CC BY
109
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
ИММУНООНКОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 618.1-006.04-092:612.112.94.015.2:612.6]-078.33
А.Р Тугуз, Е.Н. Анохина, К.А. Руденко, Д.В. Муженя
СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ, СПОНТАННАЯ И СТИМУЛИРОВАННАЯ IN VITRO продукция IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10 пРИ злОКАчесТВЕННЫх
новообразованиях женских репродуктивных органов
ФГБУ ВПО Адыгейский государственный университет, НИИ комплексных проблем, 385000, г Майкоп, РФ
При анализе соотношения основных про- и противовоспалительных цитокинов интерлейкина (IL)-17А, IL-2, IL-4, IL-10 в сыворотке, супернатантах интактных и стимулированных in vitro ФгА мононуклеарных клеток периферической крови (МНК) у пациенток со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов (n = 31) с гистологически верифицированными диагнозами рака молочной железы, тела и шейки матки I-IV стадии в сравнении со здоровыми донорами (n = 17) выявлены достоверные различия (р < 0,05) по уровню регуляторному IL-2. Отмечено повышение сывороточной концентрации, уровня спонтанной продукции IL-2 в культуре МНК у больных с низкодифференцированной аденокарциномой, быстрым прогрессированием неоплазий и вовлечением регионарных лимфатических узлов. Выявлены корреляционные связи (г = 0,52-0,59) между сывороточной концентрацией, уровнем спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10.
Ключевые слова: спонтанная и стимулированная in vitro продукция цитокинов; IL-17A; IL-2; IL-4; IL-10.
A.R. Tuguz, E.N. Anokhina, K.A. Rudenko, D.VMuzhenya
SERUM LEvELS, SPoNTANEoUS AND INDUCED IN vITRo PRoDUCTIoN IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10 IN MALIGNANT TUMoRS FEMALE REPRoDUCTIvE oRGANS
FSBI HPE Adygheya State University, 385000, Maykop, Russian Federation
Analysis of the relation of the main pro- and anti-inflammatory cytokines IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10 serum supernatant intact and stimulated in vitro PHA peripheral blood mononuclear cells (MNCs) of cancer patients with malignant neoplasms of the female reproductive organs (n = 31) with histologically verified diagnoses of cancer of the breast, body and cervix of the uterus stages I—IV, in comparison with healthy donors (n = 17) revealed significant differences (p < 0,05) on regulatory IL-2. The observed increase in serum concentration levels of the spontaneous production of IL-2 in culture MNCs patients with poorly differentiated adenocarcinoma, a rapid progression of neoplasia and involvement of regional lymph nodes. Identified correlations (r = 0.52-0,59) between savorotocnami concentrations levels of spontaneous and stimulated in vitro PHA production of IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10.
Key words; spontaneous and stimulated in vitro production of cytokines; IL-17A; IL-2; IL-4 and IL-10.
Введение. Биологические эффекты цитокинов, их роль в развитии злокачественных новообразований (ЗНО) определяются соотношением важнейших про-, противовоспалительных (IL-ПА, IL-4, IL-10) и регуляторных (IL-2) медиаторов [1]. Оверэкспрес-сия IL-17A, наблюдаемая при благоприятном течении и прогрессировании ЗНО, может быть обусловлена дисбалансом в медиаторном профиле [2]. Системное повышение уровня IL-2 стимулирует опухолевый рост, а противовоспалительные IL-4 и IL-10 оказывают прямое антипролиферативное действие [1—2]. Механизм противоопухолевого эффекта IL-4 связан с блокированием клеточного цикла и повышением экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) I и II классов [3]. Ключевой регулятор иммунного ответа IL-10 ингибирует синтез других цитокинов, подавляет экспрессию MHC II класса. При некоторых неоплазиях системное повышение содержания IL-10 сочетается с опухолевой прогрес-
Тугуз Аминат Рамазановна (Tuguz Aminat Ramazanovna), [email protected]
сией и является плохим прогностическим признаком [4-5].
Физиологическая концентрация сывороточных цитокинов у здоровых лиц колеблется в узком диапазоне - от 0 до 100 пг/мл, как правило, не превышая 50 пг/мл, а в ряде случаев не детектируется [6-7]. Медиаторные профили у больных со ЗНО пищевода, желудка, легких, почек не зависят от гистологических вариантов, органной локализации неоплазий, степени распространенности заболевания, наличия метастазов в отдаленные органы, но отличаются от таковых у здоровых лиц по уровню IL-4 и IL-2 (24 ± 6,5 пг/ мл: 56,5 ± 9 и 328,9 ± 21 пг/мл: 256,5 ± 23 пг/мл соответственно) [7]. При ЗНО женских репродуктивных органов медиаторный баланс содержания IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10, их спонтанная и стимулированная продукция практически не изучены.
Цель исследования: анализ соотношения уровня основных про- и противовоспалительных цитокинов IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10 в сыворотке, при спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции монону-клеарными клетками (МНК) периферической крови у больных со ЗНО женских репродуктивных органов.
- 24 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
Таблица 1
Цитокиновые профили нативной сыворотки, супернатантов МНК доноров и больных ЗНО женских репродуктивных органов (M±m)
Цитокин Концентрации цитокинов (в пг/мл) t
больные здоровые лица
IL-17A:
сыворотка 2218,2±214,8 2561,6±62,8 1,43
МНК спонтанная 33,1±24,7 522,2±243,2 2,17**
МНК+ФГА 288,6±170,2 198,9±51,8 0,47
IL-2:
сыворотка 244,5±101,6 279,2±149,3 0,19
МНК спонтанная 699,1±150,0 1254,2±95,9 3,12*
МНК+ФГА 532,3±58,1 1186,5±96,6 5,80*
IL-4:
сыворотка 110,5±22,5 111,4±47,5 0,02
МНК спонтанная 81,8±7,3 108,2±16,8 1,70
МНК+ФГА 69,8±5,5 90,4±13,1 1,73
IL-10:
сыворотка 4,8±0,9 2,7±0,5 0,87
МНК спонтанная 2,8±0,5 41,2±26,7 4,99*
МНК+ФГА 2,1±0,9 208,1±70,2 10,32*
Примечание. Здесь и в табл. 2-4: t - критерий Стьюдента; достоверные различия: * - прир < 0,05; ** - прир < 0,01.
Таблица 2
Концентрация IL-17A, IL-2, IL-4 и IL-10 в сыворотке, при спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции МнК у больных рМЖ в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы (M±m)
Уровень цитокина (в пг/мл)
Цитокин высоко- и умереннодифференцированная низкодиф- ферен- цированная t
IL-17A:
сыворотка 2310±380,3 2157±265,9 0,34
МНК спонтанная 38,6±37,8 288,2±287,4 0,70
МНК+ФГА 403,4±385,2 212,0±138,3 0,54
IL-2:
сыворотка 76,2±45,0 391,7±174,9 1,64
МНК спонтанная 328,9±86,5 945,9±241,8 2,30**
МНК+ФГА 482,2±51,9 576,2±100,1 0,80
IL-4:
сыворотка 80,5±10,6 132,9±38,1 1,16
МНК спонтанная 90,9±13,6 74,9±7,6 1,09
МНК+ФГА 65,8±4,5 72,8±9,0 0,62
IL-10:
сыворотка 5,07±1,8 4,6±0,8 0,25
МНК спонтанная 1,9±0,5 2,7±0,9 0,82
МНК+ФГА 2,2±0,4 2,6±1,5 0,56
Примечание. Здесь и в табл. 2-4: t - критерий Стьюдента; достоверные различия: * - прир < 0,05; ** - прир < 0,01.
Материал и методы. В проспективное исследование включено 48 женщин, проживающих в Республике Адыгея. Неродственные здоровые лица (п = 17) подобраны эмпирически без клинических проявлений и наследственной отягощенности по онкопатологии. Онкологических больных (п = 31) с гистологически верифицированными диагнозами рака молочной железы (РМЖ; п = 25), тела (п = 5) и шейки (п = 1) матки I-IV стадии обследовали после оперативных вмешательств. В зависимости от стадии заболевания по международной системе TNM (UICC, 2009) пациенток распределили на две группы с медленным (I-Па) и быстрым (IIb-IV) прогрессированием неоплазий [8].
МНК, выделенные из периферической крови с гепарином (25 ед/мл) на одноступенчатом градиенте фиколла (Histopaque, 1077, Sigma, США), после трехкратной отмывки средой 199 («ПанЭко», Москва) ресуспендировали в концентрации 2-106 кл/мл рабочей культуральной среды. Для исследования спонтанной и стимулированной т vitro ФГА (5 мкг/мл) продукции цитокинов МНК культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах в концентрации 2-106 кл/мл в течение 18 ч при 37оС и 5% CO2 в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицина (80 мкг/мл) и HEPES («ПанЭко», Москва). Образцы сыворотки получили из венозной крови, инкубированной в пробирках с Serum Clot Activator «VACCUETTE» (Австрия) и центрифугированной при 3000 об/мин (15 мин). Уровень цитокинов в сыворотках, супернатантах интактных и стимулированных МНК у здо-ровх лиц и больных определяли методом иммуноферментного анализа (ELISA) на коммерческих тест-системах «ООО Цитокин» (Санкт-Петербург). Статистически значимые различия (р < 0,05) вычисляли, используя параметрический t-критерий Стьюдента и коэффициента корреляции по Пирсону (r).
Результаты и обсуждение. Цитокиновые профили нативной сыворотки у здоровых лиц и онкологических больных по двум основным противовоспалительным цитокинам (IL-4 и IL-10) не превы-
Таблица 3
Концентрация IL-17A, IL-2, IL-4 и IL-10 в сыворотке при спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции МнК у больных при метастазировании опухолевого процесса в лимфатические узлы (M±m)
Цитокин Уровень цитокина (в пг/мл) t
Т.ЛЧ t1.4n1.3M„
IL-17A:
сыворотка 2423±310,6 2012±298,4 0,96
МНК спонтанная 30,9±30,9 345,8±344,9 0,91
МНК+ФГА 438,9±316,9 138,2±129,9 0,88
IL-2:
сыворотка 182,8±119,1 337,1±188,2 0,73
МНК спонтанная 498,8±101,4 999,6±320,7 1,75
МНК+ФГА 526,1±67,0 541,7±113,0 0,13
IL-4:
сыворотка 108,4±26,7 113,0±40,7 0,09
МНК спонтанная 87,4±10,7 74,3±9,3 0,89
МНК+ФГА 68,1±4,7 72,2±11,6 0,36
IL-10:
сыворотка 5,2±1,6 4,3±0,8 0,52
МНК спонтанная 2,3±0,6 3,3±0,9 0,92
МНК+ФГА 1,2±0,4 3,1±1,8 1,06
- 25 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
Таблица 4
Сывороточная концентрация, уровень спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-17A, IL-2, IL-4 и IL-10 МнК у больных рМЖ при медленно и быстропрогрессирующих неоплазиях (M±m)
Уровень цитокина (в пг/мл)
Цитокин медленное прогрессирование быстрое прогрессирование t
IL-17A:
сыворотка 2310±380,3 2157±265,9 0,34
МНК спонтанная 38,6±38,6 288,2±287,4 0,70
МНК+ФГА 403,4±385,2 212,0±138,3 0,54
IL-2:
сыворотка 33,5±19,5 485,7±174,1 2,66**
МНК спонтанная 315,1±87,5 1035,2±241,8 3,00**
МНК+ФГА 482,2±51,9 576,2±100,1 0,80
IL-4:
сыворотка 82,9±9,8 135,6±41,6 1,18
МНК спонтанная 100,8±12,2 64,5±7,9 2,93*
МНК+ФГА 68,5±4,9 71,0±9,7 0,22
IL-10:
сыворотка 3,5±0,7 5,8±1,5 1,25
МНК спонтанная 2,8±0,8 2,7±0,7 0,05
МНК+ФГА 1,5±0,4 2,57±1,5 0,59
шают физиологических значений (соответственно 0-100 и 0-9,1 пг/мл) и достоверно не отличаются у больных и здоровых лиц (табл. 1). Повышенный сывороточный уровень IL-2 в обследованных группах (р > 0,05) подтверждается в ряде работ [6-7]. Высокая концентрация IL-17A, выявленная как у здоровых лиц, так и у онкологических больных, не имеет аналогов в отечественных и зарубежных работах.
Спонтанная и стимулированная in vitro ФГА про-
дукция IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10 МНК в норме и при онкопатологии характеризуется определенными закономерностями. Интактные МНК у здоровых лиц и больных секретируют невысокую концентрацию IL-4, IL-10, IL-17A, которая при стимуляции ФГА может повышаться или снижаться (см. табл. 1). Спонтанная продукция IL-17A, IL-2, IL-10 МНК у онкологических больных в отличие от таковой у здоровых лиц достоверно снижена. Аналогичные закономерности прослеживаются при анализе стимулированной in vitro ФГА продукции IL-2, IL-10, но не IL-4, IL-17A (см. табл. 1).
Уровень IL-17A, IL-2, IL-4 и IL-10 в сыворотках, супернатантах интактных и стимулированных МНК у онкологических больных при высоко-, умеренно- и низкодифференцированных формах аденокарциномы в зависимости от вовлеченности регионарных лимфатических узлов в опухолевый процесс с учетом стадии заболевания по международной системе TNM (UICC, 2009) представлены в табл. 2-4.
В зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы статистически значимые различия по сывороточному уровню, спонтанной и стимулированной продукции медиаторов обнаружили только для IL-2 (t = 2,30; р < 0,01). При низкодифференцированной аденокарциноме по сравнению с высоко- и умеренно дифференцированными гистотипами отметили достоверное повышение спонтанной продукции IL-2 на фоне снижения уровня IL-4, оказывающего прямое антипролиферативное действие (см. табл. 2). Полученные экспериментальные данные подтверждают роль IL-2 в патогенезе неоплазий, так как он является ауто-кринным фактором регуляции роста опухолевых клеток при системном повышении его концентрации [1].
Метастазирование в регионарные лимфатические узлы у больных со ЗНО женских репродуктивных ор-
Таблица 5
Корреляционный анализ концентрации цитокинов в сыворотке и супернатантах МнК у больных со ЗнО женских репродуктивных органов
Показатель IL-2 IL-4 IL-10 IL-17A
сыворотка МНК МНК + ФГА сыворотка МНК МНК + ФГА сыворотка МНК МНК + ФГА сыворотка МНК
IL-2:
МНК спонтанная -0,11
МНК + ФГА -0,22 0,71**
IL-4:
сыворотка 0,30 0,22 0,37
МНК спонтанная 0,01 0,05 -0,2 -0,29
МНК + ФГА 0,35 -0,2 -0,28 -0,2 0,72**
IL-10:
сыворотка 0,54* -0,9 0,02 -0,18 -0,12 0,18
МНК спонтанная 0,39 -0,27 -0,49 -0,15 0,07 0,32 -0,14
МНК + ФГА -0,31 -0,29 -0,25 -0,26 0,35 0,52* 0,02 0,45*
IL-17A:
сыворотка -0,07 0,32 0,16 0,26 0,17 0,14 -0,06 -0,02 0,23
МНК спонтанная 0 0 0 -0,14 0,17 0,55* -0,02 -0,23 0,14 -0,06
МНК + ФГА -0,07 0,34 0,59* 0,54 0,52* 0,34 -0,11 -0,28 0,09 0,23 0,31
Примечание. Корреляция показателей значима: * - при р < 0,05; ** - прир < 0,01.
- 26 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
ганов не сопровождается повышением сывороточной концентрации IL-17A, IL-4 и IL-10, уровня их спонтанной и стимулированной продукции МНК. Тенденции к повышению содержания IL-2 в сыворотке и супернатантах МНК у больных с распространенными опухолевыми процессами требуют дальнейшего исследования и подтверждения на больших выборках больных. В зависимости от степени прогрессирования ЗНО установили статистически значимые различия по содержанию IL-2 и IL-4 в образцах биоматерилов. У больных ш ЗНО IIb—ГУ стадией (быстрое прогрессирование заболевания) отметили повышение (р < 0,05) содержания IL-2 в сыворотке (485,7 ± 174,1 пг/мл), супернатантах интактных МНК (1035,2 ± 241,8 пг/ мл) и снижение спонтанной продукции IL-4 МНК (t = 2,93; р < 0,05).
Положительные корреляционные связи выявили между сывороточным уровнем IL-2 и IL-10 (г = 0,54; p<0,05), стимулированной ФГА продукцией IL-2 и IL-17A (г = 0,59; p<0,05); концентрацией в супернатантах IL-4 и IL-17A (соответственно r = 0,55 и r = 0,52; p < 0,05), стимулированной продукцией IL-10 (г = 0,52; p < 0,05) (табл. 5).
Выводы. 1. Сывороточный уровень основных про-и противовоспалительных цитокинов IL-17A, IL-2, IL-4, IL-10 у онкологических больных и здоровых лиц не различается. В культуре МНК при неоплазиях снижена спонтанная продукция IL-17A, IL-2, IL-10.
2. Повышение сывороточной концентрации, уровня спонтанной продукции IL-2 в культуре МНК у онкологических больных ассоциировано с быстрым прогрессированием и вовлечением в опухолевый процесс регионарных лимфатических узлов.
3. При ЗНО женских репродуктивных органов выявили положительные корреляционные связи (г = 0,52-0,59) между сывороточным уровнем IL-2 и IL-10, стимулированной in vitro ФГА продукцией IL-2, IL-17A, IL-10; концентрацией IL-4 и iL-17A в супернатантах интактных МНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бережная Н.М. Роль клеток системы иммунитета в микроокружении опухоли. Онкология. 2009; 1: 6-17.
3. Витковский Ю. А., Кузник Б. И., Еделев Д. А., Солпов А. В. Влияние интелейкинов 4 и 10 на систему гемостаза in vitro. Иммунология. 2001; 1: 43-6.
7. Тугуз A.P., Анисимова Н.Ю., Вершинина М.Ю., Киселевский
М.В. Соотношение основных цитокинов в крови онкологических больных и здоровых доноров. Иммунология. 2003; 24 (3): 184-6.
REFERENCES
1. Berezhnaya N.M. The role of immune system cells in the tumor microenvironment. Oncologiya. 2009, 1: 6-17 (in Russian).
2. Zhu X., Mulcahy L., Mohammed R., Lee A., Franks H., Kilpatrick L. et al. IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages: IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines. Breast Cancer Res. 2008; 10: 1-11.
3. Vitkovskiy Yu.A., Kuznik B.I., Edelev D.A., Solpov A.V Effect inteleukins 4 and 10 on the hemostatic system in vitro. Immunologiya. 2001, 1: 43-6 (in Russian).
4. Gibson A.W., Edberg J.C., Wu J., Westendorp R.G., Huizinga
T.W., Kimberly R.P. Novel single nucleotide polymorphisms in the distal IL-10 promoter affect IL-10 production and enhance the risk of systemic lupus erythematosus. J Immunol. 2001; 166: 3915-22.
5. Turner D.M., Williams D.M, Sankaran D., Lazarus M., Sinnott P.J., Hutchinson I.V An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. Eur. J. Immunogenet. 1997; 24: 1-8.
6. Lyon D., Cain N., Walter J. Cytokine comparisons between women with breast cancer and women with a negative breast biopsy. Nurs. Res. 2008; 57 (1): 51-8.
7. TuguzA.P., Anisimova N.Yu., Vershinina M.Yu., KiselevskiyM.V The ratio of the major cytokines in the blood of cancer patients and healthy donors. Immunologiya. 2003, 24 (3): 184-6 (in Russian).
8. TNM. Classification of malignant tumours. Available at: http:// www.uicc.org/resources/tnm
Поступила 19.04.13
- 27 -
