CC BY
229
664.022
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФИКОЦИАНИНА ИЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ СИНЕЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ КАК ПИЩЕВОЙ ДОБАВКИ
А.А. ЕФИМОВ
Камчатский государственный технический университет
Цвет пищевых продуктов, их внешняя привлекательность играют большую роль в реализации продуктов питания, оценке их стоимости и конкурентоспособности. Появление в начале ХХ в. ярких и стойких синтетических красителей, во многом вытеснивших натуральные пигменты, обострило вопрос о безопасности и гигиенической оценке красителей и привело к возникновению ряда законодательных документов в этой области.
Природные красители - естественные компоненты пищевых продуктов или биологических объектов, не употребляемые обычно в качестве продуктов питания или составной их части. Натуральные красители как правило выделяют из природных источников в виде смеси соединений, различных по своей химической природе, состав которой зависит от источника и технологии получения, в связи с чем бывает сложно обеспечить его постоянство. Натуральные красители обычно не обладают токсичностью, но для многих из них установлены допустимые суточные дозы. Некоторые натуральные красители обладают биологической активностью.
Фикоцианин - специфический фотосинтетический пигмент синезеленых водорослей, входящий в состав тетрапиррольных пигментов фикобилинов вместе с фикоэритрином и аллофикоцианином. Фикоцианин -основной пигмент данной группы (синего цвета) -комплекс фикоцианобилина с белком, его молекулярная масса составляет 226 кДа [1]. В зарубежной практике фикоцианин используют как пищевой краситель, как колорант в косметической промышленности [2, 3]. Кроме того, фикоцианин - биологически активное вещество, обладает антиоксидантной, антивирусной активностью [4, 5].
Для выделения фикоцианина нами предложено использование биомассы термофильных синезеленых водорослей - обитателей горячих источников с температурой 45-55°С. Это обусловлено способностью водорослей к быстрому воспроизводству биомассы -50 мг сухого вещества в час с 1 м2 поверхности - в условиях высоких температур и постоянством химического состава термальных вод природных источников, что позволяет осуществлять искусственное культивирование водорослей с наименьшими затратами. Результаты исследований, проведенных нами в 1995-2006 гг., показали, что возможно и перспективно промышленное культивирование синезеленых водорослей [6].
Цель исследований - определение способов, технологических режимов выделения фотопигмента фикоцианина из термофильных синезеленых водорослей и получения из него пищевой добавки - пищевого красителя.
В качестве сырья использовали биомассу термо -фильных синезеленых водорослей рода Ркогт1ёшт, культивированных в искусственных условиях.
Для получения пищевой добавки биомассу водо -рослей промывали с целью удаления загрязнений и компонентов среды культивирования. Промывание производили на сите с размером ячеи 1,0 х 1,0 мм пресной питьевой водой, соответствующей требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01, с температурой < 20°С, расход воды составил 10 : 1.
Размер ячеи сита оказывает влияние на потери биомассы за счет потери отдельных клеток, целых водорослевых нитей с промывными водами. Для выбора размера ячеи промывание проводили на ситах с размером ячеи 1,5 х 1,5; 1,0 х 1,0; 0,5 х 0,5 мм. Синезеленые водоросли рода Ркогт1сИыт образуют длинные нити (трихомы), связанные между собой полисахаридной слизью. Такие структуры хорошо задерживаются на сите с крупной (1,5 х 1,5 мм) ячеей. Минимальные потери - 0,5% от массы исходного сырья - получили при использовании сита с размером ячеи 0,5 х 0,5 мм. Однако при этом из-за забивания ячеи сита биомассой резко возрастала продолжительность промывания. Оптимальным оказалось промывание биомассы на сите с размером ячеи 1,0 х 1,0 мм.
Промывание вели до исчезновения в промывной воде следов сульфат-ионов, определяемых реакцией с ионами бария, так как содержание сульфат-ионов в питательной среде при культивировании синезеленых водорослей наибольшее. Для равномерности протекания процесса промывание проводили при медленном, осторожном перемешивании, когда клеточные стенки не повреждаются, не происходит их вымывания и потерь внутриклеточного содержимого.
После промывания биомассу хранили до дальнейшей переработки. Условия хранения оказывают значительное влияние на состояние и выход целевых веществ.
Фикоцианин по своей химической природе - сложный белок, характеризующийся химической и микробиологической лабильностью. Как фотопигмент фикоцианин изменяет свои свойства при воздействии света. При хранении биомассы необходимо обеспечить такие условия, которые предотвращают изменения фикоциа-нина, обеспечивают его максимальный выход как готового продукта.
Исследовали такие способы хранения до обработки, как охлаждение, замораживание, сушка. Изменения в биомассе определяли по содержанию небелкового азота как показателю порчи белка и по содержанию фикоцианина. Для предотвращения изменений фотопигментов хранение проводили в темноте. Предельный срок хранения без охлаждения при 20°С определяли по органолептическим показателям и по содержанию небелкового азота; он составил < 6 ч. При хранении в охлажденном до 4-9°С состоянии в течение 5 сут содержание фикоцианина не изменялось, однако уже через 3 сут повышение содержания небелкового азота и появление неприятного запаха свидетельствовали о начальной стадии порчи. Предельный срок хранения при 4-9° С - до 48 ч.
При хранении биомассы в замороженном состоянии при -18°С не только не снизилось содержание фикоцианина, но у величился его выход до 84% от начального содержания в биомассе за счет дезинтеграции субклеточных чехлов и клеточных стенок при замораживании-размораживании. Тем не менее, увеличение выхода пигмента при такой дезинтеграции оказалось ненамного большим, чем при проведенной на дальнейших этапах технологии механической гомогенизации. С учетом значительных энергетических затрат на замораживание и холодильное хранение этот способ хранения биомассы не имеет преимуществ перед охлаждением. Сушка биомассы потоком воздуха с температурой 35°С приводила к снижению последующего выхода фикоцианина до 56%.
Оптимальным вариантом с точки зрения предотвращения порчи, выхода готового продукта, снижения затрат являлось хранение биомассы до обработки в охлажденном до 4-9°С состоянии в течение 48 ч.
После промывки биомассы содержание влаги в ней достигало 95%, что требовало на дальнейших операциях повышенного расхода компонентов - буферного раствора, реагентов для фракционирования. Значительная часть влаги являлась свободной, находилась на поверхности водорослевой массы и легко удалялась отстаиванием, фильтрованием, центрифугированием. Фильтрование и отстаивание проводили на сите с размером ячеи 1,0 X 1,0 мм до прекращения отделения воды. Продолжительность процесса 35-40 мин. При таком способе отделения влаги содержание сухих веществ в массе составило около 15%, что недостаточно для проведения дальнейших операций. Более полного отделения влаги достигали центрифугированием при режимах 400, 600, 800, 1000 об/мин. При частоте вращения 800 об/мин обнаруживали признаки разрушения клеточных оболочек и вытекания внутриклеточного содержимого - промывная вода приобретала сине-фиолетовый цвет. Скорость отделения влаги при увеличении продолжительности центрифугирования уменьшалась и после 2 мин центрифугирования при 600 об/мин становилась незначительной. Оптималь-ный режим центрифугирования: частота вращения 600 об/мин, продолжительность2 мин. При этом остаточное содержание сухих веществ составило 20%.
После отделения влаги проводили дезинтеграцию клеток водорослей, которая должна обеспечивать оптимальную степень разрушения клеточных стенок и сохранение нативных свойств выделяемых компонентов. Дезинтеграция необходима для оптимизации дальнейших экстракционных процессов.
Экстрагирование водорастворимого белка фико-цианина происходило и при неразрушенных клеточных стенках, через 4-5 сут экстракт приобретал сине-фиолетовый цвет. При получении пигмента в промышленных масштабах такая скорость экстракции недостаточна. Необходимо разрушить клеточные стенки и чехлы трихомов, отделить фикобилипротеиновые антенные комплексы от наружной поверхности тила-коидных мембран клеток и перевести их в раствор. При этом нежелательно дальнейшее измельчение де-зинтеграта, разрушение тилакоидных мембран и хлорофилловых комплексов, агрегированных внутри и на поверхности мембран. При чрезмерной дезинтеграции раствор билипротеинов загрязнялся очень тонкой взвесью органелл, хлорофилловых комплексов, проходивших через тонкие фильтры, практически не отделявшихся отстаиванием, а при центрифугировании разделявшихся только на очень высоких оборотах. Отделение таких компонентов при фракционировании билипротеинов требовало введения дополнительной операции - предварительного осаждения загрязняющих компонентов, высокого расхода реагентов. Выход фикоцианина при неполной дезинтеграции снижался на 2,5%, так как часть белков оставалась связанной с неразрушенными тканями. Однако при этом не наблюдали выхода хлорофилла, не требовалось проведения дополнительных технологических операций и дополнительного расхода реагентов.
Ферментативные и химические методы дезинтеграции клеток сопровождаются изменением фикобили-протеинов, поэтому они в работе не рассматривались.
Применение замораживания-размораживания, как показало микроскопирование, не обеспечивало достаточной степени разрушения клеточных стенок. Кроме того, этот процесс длителен и энергоемок, и его целесообразно применять как дополнительный при использовании мороженого сырья.
Механическую дезинтеграцию проводили в блендере ножевого типа при минимальных скоростях во избежание нагрева продукта - 1000 об/мин в течение 15, 30, 45, 60 с. Продолжительность измельчения устанавливали исходя из требуемой степени измельчения, разрушение трихома и клеточных стенок контролировали микроскопированием. При продолжительности измельчения менее 45 с в образцах обнаруживали многочисленные неразрушенные трихомы. При продолжительности дезинтеграции свыше 45 с в растворе присутствовала трудноотделяемая взвесь. Оптимальным режимом механической дезинтеграции определили частоту вращения 1000 об/мин при продолжительности 45 с.
Затем проводили экстрагирование комплекса фи-кобилипротеинов водой. В целях повышения концен-
трации растворенных компонентов и снижения расхода реагентов использовали растворы, извлеченные из дезинтегрированной массы, которые составляли 80% от массы исходного продукта. Разбавление водой не ускоряло процесса экстрагирования. Для ускорения процесса, особенно без добавления экстрагента, применяли перемешивание при частоте 60 об/мин. Продолжительность процесса определяли по скорости накопления продуктов экстракции - водорастворимых фотопигментов. Скорость накопления пигментов контролировали по оптической плотности раствора и по достижению равновесной концентрации в жидкой фазе. При 40С и скорости перемешивания 60 об/мин рав -новесной концентрации достигали через 1,25 ч. Для извлечения остаточных фикобилипротеинов из твердой фазы использовали повторную экстракцию свежей порцией растворителя в соотношении 1 : 1 в течение 30 мин и затем объединяли полученные экстракты. Применение двухступенчатой экстракции позволило увеличить выход фикобилипротеинов на операции на 4%.
После экстрагирования в жидкой фазе содержался комплекс водорастворимых фотопигментов, в том числе фикоцианин, в твердой фазе - хлорофилл и кароти-ноиды. Полного осаждения твердой фазы и получения плотного осадка без потерь фикоцианина достигали при факторе разделения > 900g (где g - ускорение свободного падения, м/с2) и центрифугировании в течение 4 мин.
Фракционирование фикобилипротеинов производили высаливанием сульфатом аммония в присутствии фосфатного буфера при рН 7. В исходном растворе, по результатам спектральных анализов, присутствовали фикоцианин и фикоэритрин. При добавлении 80% насыщенного раствора сульфата аммония в осадок выпадал фикоцианин. Процесс проводили при 40С в темноте. Полное выпадение осадка фикоцианина наблюдали через 2-3 ч. Отделение осадка производили при значении фактора разделения 1240g в течение 10 мин. При меньших значениях фактора разделения и продолжительности осаждения получили неполное осаждение и неплотный, сильно загрязненный растворенным фико-эритрином осадок
Выделившийся осадок фикоцианина из-за соосаж-дения примесей содержал значительное - до 20% - количество фикоэритрина. Очистку фикоцианина производили методом переосаждения. Осадок суспендировали в равном количестве буферного раствора и при добавлении 80% насыщенного раствора сульфата аммония осаждали повторно.
Полученный осадок имел характерную для фикоцианина синюю окраску, слабую красную флуоресценцию, содержал незначительное количество фикоэрит-рина и был загрязнен неорганическими солями, в основном сульфатом аммония. Для удаления низкомолекулярных примесей использовали процесс диализа через полупроницаемые мембраны - целлофан и перга-
мент. В качестве чистого растворителя использовали питьевую воду. Конструкция лабораторной установки для диализа предусматривала создание постоянного притока чистого растворителя в камеру пермеата и постоянный отвод отработанного пермеата. Содержащиеся в растворе низкомолекулярные вещества за счет диффузии через поры мембраны проходили в зону пермеата, через которую непрерывно протекала чистая вода. Фикоцианин как высокомолекулярное соединение оставался в растворе. Таким образом достигали обес-соливания. Процесс перехода сульфата аммония в пер-меат, а также остаточное количество сульфата аммония в растворе контролировали качественной реакцией на ионы аммония с реактивом Несслера. Отсутствие белков в пермеате проверяли биуретовой реакцией. Более быстро - в течение 4 ч - полной очистки раствора достигали при использовании пергамента в качестве полупроницаемой мембраны.
Полученный осадок фикоцианина содержал 70% влаги. Для получения готового продукта - порошкообразного фикоцианина применяли процесс сушки осадка в потоке воздуха. Оптимальные результаты были достигнуты при температуре сушки 35°С. При более высокой температуре функциональные свойства фикоцианина, в том числе его растворимость, снижались. Полученный после высушивания порошок синего цвета полностью растворялся в воде.
Показатели безопасности готового продукта определяли на базе лаборатории ГУППП « Камчатпищепро-дукт», ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Камчатской области», степень токсичности определяли с использованием в качестве тест-объекта реснитчатой инфузории Tetrahymena pyriformis.
Таким образом, на основе лабораторных методов обоснована технология получения пигмента фикоциа-нина из биомассы термофильных синезеленых водорослей - естественного богатого источника этого вещества.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мокроносов А.Т., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В.
Фотосинтез. Физиолого-экологические и биохимические аспекты. -М.: Академия, 2006. - 448 с.
2. Cohen Z. Product from Microalgae // Richmond A. Handbook of Microalgal Mass Culture. - CRC Press Inc. Boca Raton, 1986. - Р. 421-454.
3. Yoshinda A., Takagaki Y., Nishimune I . Enzyme immunoassay for phycocyanin as the main component of Spirulina colour in food biotechnology // Biochem. - 1996. -60. - Р. 57-60.
4. Anti-inflammatory activity of Phycocyanin extract in acetic acid induced colitis in rats / R Gonzalez., S. Rodriguez, C. Romay et al. // Pharmacological Research. - 1999. - № 39. - 1. - Р. 55-59.
5. Antiviral activity of Spirulina maxima against herpes simplex virus type 2 / A. Henrndez-Corona, I. Nieves, M. Meckes et al. // Antiviral Research. - 2002. - № 56. - 3. - P. 279-285.
6. Пат. 2 292389 РФ. Способ культивирования термофильных цианобактерий / М.В. Ефимова, Т.И. Кузякина, А. А. Ефимов // БИПМ. - 2007. - № 3.
Кафедра технологии рыбных продуктов
Поступила 20.07.07 г.
