. H. Implication of blood flow in hyperthermic treatment of tumors // IEEE Transact. Biomed. Engin. — 1984. — Vol. 31. — P. 9-16.
53. Tomita Т., Watanabe M., Takahashi Т. et al. Temperature-sensitive release of adriamycin, an amphiphilic antitumor agent, from dipalmitoylphos-phatidylcholine — cholesterol liposomes // Biochem. Biophys. Acta. — 1989. — Vol. 978. — P. 185-190.
54. Torchilin V. P. Liposomes as delivary agents for medical imaging // Molec. Med. Today. — 1996. — Vol.
2. — P. 242.
55. Unezaki S., Maruyama K., Takahashi N. et al. Enhanced delivery and antitumor activity of doxorubicin using long-circulating thermosensitive liposomes containing amphipathic polyethyleneglycol in combination with local hyperthermia // Pharmac. Res. — 1994. — Vol. 11.
— P. 1180-1185.
56. Yanase M., Shinkai M., Honda H. et al.
Intracellular hyperthermia for cancer using magnetite cationic liposomes: ex vivo study // Japan. J. Cancer Res.
— 1997. — Vol. 88. — P. 630-632.
57. Yanase M., Shinkai M., Honda H. et al.
Intracellular hyperthermia for cancer using magnetite
cationic Liposomes: an in vivo study // Japan. J. Cancer Res. — 1998. — Vol. 89. — P. 463-469.
58. Yatvin M. B., Weinstein J. N., Dennis W. H., Blumenthal R. Design of liposomes for enhanced local release of drugs by hyperthermia // Science. — 1978. — Vol. 202. — P. 1290-1293.
59. Yatvin M. B., Muhlensiepen H., Porschen W. et al. Selective delivery of liposome-associated cis-dichloro-diaminineplatinum(ll) by heat and its influence on tumor drug uptake and growth // Cancer Res. — 1981. — Vol.
41. — P. 1602-1607.
60. Yuyama Y., Tsujimoto M., Fujimoto Y., Oku N. Potential usage of termosensitive liposomes for site-specific delivery of cytokines // Cancer Lett. — 2000. — Vol. 155. — P. 71-77.
61. Yuan F., Dellian M., Fukumura D. et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cut off size // Cancer Res. — 1995. — Vol. 55. — P. 3752-3756.
62. Zhao Y., Cao Y., Yuan F et al. Differential sensitivity of several tumor lines to a doxorubicin containing low temperature sensitive liposomes: microenvironmental effects / Symposium: Strategies for Targeted Therapeutic Delivery, 2000. — P. 123-124.
Поступила 05.10.05
