CC BY
72
УДК 612.017.1:576.314
убТ-ЛИМФОЦИТЫ У ПАЦИЕНТОВ СТАРШИХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
Российский государственный медицинский университет, г. Москва
И.В. МИРОШНИЧЕНКО В.Н. СТОЛПНИКОВА Т.В. ЛЕВАШОВА Е.А. СОРОКИНА
e-mail: lab_immunol@mail.ru
Изучали возрастные изменения в субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови пожилых людей. Обследовано 408 пациентов в возрасте от 60 до 96 лет. В работе использовали метод проточной цитофлюорометрии и специально подобранные комбинации моноклональных антител для выявления минорных субпопуляций лимфоцитов. При старении отмечено снижение численности CDз+CD8+, CD3+CD4+ Т- и CD19+ В-лимфоцитов и увеличение CD3+CD4-CD8- Т-лимфоцитов. Установлено, что последние имеют фенотип CDз+CD4"CD8"CDl6+/"TCRY5+ и выявляются при заболеваниях желудочно-кишечного, бронхо-легочного и урогенитального трактов. Определение YSТ-клеток может быть использовано в качестве дополнительной диагностики хронических воспалительных процессов, локализующихся на слизистых оболочках.
+
Ключевые слова: субпопуляционный состав лимфоцитов, Y5T-MeTKH, возрастные особенности.
Введение. Главной структурой поверхности Т-лимфоцитов, от которой зависит выполнение основных иммунологических функций этой клеткой, является Т-клеточный рецептор (T-cell receptor, TCR). Большинство Т-лимфоцитов крови и периферических лимфоидных органов являются aPTCR-клетками, происходят из плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки и дифференцируются в зрелые CD4+ и CD8+ лимфоциты. Кроме aPTCR-клеток существует малочисленная или минорная субпопуляция Т-лимфоцитов, экспрессирующих уб-тип TCR (1-10% от числа всех циркулирующих лимфоцитов).
В отличие от aPTCR-клеток убТСЖ-клетки покидают тимус на ранних этапах эмбрионального развития для того чтобы завершить процесс созревания вне тимуса. Местами обитания этих клеток являются, как правило, эпителиальные ткани: кожа, эпителий кишечника, легких, мочеполовой системы [10, 14, 15].
Т-лимфоциты, экспрессирующие y6TCR, могут распознавать уникальный тип малых молекул и стимулироваться ими к олигоклональной пролиферации без участия антигенпрезентирующих клеток [7]. Также есть предположение, что y6TCR распознает антиген подобно иммуноглобулинам [4]. Многие авторы склонны к тому, что уб-клетки имеют характеристики антигенпрезентирующих клеток, что немаловажно для оценки их участия в формировании адаптивного антимикробного иммунитета [5, 8, 9].
Распределение уб-клеток в тканях человека происходит в зависимости от строения V-области у- и б-цепей. Так, в периферический крови преобладают клетки с фенотипом VY9+V62+, в кишечнике Vy8+V62+ [13]. На большинстве уб-клеток отсутствуют субпопуляционные маркеры CD4 и CD8 [11]. Хотя некоторые исследования указывают на наличие маркера CD8 на клетках, локализующихся в эпителии кишечника [6, 12].
В проведенных нами ранее исследованиях было показано, что в периферической крови пациентов старших возрастных групп появляется необычная и малочисленная субпопуляция с фенотипом CD3+CD4-CD8-, названная условно двойными негативными Т-клетками [3].
Мы предполагаем, что ДНТ могут относиться к одной из минорных субпопуляций убТ-лимфоцитов, которые первыми способны отреагировать на внедрение возбудителя и местом обитания которых являются слизистые оболочки внутренних органов [1, 2].
Целью настоящего исследования было определить, действительно ли ДНТ являются убТ-клетками и выявить, при каких заболеваниях старческого возраста отмечается увеличение их численности.
Материалы и объекты исследования. Определение субпопуляций лимфоцитов периферической крови осуществляли на приборе FacScan фирмы Becton Dickinson (США), используя панели моноклональных антител (МкАТ) фирм ООО Сорбент (Россия) и Beckman Coulter (Франция).
Стандартные комбинации МкАТ (CD3FITC/CD4PE, CD3FITC/CD8PE, CD3FITC/CD16PE и CD19FITC) применяли для фенотипирования Т-клеток (Т-кл), естественных киллерных клеток (ЕКК) и В-клеток (В-кл). Количество ДНТ-лимфоцитов определяли путем вычитания из общего числа Т-кл суммы субпопуляций с фенотипом CD3+CD4+ (Т4) и CD3+CD8+ (T8). В дальнейших исследованиях для фенотипирования ДНТ нами была разработана комбинация МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRy5PE/CD3PC5. Для определения фенотипического разнообразия убТ-клеток (у8Т-кл), выявленных у пациентов, использовали комбинации CD8FITC/TCRy5PE, CD4FITC/TCRy5PE и CD16FITC/TCRy5PE.
Объектом исследования служила периферическая кровь 408 пациентов клиники филиала РГМУ «НКЦ геронтологии» пожилого, старческого возраста и долгожителей.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA (версия 6.0).
Результаты и обсуждение. Для решения вопроса о возрастных изменениях структуры и численности субпопуляционного состава лимфоцитов ретроспективно были проанализированы иммунограммы 230 пациентов пожилого, старческого возраста и долгожителей. В этих исследованиях количество ДНТ вычисляли по разнице между Т-кл и суммой Т4 и Т8.
Полученные данные сопоставляли с общепринятой нормой для здорового человека в возрасте 20-50 лет. Выбор такого сравнения был обусловлен тем, что среди обследованных пациентов невозможно было подобрать соответствующую группу контроля. Средние значения относительных и абсолютных показателей в разных возрастных группах представлены в табл. 1 и 2.
Как видно из таблицы 1, у лиц всех старших возрастных групп процент Т8 и Вкл был статистически значимо ниже нормы, а ДНТ-лимфоцитов - выше нормы. У пациентов в возрасте 60-74 лет был увеличен, по сравнению с нормой, процент Т-кл и Т4. Возможно, это связано с еще неутраченным потенциалом иммунной системы к активному ответу на воспалительные процессы, которые учащаются в данном возрасте и приобретают в дальнейшем хроническое течение.
Таблица 1
Возрастные изменения относительных значений показателей субпопуляционного состава лимфоцитов по сравнению с нормой
Субпопуляции лимфоцитов Среднее арифметическое (М), границы доверительного интервала с уровнем вероятности 95% Оэд), кл/мкл, для: возрастных групп:
Референсные Значения 60-74 лет (n=95) 75-89 лет (n=75) 90 лет и старше (n=60)
1 2 3 4 5
Т-кл 72,5 65-80 74,6* 72,6-76,5 71,9 69,2-74,6 71,4 68,1-74,6
Т4 40 30-50 44,2* 42,3-46,2 42,8* 40,1-45,6 41 37,4-44,6
1 2 3 4 5
Т8 29 20-38 22,7* 20,9-24,6 20,6* 18,5-22,7 23,1* 19,1-27,1
ЕКК 15 10-20 13,5 11,9-15,0 17,1 14,8-19,5 16,2 13,8-18,6
ДНТ 2,5 0-5 7,9* 6,3-9,5 8,5* 7,1-9,8 7,4* 5,8-8,9
В-кл 11,5 7-167 7,9* 7,2-8,7 7,9* 6,7-9,1 7,5* 6,1-8,9
Примечание: * - статистически значимое отклонение от нормы (р<0,05).
У лиц пожилого возраста среднее абсолютное количество Т-кл и Т4, так же как и их процент (табл.1), достоверно превышали норму. В группе старческого возраста и у
долгожителей отмечено существенное снижение количества Т8-лимфоцитов. В группе долгожителей средний показатель Т4, Т8 и В-кл был статистически достоверно ниже нормы.
Таблица 2
Возрастные изменения абсолютных значений показателей субпопуляционного состава лимфоцитов по сравнению с нормой
Субпопуляции лимфоцитов М и кл/мкл, для возрастных групп:
Референсные значения 60-74 лет (п=95) 75-89 лет (п=75) 90 лет и старше (п=60)
Т-кл 1450 1100-1800 1808* 1655-1962 1598 1420-1776 1348 1178-1518
Т4 850 600-1100 1082* 974-1189 957 841-1072 753* 657-849
Т8 600 400-800 552 485-620 464* 383-544 455* 360-551
ЕКК 300 200-400 335 286-385 384* 314-454 327 245-408
ДНТ 35 0-70 180* 141-219 180* 145-215 145* 107-182
В-кл 200 100-300 183 163-203 168 138-197 140* 107-172
Примечание: * - статистически значимое отклонение от нормы (р<0,05)
Численность ДНТ-клеток в каждой возрастной группе статистически отличалась от нормы и превышала ее верхний предел.
Для характеристики ДНТ и сравнения их с убТ-кл было обследовано 93 пациента. Использовали заранее отработанную комбинацию МкАТ (CD4+CD8)FITC/TCRYбPE/CDзPC5, с помощью которой можно одновременно определить как ДНТ, так и у8Т-кл. Дополнительно определяли экспрессию поверхностных молекул CD8, CD4 и СDl6 на у8Т-кл.
Было показано, что клетки с фенотипом CDз+CD4-CD8- и CDз+TCRYб+ имели одинаковую интенсивность свечения рецептора CDз и аналогичное расположение на гистограмме.
У некоторых пациентов как ДНТ так и убТ-кл включали в свой состав CDl6+TCRYб+ Т-лимфоциты. В ряде случаев численность убТ-кл была выше ДНТ за счет наличия CD8+TCRY+ клеток. Однако процент у8Т-кл, несущих рецепторы CD8 и CDl6, был незначителен и поэтому количество сравниваемых фенотипических типов клеток, как правило, совпадало.
В табл. 3 представлены средние значения для CDз+CD4-CD8-CDl6+/- ДНТ и у8Т-кл и степень корреляции между ними.
Таблица 3
Оценка степени корреляции между количеством ДНТ и ТСКу8+ клеток у пациентов старших возрастных групп
Возрастная группа Кол-во пациентов(п) М, 1^95 клеток минорных субпопуляций, кл/мкл Достовер-ность различий ф) Степень корреляции (г)
ДНТ у5Т-кл
60-74 лет 36 90 64-116 105 71-140 0,09 0,87
75-89 лет 25 77 49-106 90 57-123 0,24 0,76
90 лет и старше 32 71 38-104 81 42-120 0,1 0,97
Во всех возрастных группах пациентов на фоне полиморбидности среднее количество ДНТ превышало норму, но было ниже у долгожителей. Степень корреляции между CDз+CD4-CD8-CDl6+/- ДНТ и убТ-кл составила 0,87; 0,76 и 0,97, соответственно возрастной группе, и интерпретировалась как сильная.
Мы предположили, что увеличение численности у8Т-кл (ДНТ) лимфоцитов у пациентов старше 6о лет могло быть связано с конкретными заболеваниями, при которых с большой степенью вероятности развиваются иммунные воспалительные процессы инфекционной природы на слизистых внутренних органов.
С этой целью было обследовано 85 пациентов в возрасте 60 лет и старше с одинаковым основным диагнозом (заболевания сердечно-сосудистой системы). Проведенный анализ историй болезни показал, что у 38 пациентов (45%) были отмечены сопутствующие заболевания, связанные с хроническими воспалительными процессами желудочно-кишечного, бронхолегочного или урогенитального трактов. Среди них у 90% были выявлены ДНТ в количествах, превышающих норму (Рис.1).
Степень корреляции (использовали непараметрический метод Кендалла) между перечисленными сопутствующими заболеваниями и увеличением ДНТ или у8Т-кл в периферической крови таких пациентов составила 0,37 при р<0,05, что подтвердило наличие прямой связи между сравниваемыми признаками.
Рис. 1. Частота встречаемости повышенных и нормальных значений ДНТ
у пациентов старше 60 лет
Примечание: группа 1 - пациенты с заболеванием сердечно-сосудистой системы и сопутствующими хроническими заболеваниями ЖКТ, бронхо-легочного и урогенитального трактов, группа 2 - пациенты с заболеваниями сердечно-сосудистой системы без сопутствующих хронических заболеваний ЖКТ, бронхо-легочного и урогенитального трактов.
Заключение. Таким образом, у пациентов старших возрастных групп по мере старения отмечалась общая тенденция снижения абсолютных и относительных значений Т-кл, Т4, Т8 и В-кл, что свидетельствовало о развитии вторичной иммунологической недостаточности (ВИН). На этом фоне отмечалось увеличение количества ДНТ клеток.
С высокой степенью корреляции показана идентичность СВз+СБ4-СВ8-СБ1б+/-(ДНТ) и у8Т-кл, а также связь их с заболеваниями, при которых существенную роль играют хронические воспалительные процессы, локализующиеся на слизистых оболочках организма и имеющих иммунную природу. Поэтому выявление этих клеток у лиц старше 60 лет может быть использовано в качестве дополнительной диагностики сопутствующих хронических заболеваний с вялотекущими воспалительными процессами, особенно при отсутствии ситмптоматики.
Для выявления в периферической крови СВз+СБ4-СВ8-СБ1б+/- и у8Т-кл рекомендуются комбинации МкАТ (СВ4+СВ8)ЕГГС/тСКу8РЕ/СБзРС5 и (СВ4+СВ8)Р1ТС/СБзРЕ. Допустим также ориентировочный расчет этой минорной субпопуляции по результатам стандартного скринингового иммунологического исследования с использованием двухцветной цитометрии.
Предполагаем, что появление у8Т-кл при заболеваниях желудочно-кишечного, бронхолегочного и урогенитального трактов, по-видимому, может расцениваться как благоприятный прогноз течения заболевания на фоне ВИН у пациентов старших возрастных групп.
1. Гамма/дельта Т-клетки как маркер иммунного воспаления при заболеваниях желудочно-кишечного тракта/Т.В. Левашова [и др.]//Клиническая геронтология.-2008.-№9.-С.93-94-
2. Гамма/дельта Т-лимфоциты как маркеры воспалительных процессов у пациентов старше 60 лет/И.В. Мирошниченко [и др.]//Клиническая геронтология.-2009.-№ 8-9.-С.118-119.
3. Количественные изменения показателей иммунитета у долгожителей/ В.Н. Столпникова [и др.]//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2006.-№5.-С.50-53.
4. Aljurf, M. Emerging role of уб T-cells in health and disease/ M. Aljurf, A. Ezzat, O. M. Musa //Bliid Reviews.-2002.-№ 16.-P. 203-206.
5. Flexible migration program regulates gamma delta T-cell involvement in humoral immunity/ M. Brandes [et al.] //Blood.-2003.-i02.-P.3693-370i.
6. Epithelia: lymphocyte interactions in the gut/ S. Dahan [et al.]//Immunological Reviews.-2007.-215.-P.243-253.
7. Ontogeny of gamma delta T cells in humans/ S.C. De Rosa [et al.] //J. Immunoh-2004.-172.-P.1637-1645.
8. Moser, B. Gamma/delta T-cells: an alternative type of professional APC/ B. Moser, M. Brandes //Trends. Immunol.-2006.-27.-P.112-118.
9. Moser, B. уб T cells: novel initiators of adaptive immunity/ B. Moser, M. Eberl //Immunol. Rev.-2007.-215.-P.89-102.
10. уб T cells: firefighters or fire boosters in the front lines of inflammatory responses/ M. Nanno [et al.] //Immunological Reviews.-2007.-215.-P.103-113.
11. Re, F. . Induction of уб- and aß-mediated T cell responses in healthy elderly subjects after influena vaccination/ F. Re, A. Donnini, M. Provinciali //Biogerantology.-2006.-№ 7.-P.249-259.
12. Rocha, B. The extrathymic T-cell differentiation in the murine gut/ B. Rocha //Immunological Reviews.-2007.-215.-P.166-177.
13. High expression of Vy8 is a shared feture of human уб T cells in the epithelium of the gut and in the inflamed synovial tissue/ Soderstrom K. [et al.] //J. Immunol.-1994.-152.-P.6017-6027.
14. Self/non-self discrimination by human уб T cells: simple solutions for a complex issue?/ A. Thedrez [et al.]//Immunol. Rev.-2007.-215.-P.123-135.
15. Xiong, N. Development and selection of уб T cells/ N. Xiong, D.N. Raulet //Immunol.Rev.-2007.-215.-P.15-31.
Литература
yst-lymphocytes in elderly patients
Russian State Medical University, Moscow
I.V. MIROSHNICHENKO V.N. STOLPNIKOVA T.V. LEVASHOVA Е.А. SOROKINA
Age-specific change on elderly people's peripheral blood lymphocyte subpopulation was studied. 408 patients aged from 60 to 96 were inspected. In this research we used the method of flow cytofluorometry and specially selected combinations of monoclonal antibodies for revealing minor subpopulations of lymphocytes. Under ageing process the numbers of CD3+CD8+, CD3+CD4+ T- and CD19+ B-lymphocytes were found to decrease while the numbers of CD3+CD4-CD8- T-lymphocytes increase. The latter had CD3+CD4-CD8-CDi6+/-TCRy8+ phenotype and emerged at diseases of gastrointestinal, bronchopulmonary and urogenital tracts. Determination of Y§T-cells may be used as additional diagnostics of chronical inflammatory diseases on mucosal tunics.
+
e-mail: lab_immunol@mail.ru
Key words: subpopulation structure of lymphocytes, YÖT-cells, ageing characteristics.
