CC BY
829
УДК 576.316.24
Теломераза: методы определения активности
Д. А. Скворцов*, М. Э. Зверева, О. В. Шпанченко, О. А. Донцова
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 02.11.2010 г.
РЕФЕРАТ Укорачивание концов хромосом (теломер), обусловленное полуконсервативным механизмом репликации ДНК, определяет возможное число делений клетки, играя роль «клеточных часов». Теломераза удлиняет одну из цепей теломеры, компенсируя ее укорачивание, поэтому теломеразная активность служит маркером пролиферативной активности клеток. В подавляющем большинстве нормальных клеток человека теломераза неактивна, в отличие от эмбриональных тканей, стволовых клеток и репродуктивных органов. Теломераза активируется в большинстве злокачественных опухолей, что можно использовать для диагностики неопластической трансформации. Поэтому разработка методов определения теломераз-ной активности привлекает внимание исследователей. Тестирование теломеразной активности необходимо при поиске ингибиторов теломеразы - потенциальных противоопухолевых средств. Кроме того, активация теломеразы может играть положительную роль при регенерации тканей, к примеру, после частичного удаления печени или инфаркта миокарда.
Все методы определения активности теломеразы можно разделить на две большие группы: методы, основанные на прямом определении синтезированной теломеразой ДНК, и методы, использующие различные схемы усиления сигнала от ДНК, созданной теломеразой. Рассмотренные в представленном обзоре методы пригодны для тестирования теломеразной активности в клетках простейших, отдельных клетках клеточных линий, смешанных клеточных популяциях и тканях.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА теломераза, методы определения активности, онкодиагностика, физико-химические методы, определение ДНК.
что такое теломераза и зачем определять ее активность
В 1961 г. Хейфлик и Мурхиад показали, что культура соматических клеток имеет ограниченный период жизни (предел Хейфлика) [1]. В 1973 г. Олов-ников предположил, что возможное число делений клетки определяется укорачиванием концов хромосом - теломер [2], играющих роль «клеточных часов». Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и регуляции транскрипции генов прителомерной области [3, 4]. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), существует механизм, компенсирующий укорачивание теломер. В 1985 г. Блекберн и Грейдер открыли теломеразу - фермент, удлиняющий одну из цепей теломеры [5].
Теломераза представляет собой РНК-белковый комплекс, основные компоненты которого - РНК-матрица для синтеза теломер (ТЕИС), выполняющая также структурную функцию, и обратная транскриптаза (ТЕИТ) [6]. Теломеразный комплекс
(теломераза) связывается с теломерой или олигонуклеотидом, последовательность которого может не совпадать с теломерной последовательностью (теломеримитирующий олигонуклеотид), и синтезирует короткий фрагмент ДНК (GТТAGG у млекопитающих). Затем теломераза передвигается на конец теломеры (транслокация) и вновь синтезирует фрагмент ДНК (рис. 1). Активность теломеразы пропорциональна общему количеству синтезированной ею ДНК, а процессивность пропорциональна длине синтезированных фрагментов.
Теломеразная активность служит маркером пролиферативной активности клеток. Компоненты теломеразы могут выполнять функции, не зависящие от сборки активного комплекса. Например, hТЕRТ (ТЕИТ человека) независимо от присутствия hТЕRC (ТЕИС человека) может работать как РНК-зависимая РНК-полимераза [7]. Повышение экспрессии hТЕRC не всегда совпадает с появлением теломеразной активности [8]. hТЕRC ингибирует протеинкиназу АТИ, мишенями которой являются
Теломераза
Связывание с теломерой/олигонуклеотидом
AUCCCAAUC|
Теломера или олигонуклеотид .TTAGGGTTAGGGTTAG
| AUCCCAAUC ...TTAGGGTTAGGGTTAG
Элонгация
AUCCCAAUC
.TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG
Диссоциация с теломеры/олигонуклеотида
Рис. 1. Общая схема работы теломеразного комплекса.
Транслокация
известный супрессор опухолевого роста p53 и про-теинкиназа контрольных точек CHK1, входящая в систему проведения сигналов от поврежденной ДНК. Снижение уровня hTERC приводит к остановке клеточного цикла в фазах G1 и G2 в результате активации белка p53 и протеинкиназы CHK1, но механизм этого остается неизвестным [9].
Активность теломеразы не выявляется в подавляющем большинстве нормальных клеток человека, но присутствует в репродуктивных органах и эмбриональных тканях. Этот фермент активен в стволовых клетках и некоторых быстро обновля-
ющихся тканях, например в эпителии кишечника, но в этом случае активность теломеразы, как правило, ниже, чем в опухолевых клетках (рис. 2). Те-ломеразная активность более характерна для злокачественных опухолей, в доброкачественных опухолях ее активность и частота обнаружения заметно ниже [lO]. Определение теломеразной активности используется как для диагностики опухолей, так и для поиска потенциальных противоопухолевых средств - ингибиторов теломеразы. Кроме того, теломераза участвует в регенерации тканей после частичного удаления печени и инфаркта миокар-
Рис. 2. Зависимость длины теломер от числа делений в различных типах клеток: эмбриональных клеточных линиях, соматических клетках и трансфицированных hTERT клетках. А - достижение клетками предела Хейфлика; Б -кризис, сопровождающийся гибелью клеток и перерождением уцелевших в опухолевые;
В - трансфекция клеток геном hTERT.
Таблица 1. Некоторые олигонуклеотиды, используемые в различных модификациях TRAP
да. Роль теломеразы в старении в связи с работой теломер как «клеточных часов» также привлекает внимание.
методы с амплификацией синтезированной
ТЕЛОМЕРАзОЙ ДНК (TRAP)
Среди методов определения активности теломера-зы наиболее распространен TRAP (протокол амплификации теломерных повторов) [11], позволяющий, благодаря некоторым модификациям, проводить полуколичественный и количественный анализ. Существуют модификации, при которых повышается скорость анализа, радиоактивная метка заменяется немечеными соединениями, снижается количество побочных продуктов и т.д., например, методы сцин-
тилляционного анализа сближения, гибридизаци-онной защиты, транскрипционной амплификации, экстракции магнитными шариками [12]. Некоторые модификации дают возможность определять активность теломеразы даже в одной клетке [13].
Протокол амплификации теломерных повторов можно разбить на три основных этапа: удлинение праймера, амплификация синтезированной тело-меразой ДНК и детекция. На стадии удлинения теломерные повторы добавляются теломеразой, присутствующей в клеточном экстракте, к теломе-римитирующему олигонуклеотиду (TS, см. табл. 1). После этого проводят ПЦР-амплификацию синтезированной теломеразой ДНК с использованием специфических праймеров (теломеримитирующего и обратного). На этом этапе в синтезированную те-ломеразой ДНК могут включаться различные метки: радиоактивная, флуоресцентная, аффинная. Затем следует детекция (в оригинальном методе с электрофоретическим разделением продуктов ПЦР и фотографированием) (рис. 3).
Исходный метод TRAP не свободен от ряда недостатков. При амплификации продуктов ПЦР первоначально применяли олигонуклеотид CX, имевший комплементарное перекрывание в несколько олигонуклеотидов с TS. Это приводило к образованию димеров праймеров и продуктов, возникающих из-за взаимодействия между праймерами. Даже при использовании оптимального праймера ACX
Олиго- нуклеотид Нуклеотидная последовательность
TS 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
CX 5'-(CCCTTA)3CCCTAA-3'
ACX 5'-GCGCGG(CTTACC)3CTAACC-3'
RP 5'-TAGAGCACAGCCTGTCCGTG-3'
RPC3 5'-TAGAGCACAGCCTGTCCGTG(CTAACC)3-3'
TSG4 5’-GGGATTGGGATTGGGATTGGGTT-3’
Рис. 3. Схема протокола амплификации теломерных повторов (TRAP).
с некомплементарным TS-концом при анализе концентрированных экстрактов опухолевых тканей может появляться фоновый сигнал [14]. Другая проблема состоит в том, что если использовать обратные праймеры, полностью соответствующие теломерным повторам, то праймеры отжигаются в ходе ПЦР не по краям матрицы (в силу периодичности теломер) и появляются ложные сигналы. Эту проблему решают, добавляя на края праймера дополнительные некомплементарные теломерам участки (табл. 1) с 5’-концевым нетеломерным «довеском» из 6 нуклеотидов. Может использоваться комбинация нескольких праймеров, используемых в качестве обратных, для уменьшения неспецифических сигналов (подробнее о двухпраймерной системе далее, праймеры RP и RPC3 приведены в табл. 1). В смесь TRAP для оценки влияния стабилизирующих квадруплексы ингибиторов может добавляться олигонуклеотид TSG4 (табл. 1), который не требует синтеза теломеразой нескольких повторов до начала действия ингибитора [15]. Более подробно преимущества и недостатки различных олигонуклеотидов, используемых в TRAP, рассмотрены в работе [12]. Кроме того, если использовать ПЦР для амплификации сигнала, то на результат определения теломе-разной активности могут влиять ингибиторы ПЦР, содержащиеся в образце.
Первоначально в методе TRAP продукты ПЦР выявляли в полиакриламидном геле (ПААГ) по радиоактивной метке, которую вводили с помощью радиоактивно меченного праймера или встраивали в ДНК в ходе реакции. Метод позволяет качественно оценивать активность и процессивность теломеразы в экстрактах клеток и тканей, но, как уже сказано, нуждается в радиоактивных препаратах.
ПЦР второй стадии TRAP позволяет получить достаточно ДНК для окрашивания в геле, например бромидом этидия [16] (достаточно сильный мутаген, чувствительность невысокая), нитритом серебра [17] (чувствительность, как при использовании радиоактивной метки, но метод более трудоемкий и сравнительно дорогой), Sybr Green [18] и его аналогами (чувствительность, как при использовании радиоактивной метки [19], а мутагенность гораздо ниже, чем у бромида этидия, хотя он также является интеркалирующим красителем). Возможно также и флуоресцентное ме-чение олигонуклеотидов, используемых в TRAP [20].
Очистка синтезированной теломеразой ДНК и эффективность TRAP
Получить экстракты опухолевых клеток или клеточных линий и определить в них теломеразную активность достаточно просто, тогда как ткани состоят из нескольких типов клеток и могут содержать ве-
щества, влияющие на количественную и даже качественную оценку теломеразной активности. Поэтому возможны ложноположительные или ложноотрицательные результаты, которые могут повлиять на правильность диагноза и прогноз заболевания. Определение теломеразной активности могут затруднять и особенности биопсийных образцов: большие объемы жидкости (кровь и т.д.) или присутствие многочисленных нормальных клеток. В этих случаях возможна экстракция синтезированной теломеразой ДНК при помощи модифицированных магнитных шариков. При этой процедуре ингибиторы ПЦР удаляются или сильно разбавляются. Метод TRAP с такой экстракцией состоит из трех основных этапов: удлинение субстратимитирующего олигонуклеотида теломе-разой, выделение синтезированной теломеразой ДНК с помощью модифицированных магнитных шариков, амплификация. На этапе экстракции синтезированную теломеразой ДНК гибридизуют с С-богатым био-тинилированным праймером (CCCTAA)2 и выделяют ее из реакционной смеси с помощью покрытых стреп-тавидином магнитных шариков. Затем синтезированную теломеразой ДНК высвобождают из комплекса с помощью нагревания и проводят ПЦР. Эта модификация имеет на порядок меньшую чувствительность к ингибиторам ПЦР по сравнению со стандартным TRAP и несколько большую эффективность при анализе тканевых и других комплексных образцов [21]. Вместо биотинилированного праймера и магнитных шариков можно использовать экстракцию фенолом и хлороформом [16], хотя при этом хуже удаляются примеси, хорошо растворимые в воде, а не в органических растворителях.
Внутренние стандарты TRAP
Учесть возможное присутствие в образцах ингибиторов Taq-полимеразы (например, гемсодержащих соединений) и осуществить общий контроль ПЦР позволяют внутренние стандарты (амплифицируе-мые с теми же праймерами, что и синтезированная теломеразой ДНК), которые также могут служить для нормирования количества синтезированной те-ломеразой ДНК. Наиболее распространены два стандарта - длиной 36 и 150 п.н. Стандарт 36 п.н. избыточно амплифицируется, если образцы имеют низкую теломеразную активность, конкурируя с синтезированной теломеразой ДНК и давая ложноотрицательный сигнал [18]. Стандарт 150 п.н. более чувствителен к присутствию ингибиторов Taq-полимеразы в реакционной смеси. Стандарты можно использовать в TRAP с ПЦР в реальном времени с праймерами, флуоресцентная метка которых отличается от метки в праймерах для амплификации синтезированной теломеразой ДНК [22].
MTS-праймер
И
1. Удлинение праймера MTS теломеразой
П 2. Связывание обратного праймера RP3g
V в первых двух циклах
RPC3-прaймeр
г, RPC3-прaймeр
Я 3. Синтез ДНК в первых двух циклах
4. Связывание RP-праймера в циклах 3-29
MTS-праймер
RP-праймер
В
5. Синтез ДНК в циклах 3-29
Рис. 4. Схема «двухпраймерного» TRAP [23, 24].
TRAP с праймерами с резонансным переносом энергии (FRET)
Один из вариантов окрашивания ДНК в методе TRAP - использование праймеров с энергопереносом (амплифлуоров). Амплифлуоры имеют уникальную шпилечную структуру, содержащую донор (флуоресцеин) и акцептор (4’-диметиламинофенил-азобензойная кислота). Флуоресценция появляется только в случае встраивания праймера в продукты ПЦР, т.е. отпадает необходимость в применении радиоизотопов и резко сокращается объем проводимого после ПЦР-анализа. Замена амплифлуора-ми субстрата теломеразы и обратного праймера позволяет добиться достаточно высокой интенсивности флуоресцентного сигнала. Праймеры, используемые для амплификации внутренних стандартов, должны иметь донорно-акцепторную пару с иной длиной волны флуоресценции, чем праймеры, используемые для амплификации синтезированной теломеразой ДНК [22].
Метод с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением (HTRF) сочетает стандартную технику FRET и флуо-рофоры с длительным временем затухания флуорес-
TRAP с дополнительным специфичным обратным праймером («двухпраймерный»)
«Двухпраймерный» TRAP - это модификация стандартного TRAP, предназначенная для уменьшения ложных сигналов (рис. 4).
В этом варианте TRAP отсутствует электрофоретический анализ продуктов ПЦР. В нем оценивается суммарная радиоактивность как критерий теломеразной активности. Синтезированная тело-меразой ДНК амплифицируется с использованием двух обратных праймеров, длиной 20 (RP) и 38 нуклеотидов (RPC3) (табл. 1), в присутствии [3H]TTP или [a-32P]dCTP, при этом длинного праймера добавляют в 50 раз меньше, чем короткого. После ПЦР двухцепочечную ДНК отделяют осаждением и фильтрацией. Преимущество этого метода состоит в том, что благодаря низкой концентрации праймера RPC3 уменьшается количество продуктов взаимодействия между праймерами, а присутствие стандартных количеств праймера RP обеспечивает значительную степень амплификации синтезированной теломера-зой ДНК [23, 24]. Метод позволяет качественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
©
©
TS-биотин
Амплификация в присутствии меченного криптатом европия аналога дезоксиуридин утрифосфата
>___
[к'
©г
Связанный с авидином флуорофор
!р $ К
HTRF/FRET-анализ
Рис. 5. Схема метода TRAP с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением [26]. F - флуорофор, а - авидин, b - биотин, K - меченный криптатом европия аналог дезоксиуридинтрифосфата.
Амплифицированные биотинилированные 3Н-меченные продукты теломеразы
Покрытые стрептави-дином флуоромикро-сферы, содержащие сцинтиллятор, излучающий в присутствии трития
Связывание Детекция излучения на сцинтилляторе
Рис. 6. Схема детекции в TRAP с помощью сцинтилля-ционного анализа сближения.
Амплифицированные
продукты теломеразы Акридин -меченный
~(Щ)
| Связывание зонда
csb
i
cgb
Фотодетекция
ценции. Метод основан на использовании криптатных комплексов европия или тербия. Данные лантаноиды обладают длительным периодом затухания флуоресценции, а комплексообразование с макроциклически-ми соединениями с образованием криптатных комплексов дополнительно увеличивает их стабильность [25]. Меченный криптатом европия аналог дезоксиури-динтрифосфата использовали для оценки количества ДНК в TRAP с биотинилированным олигонуклеотидом TS. После добавления конъюгата аллофикоцианин-стрептавидин ДНК в TRAP дает сигнал FRET [26] (рис. 5). Метод позволяет полуколичественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
TRAP с детекцией с помощью сцинтилляционного анализа сближения
Еще один вариант детекции амплифицированной в TRAP ДНК без ПААГ - сцинтилляционный анализ сближения. Использованный вместе с традиционным TRAP, он позволяет увеличить скорость анализа те-ломеразной активности. Субстратом в этом методе служат 5’-биотинилированные олигонуклеотиды, а амплификация происходит в присутствии [3H]TTP. Биотинилированная 3Н-меченная ДНК связывается с покрытыми стрептавидином флуоромикросферами, содержащими сцинтиллятор, излучающий в присутствии трития (рис. 6). Таким образом, вместо разделения ДНК в геле с последующей фотодетекцией выход продуктов ПЦР оценивают на сцинтилляционном счетчике, что позволяет сократить время анализа после ПЦР до 1 ч и полуколичественно определить
Рис. 7. Схема детекции в TRAP с детекцией методом «защиты гибридизацией».
активность теломеразы в больших сериях экстрактов тканей и клеточных линий. Чувствительность данного метода ограничена примерно 10 клетками. Основной недостаток метода - использование трития, кроме того, как и большинство методов детекции продуктов TRAP без ПААГ, он чувствителен к артефактам ПЦР [27].
TRAP с детекцией методом «защиты гибридизацией»
Более безопасной является модификация TRAP, в которой используется метод «защиты гибридизацией» (Hybridization protection assay-TRAP). В этом методе для детекции ДНК после амплификации применяют зонды, меченные ковалентно связанным акридином [28] (рис. 7). Эта же схема детекции используется в транскрипционной схеме амплификации теломеразных повторов. Метод позволяет полуколичественно определять активность теломе-разы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
TRAP в сочетании с иммуноферментным анализом (ИФА)
В методе TRAP-ИФА ДНК после амплификации определяют колориметрически, что позволяет качественно и полуколичественно оценивать теломе-разную активность. Биотинилирование TS-праймера дает возможность связывать амплифицированную ДНК с покрытыми стрептавидином микропланшета-
Биотинилированные
продукты реакции _
* * (DIG)
* Дигоксигенин-меченный
зонд
т Связывание дигоксигенин-меченного зонда
cDiG1
Связывание с покрытыми стрептавидином * титрационными микропланшетами
____.... Конъюгат
- '' ' антител к DIG и
--------/ фермента
Связывание конъюгата т антител к DIG и фермента
Рис. 8. Схема иммуноферментного определения продуктов ПЦР при TRAP-анализе (или продуктов теломе-разной реакции при прямом ИФА).
ми (рис. 8). Амплифицированная ДНК денатурирует, гибридизуется с меченными дигоксигенином (DIG) зондами, специфичными к теломерным повторам, и связывается с микропланшетами за счет взаимодействия стрептавидин-биотин. Этот комплекс выявляется с помощью поликлональных антител овцы к DIG, конъюгированных с пероксидазой хрена, активность которой определяют колориметрически [29, 30]. От гибридизационного варианта TRAP этот метод отличается появлением второго шага усиления сигнала за счет ферментативной реакции.
К недостаткам TRAP-ИФА можно отнести сложности с разделением теломераза-положительных и теломераза-отрицательных контролей, которые могут возникнуть из-за отсутствия внутренних кон-тролей и двух шагов усиления сигнала. Тем не менее метод TRAP-ИФА более быстрый по сравнению с TRAP, основанным на разделении амплифициро-ванной ДНК в геле, что позволяет использовать его в скрининговых исследованиях. Метод пригоден для полуколичественного определения активности теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
делять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии. Метод не имеет особых преимуществ перед другими методами, в которых не используют гель-электрофорез и радиоактивное мечение, но при этом достаточно трудоемок.
TRAP с ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени используют для одновременной амплификации ДНК и измерения количества продуктов, получаемых после каждого цикла амплификации. Стандартный TRAP в комбинации с ПЦР в реальном времени позволяет получать количественные результаты [32, 33]. Этот метод применим для изучения ингибиторов теломеразы и анализа больших серий образцов [12]. Сравнение с традиционным TRAP показывает, что без оценки количества продуктов ПЦР в реальном времени возможно завышение теломеразной активности и сглаживание небольших различий в активности из-за насыщения ПЦР-реакции на последних циклах. Кроме того, дополнительную проблему представляет возможность образования димеров праймеров и появление вследствие этого ложноположительного сигнала. Остроту этой проблемы можно снизить, если использовать обратный праймер с «якорем», мешающим образованию димеров, уменьшить количество праймеров и число циклов, в результате чего праймер-димеры образуются преимущественно на поздних циклах программы (35-39 циклов), в то время как в стандартном TRAP таких циклов 28. Эта проблема уменьшается и при измерении флуоресценции в ранней экспоненциальной фазе ПЦР [32]. Метод позволяет количественно определять активность теломера-зы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10-50 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
Как и стандартный TRAP с гель-электрофорезом, TRAP с ПЦР в реальном времени имеет несколько вариантов детекции. Например, использование зондов, специфичных к амплифицированной в ПЦР синтезированной теломеразой ДНК, флуоресцирующих лишь в составе дуплекса, в противном случае эти зонды образуют нефлуоресцирующую шпилечную структуру [34].
TRAP с электрохимической детекцией
После ПЦР в TRAP можно отделить непрореагировавшие нуклеотидтрифосфаты, а затем обработать оставшиеся продукты 3 М HCl. В рассматриваемом методе электрохимически определяют dGMP, один из продуктов полного гидролиза амплифицированной ДНК [31]. Метод позволяет полуколичественно опре-
TRAP на микрочипах
Метод TRAP на микрочипах представляет собой сочетание двухпраймерного TRAP и связывания продуктов ПЦР на чипах с последующей гибридизацией зондов и детекцией. Для определения синтезированной теломеразой ДНК и внутреннего стандарта используют разные флуоресцентные метки: Cy3
для амплифицируемой синтезированной теломера-зой ДНК и Cy5 - для стандарта. К достоинствам этого метода можно отнести высокую скорость детекции синтезированной теломеразой ДНК при поточном анализе и повышенную специфичность за счет использования соответствующих зондов [35]. Метод позволяет полуколичественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
TRAP in situ
Теломеразную активность анализируют, как правило, в клеточном экстракте. Если клеточные линии однородные, то результат отражает активность те-ломеразы в клетках. Если же изучают экстракты образцов опухолевых тканей, то иногда имеет смысл рассматривать лишь сам факт наличия или отсутствия теломеразной активности, поскольку содержание опухолевых клеток в таких образцах варьирует от 3 до 90% и более. В этом случае результаты ничего не говорят об уровне теломеразной активности в клетках разного типа, составляющих ткань, а также о различиях между опухолевыми и нормальными клетками одной ткани (например, повышение активности теломеразы в крови связано с появлением активированных лейкоцитов или перерождением каких-то клеток крови). Чтобы преодолеть этот недостаток создан in situ TRAP, в котором используют FITC-меченные прямой и обратный праймеры [36]. В этом методе образцы в виде взвеси клеток иммобилизуют на покрытые силаном стекла и сушат холодным воздухом. Затем на каждый образец наносят реакционную смесь для TRAP, инкубируют, теломеразу инактивируют нагреванием, добавляют обратный праймер с полимеразой и проводят ПЦР in situ. По окончании реакции стекла анализируют на флуоресцентном микроскопе, типы клеток определяют с помощью окрашивания. По интенсивности флуоресценции и ее локализации (ядро/цитоплазма) определяют активность теломеразы в отдельных типах клеток в смеси. В уро- и бронхиальных смывах высокая теломеразная активность проявляется яркой флуоресценцией ядер злокачественных, но не доброкачественных клеток [37, 38]. Сравнение со стандартно окрашенными препаратами указывает на связь флуоресценции в ядре со злокачественными клетками, в то время как сигнал от цитоплазмы обнаруживается в гранулоцитах и макрофагах [39]. Сходная корреляция найдена при анализе плеврального выпота [40]. Более того, in situ TRAP успешно применяли не только к образцам клеточных суспензий, но и на срезах тканей, в частности для диагностики рака печени [41]. Метод позволяет полуколичествен-
но определять активность теломеразы и ее локализацию в отдельных клетках тканей и клеточных суспензий.
Транскрипционная амплификация синтезированной теломеразой ДНК
Для увеличения количества синтезированной тело-меразой ДНК вместо ПЦР используют транскрипционную амплификацию. В комбинации с «защитой гибридизацией» этот метод позволяет измерять активность теломеразы всего за 4 ч. Праймер, служащий субстратом для теломеразы, содержит не только теломеримитирующую последовательность, но и сайт посадки Т7-РНК-полимеразы. Синтезированная теломеразой ДНК служит субстратом для гибридизации обратного праймера, содержащего дополнительную последовательность, не комплементарную теломерным повторам, за счет которой обратный праймер присоединяется к концу синтезированной теломеразой ДНК, и на следующем этапе происходит достройка двухцепочечной ДНК. Используя эту ДНК как матрицу, Т7-РНК-полимераза синтезирует РНК, по которой обратная транскриптаза синтезирует новую цепь ДНК. После этого РНК удаляется РНКазой, а по одноцепочечной ДНК с помощью прямого праймера достраивается вторая цепь ДНК (рис. 9).
С помощью этой схемы можно за 75 мин при 40° С амплифицировать синтезированную теломеразой ДНК в количествах, сопоставимых с ПЦР. Последующие реакции могут проводиться в той же пробирке, что и амплификация. Чувствительность метода позволяет выявлять теломеразную активность в образцах из 1-1000 клеток. Метод чувствителен к присутствию РНКаз [12, 42]. Основное преимущество метода перед TRAP с ПЦР-амплификацией - отсутствие прогревания образца при амплификации и игнорирование специфических ингибиторов Taq-полимеразы. Метод позволяет полуколичественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода -экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
прямая детекция синтезированной теломеразой ДНК
Детекция теломеразной активности с помощью прямого включения радиоактивно меченного субстрата
Метод основан на способности теломеразы удлинять олигонуклеотиды в присутствии dNTP. Если олигонуклеотид или один из dNTP (как правило dGTP, так как синтезируемые теломеразой теломеры обогащены остатками гуанина) содержит радиоактивную метку, то по ее включению в ДНК можно элек-
Рис. 9. Схема детекции те-ломеразной активности с заменой ПЦР-амплификации теломераз-ных продуктов на транскрипционную амплификацию [12, 42].
Промотор
Т7-РНК-
полимеразы
Теломеразный
субстрат
Синтез ДНК теломеразой Ф Отжиг обратного праймера
Обратный праймер Удлинение обратного праймера обратной транскриптазой
- ДНК ДНК
Г^ГГГГГГГГГГГГГГ"ГГГГ V ДНК
■ ДНК
V Синтез РНК-полимеразой
РНК
Отжиг и удлинение обратного праймера
----►
ДНК
Деструкция РНК РНКазой и отжиг прямого праймера
----------------------------------«-------- ДНК
^ Удлинение прямого праймера обратной транскриптазой
„ --------днк
Синтез РНК-полимеразой
ДНК
Отжиг обратного праймера РНК
!}
трофоретически оценивать активность теломеразы [43]. Основные недостатки метода - использование больших количеств радиоактивных изотопов и недостаточная во многих случаях чувствительность, обусловленная низким содержанием теломеразы в клетках и тканях.
Метод с использованием радиоактивного мечения без дополнительного усиления сигнала был первым методом определения теломеразной активности. До сих пор он остается основным при изучении тело-меразы организмов со слаборегулярными теломера-ми (например, Saccharomyces сerevisiae). Этот метод применяется и сейчас для детального исследования синтезированной теломеразой ДНК и количественных измерений. Метод позволяет количественно определять активность и процессивность теломера-зы в экстрактах клеточных линий, но обладает низкой чувствительностью (10000 клеток теломераза-положительной клеточной линии).
Определение синтезированной теломеразой ДНК по изменению поверхностного плазмонного резонанса
Поверхностный плазмонный резонанс (ППР) возникает на поверхности металла при условии полного внутреннего отражения и характеризуется специфическим углом отражения, а следовательно, показателем преломления. Этот эффект, возникая на поверхности металлической пленки, распространяется в глубь раствора, затухая экспоненциально как функция расстояния. Взаимодействия между молекулами изменяют затухающую волну, что влияет на характеристики поверхностного плазмона и что выражается в изменении резонансного угла и показателя преломления в поверхностном слое. По изменению показателя преломления судят о взаимодействии биомолекул (рис. 10А).
С помощью биосенсора методом ППР можно прямо измерять теломеразную активность как соответ-
Л
I
II
уС>
Поляризованный Отраженный
свет свет
Призма
Сенсорный чип
с золотой пленкой
интенсивность
W.
угол
резонансный сигнал
время
Сенсограмма
Рис. 10. Схема применения поверхностного плазмонного резонанса для детекции макромолекул и соответствующая общей схеме сенсограмма (А) и сенсо-грамма ППР-метода определения тело-меразной активности (Б). РЕ - резонансные единицы.Разница между сигналами 1 и 2 отражает синтез ДНК теломеразой [44].
II
Б
Время
ствующее удлинение теломеримитирующего олигонуклеотида.
5'-Биотинилированные олигонуклеотиды, содержащие теломерные повторы, иммобилизуют на предобработанной стрептавидином поверхности декстранового сенсора in situ на аппарате BIACORE. После этого их обрабатывают клеточным экстрактом. Если экстракт содержит теломеразу, то происходит связывание теломеразы и удлинение олигонуклеотида, определяемое по ППР после отмывки от белков раствором додецилсульфата натрия (рис. 10Б). Степень удлинения олигонуклеотида зависит от концентрации препарата и времени реакции. Результаты анализа экстрактов опухолей и клеточных линий этим методом, а также тестирования ингибиторов теломеразы коррелируют с данными, полученными методом TRAP [44]. Интенсивность сигнала можно увеличить, обрабатывая сенсор с синтезированной теломеразой ДНК антисмысло-
выми олигонуклеотидами к теломерам, ковалентно связанными со стрептавидином и наночастицами золота [45].
Метод позволяет количественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий, а также получать информацию о кинетике реакции, показывая связывание и диссоциацию тело-меразы от субстрата. Предел чувствительности метода - экстракт 50 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
Определение теломеразной активности с помощью модифицированных олигонуклеотидами магнитных частиц и ЯМР
Метод основан на использовании магнитных частиц оксида железа, модифицированных олигонуклеотидами, комплементарными теломерным повторам. Эти частицы, связываясь за счет комплементарных взаимодействий с синтезированными теломеразой
Рис. 11. Магнитный наносенсор теломеразы.
А - Схема образования MRS-комплекса. Б - Сравнение изменений Т2 в присутствии праймера и теломер-подобного 54-нуклеотидно-го олигонуклеотида [46].
Л
Праймер
Теломераза
I Работа теломеразы
+dNTP
Л
AUCCCAAUC '
Сборка MRS-комплекса
мин
Б
повторами, образуют протяженные линейные структуры (МБ^-комплексы) (рис. 11А). Эффект от этой гибридизации определяют по спин-спиновому времени релаксации. При образовании организованного ансамбля наночастиц время магнитной релаксации окружающих молекул воды заметно изменяется, что можно измерять в релаксометре (релаксометр измеряет времена спин-спиновой релаксации ядерной намагниченности протонсодержащих жидкостей в многокомпонентных системах и содержание компонентов с различными временами релаксации). Магнитное переключение происходит быстро, достигая половины максимального изменения через 30 с и выходя на плато через 40-60 мин (рис. 11Б). Магнитное переключение подтверждено методом магнитно-силовой микроскопии, а также корреляцией магнитного переключения и размера формируемых наноансамблей. Локальное искажение магнитного поля возрастает на наночастицах в упорядоченных ансамблях, а неорганизованные наночастицы дают гораздо меньший магнитный эффект [46].
Время релаксации измеряли в объеме 200-500 мкл при магнитной индукции 0.47 Тл в ЯМР-спектрометре. Для магнитно-резонансного сканирования 384-лу-ночных плашек с 50 мкл смеси при 1.5 Тл оценивали время не только спин-спиновой (Т2), но и спин-решеточной релаксации (Т1). Адаптация к поточной обработке с использованием магнитно-резонансного сканирования позволила с высокой чувствительностью анализировать сотни образцов за десятки минут [46]. Метод позволяет количественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий с использованием высокопроизводительного микропланшетного формата. Для таких анализов помимо распространенного оборудования и реактивов нужны планшетный ЯМР-спектрометр и проба из наночастиц, модифицированных олигонуклеотидами.
Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
Определение активности теломеразы с помощью метода микробаланса кварцевого кристалла
Для микрогравиметрического анализа теломераз-ной активности методом микробаланса кварцевого кристалла может использоваться Аи-кварцевый резонатор. Кристаллы кварца обладают пьезоэлектрическим эффектом. Приложение переменного тока приводит к возникновению в кристалле кварца колебаний, причем в специально вырезанных кристаллах ток определенной частоты может приводить к образованию стоячей волны, резонансную частоту которой можно определить весьма точно и которая изменяется при связывании лигандов на поверхности кристалла. Метод микробаланса кварцевого кристалла в жидкостях используется при определении аффинного связывания молекул (в частности, белков) на поверхностях, содержащих соответствующие участки узнавания.
В этом методе теломеримитирующий олигонуклеотид связывают с поверхностью сенсора, удлиняют его теломеразой и проводят гибридизацию синтезированной цепи ДНК с биотинилированным олигонуклеотидом (рис. 12А). Альтернативный вариант - удлинение связанного с сенсором теломеримитирующего олигонуклеотида в присутствии биотин-меченного ПТР (рис. 12Б). Затем поверхность сенсора обрабатывают конъюгатом авидина с щелочной фосфатазой и раствором субстрата щелочной фосфатазы - 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата, который гидролизуется с образованием нерастворимого продукта на поверхности сенсора. При определении теломеразной активности по уменьшению частоты резонанса кристалла видны шаги удлинения олигонуклеотида, связывания с синтезированной теломеразой ДНК конъюгата ави-
А
jjx/w
dNTP +
|\/\/\УиЛ/\У\/\/ + \/\т\№
Конъюгат авидина с щелочной фосфатазой
|wv
dNTP + biot-dUTP +
%
дина с щелочной фосфатазой и осаждение на поверхности кристалла продуктов реакции, катализируемой щелочной фосфатазой [47]. Метод позволяет с высокой скоростью количественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий. Предел чувствительности метода - экстракт 3300 клеток теломераза-положительной клеточной линии. Для метода нужен частотный анализатор и Аи-кварцевый кристалл. Кроме того, затруднена идентификация артефактных сигналов.
Электрохимическая детекция теломеразной активности с ферроценилнафталиндиимидом
Этот метод основан на способности теломерных повторов образовывать G-квадруплексы. Теломераза
Рис. 12. Схема процессов на сенсоре в методах микробаланса кварцевого кристалла и электрохимического определения. Ь - биотин в составе олигонуклеотида, а-АР - конъюгат авидина с щелочной фосфатазой, dNTP - смесь нуклеозидтрифосфатов, Ыо1^иТР - меченный биотином dUTP. А -Встраивание биотин-меченного нуклеотида в синтезированную теломеразой ДНК. Б -Гибридизация биотин-меченного олигонуклеотида с синтезированной теломеразой ДНК [47].
удлиняет олигонуклеотид, закрепленный на электроде. Затем синтезированные теломерные повторы в присутствии высоких концентраций ионов калия образуют квадруплексы, а ферроценилнафталин-диимид в таких условиях может стехиометрически связываться с квадруплексами ДНК и стабилизировать их структуру (рис. 13). В свою очередь, связанный ферроценилнафталиндиимид можно определить электрохимическими методами. В этом методе оценивается число свернутых в квадруплекс фрагментов ДНК, которое зависит не только от общего числа повторов, но и непрогнозируемо от длины и расположения отдельных фрагментов ДНК, что можно считать недостатком. Чувствительность метода достаточна для определения синтезированной теломеразой ДНК
Б
fSS
AUCCC
к\/\/\/\/\/\/\/\/
Ферроценилнафталиндиимид
Fe
Fe
Рис. 13. Схема образования электрохимически определяемого комплекса при определении теломераз-ной активности с ферроценилнафталиндиимидом [48].
Рис. 14. Электрохимический метод для высокочувствительного определения теломеразной активности, основанный на усилении сигнала с помощью биобар-кода [49]. НЧ -наночастицы.
Праймер
WW +
-4
| AUCCCAAUC -
Продукт удлинения теломеразой
Электрод, покрытый комплементарным Г праймеру олигонуклеотидом
К/\/\А/
Наночастица, покрытая двум типами олигонуклеотидов + . _ Л _
Электрохимиче-НЧ +[Ru(NH3)6]3+ ское определение
количества ДНК
без амплификации [48] (100-1000 клеток теломераза-положительной клеточной линии), но метод не апробирован на экстрактах опухолевых тканей.
Использование биобаркода для определения тело-меразной активности
Наиболее чувствительный на сегодняшний день метод прямого измерения теломеразной активности без амплификации синтезированной теломеразой ДНК основан на системе биобаркода. В оригинальной системе биобаркода магнитные микрочастицы связываются с мишенью, которая затем за счет взаимодействий антиген-антитело связывается с наночастицами, ковалентно модифицированными олигонуклеотидом, играющим роль биологического баркода. Получившийся «бутерброд» отделяют от реакционной смеси в магнитном поле, денатурируют и по высвободившимся фрагментам ДНК определяют результат. В системе определения теломераз-ной активности синтезированную теломеразой ДНК узнают с использованием комплементарных фрагментов ДНК. ДНК-наночастицы состоят из наночастиц золота и олигонуклеотидов двух типов. Один образует дуплекс с синтезированной теломеразой ДНК, а второй - нет, что уменьшает вероятность связывания с одной и той же наночастицей второй ДНК-мишени (рис. 14). Для детекции используется электроактивный комплекс [Ки(ПН3)6]3+, способный связываться с отрицательно заряженными цепями ДНК за счет электростатических взаимодействий
[49]. Метод позволяет количественно определять активность теломеразы в экстрактах клеточных линий, но не апробирован на экстрактах опухолевых тканей. Предел чувствительности метода - экстракт 10 клеток теломераза-положительной клеточной линии.
Определение активности теломеразы с использованием оптических биосенсоров
Принцип этого метода имеет определенное сходство с ППР: он основан на том, что при связывании мишени коэффициент преломления на поверхности сенсора изменяется пропорционально количеству связавшейся мишени. Избежать стерических затруднений помогает кассета из трех олигонуклеотидов, которые связываются с поверхностью сенсора. Фосфатные группы ковалентно взаимодействуют с поверхностью через 5’-конец олигонуклеотида. Затем с иммобилизованной ДНК комплементарно связывается олигонуклеотид, содержащий на З’-конце короткий некомплементарный участок. Выступающий З’-конец ДНК модифицирован фосфотиоатом, что в 10 раз увеличивает аффинность связывания теломеразы с праймером [50]. После обработки экстрактом, содержащим теломеразу, в присутствии dNТP фермент удаляли с поверхности сенсора протеиназой К (рис. 15А).
Активность теломеразы оценивали по сенсограмме поверхностной загрузки (нг/мм2, определяемой по изменению коэффициента преломления) (рис. 15Б). Метод позволяет количественно определять активность теломеразы в экстрактах клеточных линий,
А
\У\/\/\/
Сборка кассеты олигонуклеотидов
\/\/\/\Л^Л/\/\/
Линкер
\/\/\/\/\/
Теломерный субстрат
ъоыыъсг^глуоососпил;
і
і
х
f Q.6
I-
и
0
1
X
а
ф
со
О Q.3
с
пз
*
а
і_
m
&
Добавление клеточного экстракта с теломеразой
Промывка
буфером
Добавление ^ dNTP и начало
реакции
Обработка протеиназой К
Собранная кассета
Добавление
клеточного
экстракта
I
V
72QQ
1Q8QQ
144QQ
18QQQ Время, с
Продукт удлинения теломеразой
Обработка протеиназой К, диссоциация теломеразы
Определение количества ДНК на поверхности сенсора по загрузке поверхности
Рис. 15. А -Схема образования синтезированной теломеразой ДНК на поверхности сенсора.
Б - Сенсограм-ма определения теломеразной активности на оптическом сенсоре [50].
Б
но не пригоден для экстрактов опухолевых тканей, так как предел его чувствительности - экстракт 105 клеток теломераза-положительной клеточной линии. Кроме того, в этом методе используются фос-фотиоатмодифицированные олигонуклеотиды и специальный оптосенсор.
Система определения активности теломеразы, основанная на квантовых точках
Квантовая точка - фрагмент проводника или полупроводника, ограниченный по всем трем пространственным измерениям и содержащий электроны проводимости. Точка должна быть настолько малой, чтобы квантовые эффекты были существенными. Это достигается, если кинетическая энергия электрона E = h2/md ^ - характерный размер точки, m - эффективная масса электрона на точке), обусловленная неопределенностью его импульса, будет заметно больше всех других энергетических масштабов, в первую очередь, больше температуры, выраженной в энергетических единицах. Квантовой точкой может служить любой достаточно маленький кусочек металла или полупроводника. Электрон в таком микрокристалле чувствует себя, как в трехмерной потенциальной яме, он имеет много стационарных уровней энергии с характерным расстоянием между
ними (точное выражение для уровней энергии зависит от формы точки). Как и при переходе между уровнями энергии атома, при переходе между энергетическими уровнями квантовой точки может излучаться фотон. При этом, в отличие от атомов, частотами переходов легко управлять, меняя размеры кристалла.
К наночастице (квантовой точке) присоединяют модифицированный на конце тио-группой теломе-римитирующий олигонуклеотид. Такая квантовая точка способна флуоресцировать, поглощая квант с длиной волны Х,1 (400 нм) и излучая квант с длиной волны Х.1’ (560 нм). Если при удлинении теломера-зой присоединенного к квантовой точке олигонуклеотида в ДНК встраивается флуоресцирующий модифицированный нуклеотид ТИ^иТР ^иТР, меченный техасским красным), то происходит перенос энергии флуоресценции (рис. 16А), что сопровождается уменьшением излучения с длиной волны Х.1’ и появлением излучения с длиной волны Х2 (610 нм) (рис. 16Б). Метод позволяет количественно оценивать активность теломеразы. Чувствительность метода равна примерно 10000 клеток линии Не1а [51], что недостаточно для анализа клинических материалов.
Вместо включения ТИ^иТР можно использовать способность теломерных повторов сворачиваться
А
Jr
7
b *4
f AUCCCAAUC -
vy'vy’ +dNTP,
+TR-dUTP
\2
5
= TR
Время, мин
Рис. 16. Удлинение теломеразой олигонуклеотида, связанного с CdSe-ZnS квантовой точкой с включением TR-dUTP (А), и замена излучаемой длины волны квантовой точки (^1) на длину волны техасского красного (Х2) при удлинении теломеразой олигонуклеотида, связанного с CdSe-ZnS квантовой точкой с включением TR-dUTP [51] (Б). TR - техасский красный.
в G-квадруплексы и связывать гемин. В этом случае перенос энергии происходит между квантовой точкой и комплексом G-квадруплекса с гемином с соответствующим тушением флуоресценции. Чувствительность метода - 270 клеток линии Т293 [52].
Определение активности теломеразы с помощью сенсорного чипа на нанопроводе
Сенсорный чип представляет собой транзистор, включающий покрытые антителами кремниевые нанопровода, содержащие на поверхности альдегидные группы, к которым могут пришиваться моноклональные антитела. Проводимость покрытого антителами нанопровода изменяется при связывании антигенов, что и детектируется.
В случае сенсорного чипа для определения тело-меразной активности нанопровод транзистора модифицируется не антителами, а теломеримитирующи-ми олигонуклеотидами. При добавлении теломеразы и dNTP происходит удлинение связанных на поверхности олигонуклеотидов, что приводит к изменению проводимости транзистора, на котором связаны олигонуклеотиды [53]. Чувствительность метода - экстракт 100 клеток линии HeLa.
Сходный метод основан на использовании ион-селективного полевого транзистора. В присутствии определенных химических веществ на затворе таких транзисторов появляется потенциал, открывающий его канал проводимости, т.е. через него начинает течь ток, величина которого пропорциональна концентрации искомого компонента. ALOg-затвор транзистора модифицируется субстратом теломеразы. При удлинении праймера теломеразой меняется потенциал на затворе. Метод позволяет определять активность теломеразы в экстрактах клеточных линий (на клинических материалах метод не тестировался). Его чувствительность составляет 65 клеток линии Т293
[54]. Основное преимущество метода - возможность проводить большое количество различных анализов одного образца на одном чипе, который может представлять собой набор сенсоров на разные маркеры. Кроме того, видны этапы связывания и диссоциации теломеразы.
Биолюминесцентный метод определения активности теломеразы
Определение теломеразной активности биолюминес-центным методом основано на том, что катализируемое теломеразой удлинение теломеримитирующего олигонуклеотида сопровождается отщеплением пирофосфата, количество которого определяют люми-нометрическим методом. В присутствии аденозин-5,-фосфосульфата ATP-сульфурилаза превращает пирофосфат в ATP, содержание которого определяют люциферин-люциферазным методом. Чувствительность и специфичность метода сопоставима, согласно
[55], с чувствительностью метода TRAP-ИФА. Метод позволяет количественно определять активность те-ломеразы в экстрактах клеточных линий и тканей (апробирован на опухолях легкого). Его преимуществом является линейная зависимость сигнала от количества синтезированной теломеразой ДНК в сочетании с высокой производительностью.
Электрохемилюминесцентный метод определения теломеразной активности
Определять теломеразную активность можно и с помощью электрохемилюминесценции (люминесценции при электролизе). В этом методе 5’-биотинилирован-ный праймер удлиняют теломеразой, а затем инкубируют со взвесью магнитных шариков, модифицированных авидином. С иммобилизованной на магнитных шариках ДНК гибридизуют электрохемилюминес-центную пробу (ковалентно связанный с наночастицей золота олигонуклеотид, модифицированный рутений-бис(2,2’-бипиридин)(2,2’-бипиридин-4,4’-дикарбонат)-N-гидроксисукцинимидэфиром. Эти тройные комплексы (магнитный шарик - теломерная
Б
Теломерный субстрат
-•4
AUCCCAAUC -
* W
Теломераза
Наночастица с ДНК-зондом и флуоресцентно меченными олигонуклеотидами
Модифицированные авидином магнитные шарики
е
о
н
О
д
ф
н
ф
т:
н
О
~и
Рис. 17. Схема электрохеми-люминесцентного метода определения теломеразной активности [54].
проба - электрохемилюминесцентная проба) промывают и впрыскивают в реакционную кювету, где они примагничиваются к рабочему электроду и при подаче напряжения начинают люминесцировать (рис. 17). Метод позволяет количественно определять активность теломеразы в пробах, содержащих не менее 500 клеток HeLa [56], он обеспечивает достаточно высокое соотношение сигнал/шум благодаря стадии экстракции модифицированными магнитными шариками, но не апробирован на клинических материалах.
Детекция теломеразной активности с помощью FRET и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения
Метод на основе FRET предназначен для того, чтобы различить синтез одной буквы (непроцессивный метод синтеза) и начало синтеза второго повтора ДНК (условно процессивный метод синтеза) индивидуальными комплексами теломеразы Tetrahymena thermophila. FRET определяли с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения, основанной на явлении отражения электромагнитных волн от границы раздела двух прозрачных сред, которое возникает при условии, что волна падает из среды с более высоким показателем преломления под углом, превышающим угол полного отражения. Интенсивность излучения, проникаю-
щего во вторую среду, уменьшается по экспоненциальному закону, что позволяет выявлять флуоресцентные объекты, возбуждаемые этим излучением, в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм.
Биотинилированные праймеры (TG)8T2G4T2 связывали на покрытых стрептавидином кварцевых слайдах и обрабатывали содержащим теломеразу экстрактом в присутствии dGTP и ddTTP, обрывающего синтез на втором повторе. В результате образуются детектируемые продукты двух типов. Слайды с продуктами реакции обрабатывали Су3-меченным олигонуклеотидом (Cy3-(CA)8), чтобы окрасить Су3 каждый связанный на слайде праймер за счет комплементарного взаимодействия с нетеломерным участком олигонуклеотида (TG)8. Затем систему обрабатывали комплементарным теломерной последовательности Су5-меченным детектирующим олигонуклеотидом (Cy5-C2A2C3), который более эффективно связывается с более длинным продуктом теломеразы. Фиксируют сигнал FRET между Су3 и Су5 [57] (рис. 18). Метод позволяет идентифицировать индивидуальные сигналы от удлинения праймера теломеразой.
Для проверки и нормирования системы использовали меченные Alexa Fluor-488 праймеры трех типов: соответствующие позициям без синтеза, синтезу одной буквы, синтезу второго повтора ((TG)8T2G4T2,
|=o=o*
TGGGGTT
TGGGGTT CCCAACC^
TGGGGTT
Нет сигнала FRET
Слабый сигнал FRET
TGGGGTTG CCCAACC^
TGGGGTT
GGGGTTGGw CCCAACCj
Сильный сигнал FRET
Рис. 18. Детекция теломеразной активности с помощью FRET и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения [57].
(TG)8T2G4T2G, (TG)8T2G4T2G4T) с 5’-концевым биотином, которые связывались с покрытыми стрептави-дином кварцевыми слайдами. Наличие флуорофо-ра Alexa Fluor-488 позволяет определить плотность и локализацию связанных на слайде праймеров [57].
Определение теломеразной активности с помощью FRET и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения дает возможность детектировать удлинение теломеразой индивидуальных праймеров и может сочетаться с основанными на FRET методами изучения структуры теломеразы. Этим методом можно определить только первые полтора повтора, синтезированные теломеразой, т.е. он не отражает полной активности теломеразы. Метод апробирован только на теломеразе T. thermophila и предназначен пока только для решения исследовательских задач.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
усиления сигнала
Определение активности теломеразы с использованием меченных дигоксигенином комплементарных теломерам олигонуклеотидов
Определение синтезированной теломеразой ДНК с помощью ИФА привлекательно тем, что это неизо-
топный метод. Метод основан на том, что синтезированную теломеразой ДНК гибридизуют с меченным дигоксигенином олигонуклеотидом и определяют получившийся комплекс с помощью ИФА, используя конъюгат щелочной фосфатазы с антителом к ди-гоксигенину (рис. 8). Предел чувствительности метода - 10 аттомоль продукта, что типично для систем с дигоксигенином. При использовании экстрактов клеток линии Т293 предел чувствительности составлял 37500 клеток [58], что недостаточно для анализа клинических материалов. Метод определения синтезированной теломеразой ДНК с помощью ИФА далеко не самый чувствительный, но он полностью автоматизирован и оптимизирован для поиска ингибиторов теломеразы.
Электрохимическое определение активности теломеразы с использованием конъюгатов авидина с щелочной фосфатазой
Метод основан на иммуноферментной амплификации сигнала с электрохимической детекцией. Тиолиро-ванный олигонуклеотид-субстрат, ковалентно присоединенный к золотому электроду, удлиняется те-ломеразой в присутствии ПТР. Далее проводят ИФА, как и в методе с применением микробаланса кварцевого кристалла, с образованием нерастворимого продукта на поверхности электрода, что и определяют электрохимически (рис. 12). Для детекции используют хронопотенциометрию - метод, основанный на измерении изменения электродного потенциала Е во времени при контролируемом (постоянном) значении тока электролиза. Чем больше осадка на поверхности электрода, тем сильнее изменение потенциала. Метод позволяет с высокой скоростью количественно определять активность теломеразы в экстрактах тканей и клеточных линий [47]. Чувствительность метода достаточна для определения теломеразной активности в экстракте, соответствующем 1000 клеток линии HeLa.
Определение активности теломеразы с использованием флуориметрического оптосенсора
Этот оптический сенсор основан на флуориметрии (фактически - флуориметр с использованием оптоволокна в системах возбуждения и детекции). Олигонуклеотид, субстрат теломеразы, модифицируется на З’-конце фосфотиоатом для увеличения аффинности теломер-(олигонуклеотид)связывающего участка hТERТ и соответственно скорости теломе-разной реакции. Этот праймер ковалентно связывается на поверхности оптического биосенсора, и его удлинение теломеразой отслеживается в реальном времени по включению dUТP, меченного изотиоциа-натным производным флуоресцеина ^!ТС), или уд-
AACCCCAAC
68 | ACTA NATURAE | TOM 3 № 1 (8) 2011
Таблица 2. Краткое сравнение методов определения теломеразной активности
Метод определения теломеразной активности Чувс- твитель- ность* Преимущества Недостатки** Ссыл- ка
С помощью прямого включения радиоактивно меченного субстрата 105-106 Отсутствие связанных с ПЦР артефактов. Синтезированная теломеразой ДНК видна непосредственно в геле, можно оценивать ее размер и количество. Низкая чувствительность, необходимость работы с большими количествами радиоактивной метки, длительное время экспозиции. [43]
Определение синтезированной теломеразой ДНК по изменению поверхностного плазмонного резонанса 20-100 Отсутствие связанных с ПЦР артефактов, без радиоактивной метки, без ПААГ. Информация о кинетике реакции. Возможность детекции сигнала на фоне ЮООх избытка теломераза-негативных клеток. Видны связывание и диссоциация теломеразы. Необходимость в системе BIACORE и биотинилиро-ванных праймерах. [44, 54]
С помощью модифицированных олигонуклеотидами магнитных частиц и ЯМР 10 Отсутствие связанных с ПЦР артефактов, без радиоактивной метки, без ПААГ, очень высокопроизводительный микроплан-шетный формат. Нужен ЯМР-спектр о метр и проба из наночастиц, ковалентно связанных с олигонуклеотидами. [46]
С помощью метода микробаланса кварцевого кристалла 3300 Отсутствие связанных с ПЦР артефактов. Высокая чувствительность. Быстрая процедура. Нужен частотный анализатор и Аи-кварцевый кристалл, сложность идентификации артефактных сигналов в случае появления. [47]
Электрохимически с использованием ферроценилнафталин-диимида юо-юоо Отсутствие связанных с ПЦР артефактов. Высокая чувствительность. Быстрая процедура. Оценивается число свернутых в квадруплекс структур, зависящее не только от общего числа повторов, но и непрогнозируемо от длины и расположения отдельных фрагментов ДНК. [48]
С использованием биобаркода 10 Один из наиболее чувствительных на сегодняшний день методов непосредственного измерения теломеразной активности без амплификации синтезированной теломеразой ДНК. Нужен модифицированный электрод и наночастицы, покрытые олигонуклеотидами двух типов. [49]
С использованием оптических биосенсоров ю5 Без радиоактивности, без ПААГ, без ПЦР. Нужны фосфотиоатмодифицированные олигонуклеотиды и специальный оптосенсор. Недостаточная для клинических материалов чувствительность. [50]
Основанный на квантовых точках 10000/270 Без радиоактивности, без ПААГ, без ПЦР. Нужны олигонуклеотиды, ковалентно связанные с квантовыми точками. Недостаточная для клинических материалов чувствительность. [51]
С помощью сенсорного чипа на нанопроводе 100 Возможность проводить большое количество разных анализов образца на одном чипе. Видны связывание и диссоциация теломеразы. Нужен нанотранзисторный чип и оборудование для его анализа. [53]
Биолюминесцентный 5 Линейная зависимость сигнала от количества синтезированной теломеразой ДНК. Без радиоактивности, без ПААГ, без ПЦР, высокопроизводительный формат. Нужны люциферазная система детекции биолюминесценции и люминометр. [55]
Электрохемилюминесцентный 500 Высокое соотношение сигнал/шум благодаря очистке экстракцией модифицированными магнитными шариками. Высокая чувствительность. Сложность синтеза пробы, требования к оборудованию. [56]
С помощью FRET и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения 1 Высочайшая чувствителность — возможность детектировать удлинение теломеразой индивидуальных праймеров. Возможность сочетания метода с основанными на FRET методами исследования структуры теломеразы. Метод определяет только первые полтора повтора, синтезированные теломеразой. Апробация сделана только для теломеразы Те^аНутепа ЬНегторНИа. [57]
С использованием дигоксигенин-меченных комплементарных теломерам олигонуклеотидов (ИФА) 37500 Количественность, метод автоматизирован. Недостаточная для клинических материалов чувствительность. [58]
Электрохимически с использованием конъюгатов авидин-щелочная фосфатаза 3300 Отсутствие связанных с ПЦР артефактов. Высокая чувствительность. Быстрая процедура. Нужен специально подготовленный электрод, сложность идентификации артефактных сигналов в случае появления. [47]
С использованием флуориметри-ческого оптосенсора ю6-ю7 Без радиоактивности, без ПААГ, без ПЦР. Нужны фосфотиоатмодифицированные олигонуклеотиды и оптоволоконная система детекции флуоресценции. Недостаточная для клинических материалов чувствительность. [59]
ОБЗОРЫ
ТОМ З № 1 (8) 2011 I ACTA NATURAE | 69
С использованием ДНКзим-меченных олигонуклеотидов 1000 Без радиоактивности, без ПААГ, без ПЦР. Простая процедура и короткое время анализа. Не очень высокая специфичность метода, есть фоновый сигнал. [61]
По пересворачивающемуся в ДНКзим теломеразному субстрату 10000 Без радиоактивности, без ПААГ, без ПЦР. Очень простая процедура и короткое время анализа. Не очень высокие чувствительность и специфичность метода, есть фоновый сигнал. [60]
TRAP 10 Видны амплификаты синтезированной теломеразой ДНК. ПААГ позволяет определять часть артефактов ПЦР. Высокая специфичность метода. Работа с радиоактивной меткой, необходимость ПААГ. Возможность артефактов ПЦР. [П]
TRAP с одной клетки 1 Высокая чувствительность. ПААГ позволяет определять часть артефактов ПЦР и качественно судить о процессивности. Работа с радиоактивной меткой, работа с отдельными клетками, необходимость ПААГ. Возможность артефактов ПЦР. [13]
TRAP с флуоресцентными праймерами 100 Без радиоактивной метки, ПААГ позволяет определять часть артефактов ПЦР и качественно судить о процессивности. Необходимость в флуоресцентно меченных праймерах, необходимость ПААГ. Возможность артефактов ПЦР. [20]
TRAP с флуоресцентным окрашиванием ДНК в геле 10 Без радиоактивной метки. ПААГ позволяет определять часть артефактов ПЦР и качественно судить о процессивности. Необходимость ПААГ. Возможность артефактов ПЦР. Большинство интеркалирующих флуоресцентных красителей мутагенны. [16, 18]
TRAP с окрашиванием ДНК в геле нитритом серебра 10 Без радиоактивной метки. ПААГ позволяет определять часть артефактов ПЦР и качественно судить о процессивности. Необходимость ПААГ. Возможность артефактов ПЦР. Увеличенная трудоемкость. [17]
TRAP с анализом методом сцин-тилляционного сближения 10 Без радиоактивности, без ПААГ, высокопроизводительный ми кр о планшетный формат. Легкая оценка количества. Необходимость в [3Н]ТТР и биотинилированных праймерах. Работа с тритием. Возможность артефактов ПЦР. [27]
TRAP с детекцией методом «защиты гибридизации» 10 Без радиоактивности, без ПААГ, высокопроизводительный ми кр о планшетный формат. Легкая оценка количества. Требуются акридин-меченные пробы. Возможность артефактов ПЦР. [28]
TRAP с праймерами-амплифлуорами 10-50 Без радиоактивности, без ПААГ, высокопроизводительный формат. Количественная оценка. Различное мечение амплификатов синтезированной теломеразой ДНК и ПЦР-контроля. Возможность артефактов ПЦР. Требуются амплифлуоры. [22]
TRAP в сочетании с иммунофер-ментным анализом 10 Без радиоактивности, без ПААГ, высокопроизводительный микропланшетный формат. Возможность артефактов ПЦР и ИФА. [29]
TRAP с праймерами с резонансным переносом энергии (FRET) 10 Без радиоактивности, без ПААГ, высокопроизводительный микропланшетный формат. Неодинаковый учет при количественной оценке первых и последующих повторов, достроенных теломеразой. Возможность артефактов ПЦР. Требуются специальные флуорофоры. [26]
TRAP на микрочипах 10 Без радиоактивности, без ПААГ, малые реакционные объемы, высокопроизводительный микропланшетный формат. Легкая оценка количества. Нужны чипы и прибор для их чтения. [35]
TRAP с ПЦР в реальном времени 50 Без радиоактивности, без ПААГ, высокопроизводительный микропланшетный формат. Легкая оценка количества. Возможно различное мечение амплифлуорами амплификатов синтезированной теломеразой ДНК и ПЦР-контроля. Нужен амплификатор для ПЦР в реальном времени. Возможность артефактов ПЦР. Сложность определения артефактов ПЦР. [32,33]
In situ TRAP 1 Метод дает информацию о активности теломеразы в отдельных клетках и некоторую информацию о внутриклеточной локализации активности. Сложная процедура, низкопроизводительная, нужен флуоресцентный микроскоп. Метод оптимизирован только для анализа клинических препаратов и клеточных линий. [36]
TRAP с транскрипционной амплификацией 10 Изотермическая амплификация, отсутствие артефактов ПЦР, детекция без ПААГ, высокопроизводительный формат. Требуются акридин-меченные пробы. Возможность артефактов транскрипционной амплификации. Повышенные требования к чистоте (отсутствию РНК-аз) из-за транскрипционной амплификации. [42]
‘Минимальное число клеток теломераза-положительных клеточных линий, в котором возможно определение активности.
**Все методы без ПААГ (кроме определения теломеразной активности с помощью FRET и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения) оценивают активность, но не процессивность теломеразы.
ОБЗОРЫ
Рис. 19. Схема получения флуоресцентно меченной синтезированной те-ломеразой ДНК для детекции флуориметриче-ским оптосенсором [59].
Праймер
+FITC-dUTP
+ uj______________
I AUCCCAAUC
X
:ITQ
Детекция
ITC
:ITC
линенную цепь определяют с помощью гибридизации FITC-меченной комплементарной ДНК-пробы ((CCAATC)4-FITC) (рис. 19). Этот метод не требует ПЦР-амплификации и дополнительных шагов очистки [59]. Кроме того, сравнили эффективность работы теломеразы в присутствии обычных dNTP и в присутствии FITC-меченного dUTP. Для этого синтезированную теломеразой ДНК в присутствии FITC-меченного dUTP метили FITC-меченной комплементарной ДНК-пробой. Оказалось, что теломе-раза хуже работает в присутствии FITC-меченного dUTP [59]. Метод позволяет количественно определять активность теломеразы, но его чувствительность не превышает 106 -107 клеток, что недостаточно для анализа клинических материалов. Кроме того, в этом методе используется несерийная система детекции флуоресценции.
Определение активности теломеразы с использованием ДНКзимов
ДНКзимы - фрагменты ДНК, обладающие ферментативной активностью.
Существует несколько вариантов использования ДНКзимов при анализе теломеразы. Во-первых, субстрат теломеразы может иметь на 5’-конце шпильку, которая при удлинении субстрата пересворачива-ется, образуя каталитическую структуру (рис. 20А). При этом одна цепь исходной шпильки образует дуплекс с de novo синтезированными теломерными повторами, а вторая, в присутствии молекулы ге-мина, формирует квадруплекс с включенной в него молекулой гемина, обладающий пероксидазной активностью. Этот комплекс катализирует окисление 2,2’-азино-бис(3-этилбензотиазолин)-6-сульфоновой кислоты (ABTS) в присутствии H2O2, что приводит к накоплению цветного продукта (рис. 20). Чувствительность этого метода составляет примерно 10000 клеток линии HeLa при продолжительности анализа около 8 мин [60]. Следует отметить медленное изменение цвета экстракта контрольных клеток после
термической обработки, что, по мнению авторов, связано с неспецифической сорбцией гемина на компонентах реакционной смеси. Этот метод отражает число удлиненных молекул субстрата, но не учитывает длину создаваемой теломеразой цепи.
Аналогично можно использовать ДНКзим, ковалентно связанный с антисмысловым олигонуклеотидом к синтезированной теломеразой ДНК [61] (рис. 20Б). Фактически это ИФА, где к зонду уже ковалентно присоединен фермент. Чувствительность этой модификации составляет около 1000 клеток линии HeLa при меньшем фоне. К недостаткам этих методов можно отнести невысокую чувствительность и специфичность, а также наличие фонового сигнала.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время существует ряд методов определения теломеразной активности в самых разных образцах: экстрактах клеток, тканей, смешанных популяций клеток. Все методы можно разбить на две группы - методы с непосредственной детекцией синтезированной теломеразой ДНК и методы с различными схемами усиления, каждый из которых обладает своими преимуществами и недостатками. Сравнение всех этих методов приведено в табл. 2.
Если рассмотреть все методы, то можно выделить ряд новых систем, сопоставимых по чувствительности с наиболее распространенным на сегодня методом TRAP. Они избавлены от артефактов, связанных с амплификацией, и обладают высокой скоростью анализа при высокой чувствительности. При этом они имеют ряд недостатков, в том числе и высокие требования к специфическим расходным материалам и оборудованию, так что выбор методики в каждом конкретном случае может определяться доступностью оборудования и реактивов. В ряде методов сложно отделить специфические сигналы от неспецифических. В большинстве методов оценивается только активность, но не процессивность теломеразы. Зачастую они не дают информации о распределении
Рис. 20. Схема двух вариантов определения активности те-ломеразы с использованием ДНКзимов [60, 61] (А, Б).
синтезированной теломеразой ДНК по длине. Некоторые методы узкоспециализированные. Например, метод с определением синтезированной теломеразой ДНК с использованием дигоксигенин-меченных комплементарных теломерам олигонуклеотидов (ИФА) без ПЦР далеко не самый чувствительный, но полностью автоматизированный и оптимизированный для поиска ингибиторов теломеразы. Определение теломеразной активности с помощью FRET и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения дает возможность детектировать удлинение теломеразой индивидуальных праймеров, может со-
четаться с основанными на FRET методами исследования структуры теломеразы, но при этом позволяет детектировать только первые полтора повтора, синтезированные теломеразой, и предназначено для решения исследовательских задач.
Работа поддержана государственным контрактом № 02.740.11.0706, Российским фондом фундаментальных исследований (грант 08-04-01220-а) и Федеральным агентством по образованию (государственные контракты П1390 и П800).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hayflick L., Moorhead P.S. // Exp. Cell Res. 1961. V. 25.
P. 585-621.
2. Olovnikov A.M. // J. Theor. Biol. 1973. V. 41(1). P. 181-190.
3. Blackburn E.H. // Cell. 2001. V. 106(6). P. 661-673.
4. Pandita T.K., Hunt C.R., Sharma G.G., Yang Q. // Cell Mol. Life Sci. 2007. V. 64(2). P. 131-138.
5. Greider C.W., Blackburn E.H. // Cell. 1985. V. 43(2). P. 405-413.
6. Blackburn E.H. // Nature. 1991. V. 350(6319). P. 569-573.
7. Maida Y., Yasukawa M., Furuuchi M., Lassmann T., Posse-mato R., Okamoto N., Kasim V., Hayashizaki Y., Hahn W.C.,
Masutomi K. // Nature. 2009. V. 461(7261). P 230-235.
8. Pasrija T., Srinivasan R., Behera D., Majumdar S. // Eur. J. Cancer. 2007. V. 43(9). P. 1476-1482.
9. Kedde M., le Sage C., Duursma A., Zlotorynski E., van Leeu-wen B., Nijkamp W., Beijersbergen R., Agami R. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281(52). P. 40503-40514.
10. Скворцов Д.А., Рубцова М.П., Зверева М.Э., Киселев Ф.Л., Донцова О.А. // Acta Naturae. 2009. V. 1(1). С. 51-67.
11. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L., Coviello G.M., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. // Science. 1994. V. 266(5193). P. 2011-2015.
12. Saldanha S.N., Andrews L.G., Tollefsbol T.O. // Anal. Bio-chem. 2003. V. 315(1). P. 1-21.
13. Wright W.E., Shay J.W., Piatyszek M.A. // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23(18). P. 3794-3795.
14. Скворцов Д.А., Гаспарьян Н.М., Рубцова М.П., Зверева М.Э., Федорова М.Д., Павлова Л.С., Богданов А.А., Донцова О.А., Киселев Ф.Л. // ДАН. 2006. T. 408(4). С. 556-559.
15. Gomez D., Mergny J.L., Riou J.F. // Cancer Res. 2002.
V. 62(12). P. 3365-3368.
16. Gan Y., Lu J., Johnson A., Wientjes M.G., Schuller D.E., Au J.L. // Pharm. Res. 2001. V. 18(4). P. 488-493.
17. Dalla Torre C.A., Maciel R.M., Pinheiro N.A., Andrade J.A., De Toledo S.R., Villa L.L., Cerutti J.M. // Braz. J. Med. Biol. Res. 2002. V. 35(1). P. 65-68.
18. Holt S.E., Norton J.C., Wright W.E., Shay J.W. // Methods Cell. Sci. 1996. V. 18. P. 237-248.
19. Скворцов Д.А., Зверева М.Э., Павлова Л.С., Петренко А.А., Киселев Ф.Л., Донцова О.А. // Вестник МГУ. 2010. T. 65(3).
С. 165-169.
20. Aldous W.K., Grabill N.R. // Diagn. Mol. Pathol. 1997. V. 6(2). P. 102-110.
21. Gollahon L.S., Holt S.E. // Cancer Lett. 2000. V. 159(2).
P. 141-149.
22. Uehara H., Nardone G., Nazarenko I., Hohman R.J. // Biotechniques. 1999. V. 26(3). P. 552-558.
23. Szatmari I., Tokes S., Dunn C.B., Bardos T.J., Aradi J. // Anal. Biochem. 2000. V. 282(1). P. 80-88.
24. Szatmari I., Aradi J. // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29(2). P. E3.
25. Bazin H., Preaudat M., Trinquet E., Mathis G. // Spectro-chim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2001. V. 57(11). P. 21972211.
26. Gabourdes M., Bourgine V., Mathis G., Bazin H., Alpha-Ba-zin B. // Anal. Biochem. 2004. V. 333(1). P. 105-113.
27. Savoysky E., Akamatsu K., Tsuchiya M., Yamazaki T. // Nucl. Acids Res. 1996. V. 24(6). P. 1175-1176.
28. Hirose M., Abe-Hashimoto J., Ogura K., Tahara H., Ide T., Yoshimura T. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1997. V. 123(6).
P. 337-344.
29. Mayfield M.P., Shah T., Flannigan G.M., Hamilton Stewart P.A., Bibby M.C. // Int. J. Mol. Med. 1998. V. 1(5). P. 835-840.
30. Hoos A., Hepp H.H., Kaul S., Ahlert T., Bastert G., Wallwie-ner D. // Int. J. Cancer. 1998. V. 79(1). P. 8-12.
31. Chen L., Huang J., Meng F., Zhou N. // Anal. Sci. 2010.
V. 26(5). P. 535-538.
32. Hou M., Xu D., Bjorkholm M., Gruber A. // Clin. Chem. 2001. V. 47(3). P. 519-524.
33. Elmore L.W., Forsythe H.L., Ferreira-Gonzalez A., Garrett C.T., Clark G.M., Holt S.E. // Diagn. Mol. Pathol. 2002. V. 11(3).
P. 177-185.
34. Kong D., Jin Y., Yin Y., Mi H., Shen H. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 388(3). P. 699-709.
35. Heller-Uszynska K., Kilian A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 323(2). P. 465-472.
36. Ohyashiki K., Ohyashiki J.H., Nishimaki J., Toyama K., Ebi-hara Y., Kato H., Wright W.E., Shay J.W. // Cancer Res. 1997.
V. 57(11). P. 2100-2103.
37. Yahata N., Ohyashiki K., Ohyashiki J.H., Iwama H., Hayashi
S., Ando K., Hirano T., Tsuchida T., Kato H., Shay J.W., et al. // J. Natl. Cancer Inst. 1998. V. 90(9). P. 684-690.
38. Ohyashiki K., Yahata N., Ohyashiki J.H., Iwama H., Hayashi
S., Ando K., Aizawa T., Ito T., Miki M., Ebihara Y. // Cancer. 1998. V. 83(12). P. 2554-2560.
39. Dejmek A., Yahata N., Ohyashiki K., Kakihana M., Hirano T., Kawate N., Kato H., Ebihara Y. // Cancer. 2000. V. 90(2).
P. 117-125.
40. Dejmek A., Yahata N., Ohyashiki K., Ebihara Y., Kakihana M., Hirano T., Kawate N., Kato H. // Diagn. Cytopathol. 2001.
V. 24(1). P. 11-15.
41. Youssef N., Paradis V., Ferlicot S., Bedossa P. // J. Pathol. 2001. V. 194(4). P. 459-465.
42. Hirose M., Abe-Hashimoto J., Tahara H., Ide T., Yoshimura T. // Clin. Chem. 1998. V. 44(12). P. 2446-2452.
43. Blackburn E.H., Greider C.W., Henderson E., Lee M.S., Shampay J., Shippen-Lentz D. // Genome. 1989. V. 31(2).
P. 553-560.
44. Maesawa C., Inaba T., Sato H., Iijima S., Ishida K., Terashi-ma M., Sato R., Suzuki M., Yashima A., Ogasawara S., et al. // Nucl. Acids Res. 2003. V. 31(2). P. E4-4.
45. Rad'ko S.P., Voronina S.A., Gromov A.V., Gnedenko O.V., Bodoev N.V., Ivanov A.S., Yarygin K.N. // Bull. Exp. Biol. Med. 2009. V. 147(6). P. 746-749.
46. Grimm J., Perez J.M., Josephson L., Weissleder R. // Cancer Res. 2004. V. 64(2). P. 639-634.
47. Pavlov V., Willner I., Dishon A., Kotler M. // Biosens. Bioelectron. 2004. V. 20(5). P. 1011-1021.
48. Sato S., Kondo H., Nojima T., Takenaka S. // Anal. Chem. 2005. V. 77(22). P. 7304-7309.
49. Li Y., Liu B., Li X., Wei Q. // Biosens. Bioelectron. 2010.
V. 25(11). P. 2543-2547.
50. Schmidt P.M., Matthes E., Scheller F.W., Bienert M., Lehmann C., Ehrlich A., Bier F.F. // Biol. Chem. 2002. V. 383(10).
P. 1659-1666.
51. Patolsky F., Gill R., Weizmann Y., Mokari T., Banin U., Willner I. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125(46). P. 13918-13919.
52. Sharon E., Freeman R., Willner I. // Anal. Chem. 2010.
V. 82(17). P. 7073-7077.
53. Zheng G., Patolsky F., Cui Y., Wang W.U., Lieber C.M. // Nat. Biotechnol. 2005. V. 23(10). P. 1294-1301.
54. Sharon E., Freeman R., Riskin M., Gil N., Tzfati Y., Willner I. // Anal. Chem. 2010. Sep 17. [Epub ahead of print]
55. Xu S.Q., He M., Yu H.P., Wang X.Y., Tan X.L., Lu B., Sun X., Zhou Y.K., Yao Q.F., Xu Y.J., et al. // Clin. Chem. 2002. V. 48(7). P. 1016-1020.
56. Zhou X., Xing D., Zhu D., Jia L. // Anal. Chem. 2009. V. 81(1). P. 255-261.
57. Wu J.Y., Stone M.D., Zhuang X. // Nucl. Acids Res. V. 38(3).
P. e16.
58. Kha H., Zhou W., Chen K., Karan-Tamir B., San Miguel T., Zeni L., Kearns K., Mladenovic A., Rasnow B., Robinson M., et al. // Anal. Biochem. 2004. V. 331(2). P. 230-234.
59. Schmidt P.M., Lehmann C., Matthes E., Bier F.F. // Biosens. Bioelectron. 2002. V. 17(11-12). P. 1081-1087.
60. Xiao Y., Pavlov V., Niazov T., Dishon A., Kotler M., Willner I. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126(24). P. 7430-7431.
61. Pavlov V., Xiao Y., Gill R., Dishon A., Kotler M., Willner I. // Anal. Chem. 2004. V. 76(7). P. 2152-2156.
ИННОВАЦИОННАЯ РОССИЯ
дискуссионный клуб
Мы формируем диалог между студентами, учеными, преподавателями, бизнесменами, менеджерами, инноваторами, инвесторами, дизайнерами, искусствоведами, архитекторами, фотографами - всеми социально-активными людьми.
Узнай больше на WWW.STRF.RU
Мы приглашаем на наши мероприятия всех, кому есть что сказать, кто хочет поделиться своими идеями
Тел.: +7 (495) 930-87-07, 930 8850 Е-таіІ: [email protected]
